Hipotermija, ki jo povzroča okskarbazepin po prehodni ishemiji prednjih možganov, izvaja terapevtsko nevroprotekcijo prek prehodnega receptorskega potenciala Vaniloid tipa 1 in 4 pri gerbilih, 3. del

4. Materiali in metode

4.1. Poskusne živali

Uporabljeni so bili samci gerbilov (skupno število=252) v starosti 6 mesecev (telesna teža 63–78 g). Gerbili so bili vzrejeni v Eksperimentalnem živalskem centru Nacionalne univerze Kangwon (Chuncheon, Koreja).

Gerbili so zelo ljubke male živali. Živijo v puščavskih območjih, dobri so pri kopanju jam in imajo močan instinkt za shranjevanje in iskanje hrane. Med temi malčki imajo samci gerbilov še posebej dober spomin, zaradi česar si ljudje želijo izvedeti njihove skrivnosti.

Prvič, ko samci gerbilov iščejo hrano, uporabijo vrsto signalov, kot so mejniki in teren, da določijo smer. Z dolgoletnim opazovanjem in prakso so vzpostavili svoj »geografski informacijski sistem«. Nasprotno pa imajo samice gerbilov slabši spomin na te signale, še posebej v nenehno spreminjajočem se okolju.

Drugič, samci gerbilov kažejo tudi močan spomin v boju z naravnimi sovražniki. Po mnenju znanstvenikov bodo gerbili, ko so ogroženi, hitro vstopili v brlog in poskušali pobegniti. Ko pa se soočijo z isto grožnjo, si bodo samci gerbilov zapomnili način napada naravnih sovražnikov in se jim izognili, kar poveča njihove možnosti za preživetje.

Končno se spomin samcev gerbilov skriva tudi v njihovem medsebojnem socialnem vedenju. Vsak gerbil ima svoj edinstven vonj. Ko srečata druge gerbile, bosta s svojim vohom prepoznala identiteto in status drug drugega. Ta spominska sposobnost gerbilom ne omogoča le vzpostavitve razmeroma stabilne družbene povezave, temveč je tudi pomembno jamstvo za njihovo razmnoževanje.

Če povzamemo, odnos med samci gerbilov in spominom je neločljiv. V procesu iskanja preživetja in razmnoževanja v naravi se zanašajo na svoj močan spomin, da se nenehno prilagajajo okolju in se izboljšujejo. Kot ljudje bi se morali učiti od teh malčkov in nenehno brusiti svoj spomin, da bi se bolje prilagajali temu nenehno spreminjajočemu se svetu. Vidi se, da moramo izboljšati svoj spomin, in Cistanche lahko bistveno izboljša spomin, saj lahko uravnava tudi ravnovesje nevrotransmiterjev, kot je povečanje ravni acetilholina in rastnih faktorjev, ki so zelo pomembni za spomin in učenje. Poleg tega lahko Cistanche izboljša pretok krvi in ​​spodbuja dostavo kisika, kar lahko zagotovi, da možgani dobijo dovolj hranil in energije, s čimer se izboljša vitalnost in vzdržljivost možganov.

Kliknite Know, da povečate moč pomnilnika

Za to študijo je eksperimentalni protokol (št. odobritve KW-200113-1; datum odobritve 18. februar 2020) odobril Institucionalni odbor za nego in uporabo živali.

Raziskovalni protokol se je držal smernic, predlaganih v "Trenutnih mednarodnih zakonih in politikah" Vodnika za nego in uporabo laboratorijskih živali, ki ga je objavil The National Academies Press (8. izdaja, 2011).

4.2. Eksperimentalne skupine, indukcija tFI ter zdravljenja HyT in OXC

Da bi dokazali zaščitne učinke OXC proti ishemični poškodbi po tFI pri gerbilih, so gerbile razdelili v šest skupin: (1) skupina navidezno+vehikel (n=24);(2) skupina tFI+vehicle (n {{5) }}); (3) skupina lažno+HyT (n=24); (4) skupina tFI+HyT (n=60); (5) skupina lažno+OXC (200 mg/kg) (n=24); in (6) skupina tFI+OXC (n=60).

Sedem in pet gerbilov v treh skupinah tFI je bilo uporabljenih za Western blot analizo in histološko preiskavo po 30 minutah, 12 urah, 1 dnevu, 2 dneh in 4 dneh po operaciji tFI, v treh lažnih skupinah pa sedem in pet gerbile so uporabili 30 minut in 4 dni po navidezni operaciji, da bi zmanjšali število. V tem poskusu je bil tFI razvit, kot je opisano prej [34].

Skratka, gerbile smo anestezirali z 2,5 % izofluranom (v 32 % kisika in 68 % dušikovega oksida). Pod anestezijo smo obe skupni karotidni arteriji izolirali iz karotidnega ovoja in zamašili s sponkami za anevrizmo (Yasargil FE 723K) (Aesculap, Tuttlingen, Nemčija). ) pet minut.

Popolna zaustavitev oskrbe možganov s krvjo je bila potrjena z opazovanjem arterijskega krvnega pretoka v obeh retinalnih arterijah (vejah notranjih karotidarterijev) z uporabo oftalmoskopa (HEINE K180®) podjetja Heine Optotechnik (Herrsching, Nemčija).

Telesno temperaturo pred in med operacijo v vseh skupinah smo nadzorovali pri normotermiji (37 ± 0,2 ◦C) s termometrično odejo. Po petih minutah okluzije so bile sponke odstranjene.

V tej študiji je bila opravljena navidezna operacija, tako da so bili podvrženi isti operaciji tFI brez okluzije skupnih karotidnih arterij. HyT v dveh skupinah navidezno+HyT in tFI+HyT je bil nadzorovan (podobno kot sprememba telesne temperature pri tFI+ skupina OXC) s šesturnim hlajenjem celega telesa z ledenim obkladkom.

Telesna temperatura dveh lažnih + OXC in tFI + OXC skupin je bila zabeležena šest ur po takojšnjem intraperitonealnem injiciranju 200 mg/kg OXC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) po operaciji tFI.

Odmerjanje OXC je bilo izbrano na podlagi prejšnje študije, ki je poročala, da 200 mg/kg OXC učinkovito ščiti pred celično smrtjo v možganih po [36]. Za beleženje spremembe telesne temperature je bila telesna temperatura izmerjena v rektumu vsako uro po tFI, čez 6 ur pri sobni temperaturi okolja (približno 22 ◦C).

Peščenke so prejele čas okrevanja štiri dni po tFI, ker piramidne celice, ki se nahajajo v hipokampalni regiji CA1, začnejo odmirati štiri dni po tFI [30,34,62].

4.3. SMA test

Test SMA je bil izveden za preučitev sprememb v hiperaktivnosti v vseh skupinah. Skratka, kot je opisano prej [63], je bil test SMA opravljen 1. dan po tFI, saj lokomotoraktivnost doseže najvišjo točko 1. dan po ishemični poškodbi po tFI.

Gerbilsi vseh skupin so bili dve uri prilagojeni na okolje in so bili nameščeni v odprto kletko (širina 44 cm; dolžina 44 cm; višina 30), pridobljeno od Ugo Basile SRL (Gemonio, Italija), v kateri sta dve vzporedni vodoravni infrardeči žarki 4 × 8 od tal so bili nameščeni eno uro. SMA je bil posnet z uporabo Photobeam Activity System-Home Cage podjetja San Diego Instruments (San Diego, CA, ZDA).

Gibanje (trajektorija in skupna prevožena razdalja) je bilo zaznano s prekinitvijo niza infrardečih žarkov, ki jih proizvajajo fotocelice.

SMA smo neprekinjeno spremljali eno uro, podatke pa zbrali z analizatorjem AMB podjetja IPC Electronics (Cumbria, Združeno kraljestvo).

Zbiranje podatkov se je začelo 15 minut po navajanju v kletki na prostem. Na koncu so bili dobljeni rezultati ovrednoteni kot razdalja (metri) gibanja v testnem obdobju (ena ura).

4.4. Testi kognitivnih funkcij

4.4.1. RAMT

Za primerjavo prostorskega spomina v vseh skupinah je bil RAMT izveden v skladu s prejšnjimi študijami [38,44]. Za ta test je bil uporabljen radialni 8-roki labirint podjetja Stoelting Co (Wood Dale, IL, ZDA).

Instrument labirinta je bil sestavljen iz osrednje ploščadi in osmih krakov (širina vsakega kraka 5 cm; višina 9 cm; dolžina 35 cm). Peščanke so trenirali enkrat na dan tri dni pred.

Namreč, peletna krma, pridobljena od DBL Co (Chungbuk, Koreja), je bila postavljena na končni del vsake roke in vsak gerbil je bil postavljen na osrednjo ploščad. Nato je gerbil iskal krmo.

Po navidezni operaciji ali operaciji tFI je bil pravi test izveden enkrat na dan štiri dni z začetkom en dan po operaciji.

Za analizo je bilo ovrednoteno število napak, pri čemer se je ena napaka pojavila vsakič, ko je gerbil vstopil v roko, ki je bila že obiskana. Preizkus je bil končan, ko je gerbil zaužil krmo.

4.4.2. PAT

Za primerjavo kratkoročnega spomina med skupinami je bil PAT izveden v skladu s prej opisanimi metodami [64,65] z nekaj spremembami. Skratka, gerbili so bili testirani z uporabo Gemini Avoidance System (GEM 392) podjetja San Diego Instruments (SanDiego, CA, ZDA), ki je sestavljen iz dveh (temnega in svetlega) predelkov, ki komunicirata med seboj prek navpično drsnih vrat.

Eksperimentalne seje so bile izvedene v dveh fazah: trening in dejanska testna seja, izvedena en dan pred in štiri dni po tFI ali navidezni operaciji.

Pravi test je bil opravljen 20 minut po vadbi z merjenjem časa zakasnitve (v sekundah) med bivanjem v temni sobi. Namreč, v vadbi je bil gerbil dovoljen, da eno minuto prosto raziskuje oba oddelka, medtem ko so bila vrata odprta. .

Potem, ko je gerbil šel v temni prostor, so se vrata zaprla in gerbil je prejel električni šok (0,5 mA) iz jeklene mreže na tleh za pet sekund.

V resnični preskusni seji, 4. dan po tFI, je bil gerbil postavljen v svetli predel in zabeležen je bil čas zakasnitve v svetlem predelu pred vstopom v temni prostor.

4.5. Western Blot analiza za TRPV1 in TRPV4

Da bi preučili nivoje izražanja TRPV1 in TRPV4 v hipokampusu CA1 gerbila, je bila izvedena tehnika Western blot v skladu s prej opisanimi metodami [66,67].

Na kratko, v skladu z določenim razporedom (30 min, 12 h, 1 dan, 2 dni in 4 dni po navidezni ali tFI operaciji) so gerbili (n=5 za vsako skupino) dobili anestezijo za evtanazijo z intraperitonealno injekcijo z 200 mg/kg natrijevega pentobarbitala (JW Pharm.Co., Ltd., Seul, Koreja).

Nato so njihove možgane pobrali in homogenizirali s 50 mM fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS, pH 7,4), ki je vsebovala 0.1 mM etilenglikol-bis (aminoetil eter)-N, N, N{{ 11}}, N0-tetraocetna kislina (EGTA) (pH 8.0), 10 mM etilendiamintetraocetna kislina (EDTA) (pH 8,0), 0,2 % Nonidet P{{17 }}, 15 mM natrijevega pirofosfata, 100 mM -glicerofosfata, 2 mM natrijevega ortovanadata, 50 mM NaF, 150 mM NaCl, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF) in 1 mM ditiotreitola (DTT).

Nato so bili vzorci centrifugirani in supernatanti so bili odvzeti za določitev ravni beljakovin z uporabo testnega kompleta Micro BCA podjetja Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, ZDA) z albuminom bovineserum podjetja Pierce Chemical Co (Rockford, IL, ZDA).

Alikvote, ki so vključevali 20 µg celotnega proteina, smo zavreli v polnilnem pufru, 150 mM Tris (pH 6,8), ki je vseboval 6 % natrijevega dodecil sulfata (SDS), 3 mM DTT, 0,3 % bromofenol modrega in 30 % glicerola.

Vzorce smo ločili z elektroforezo v 10 % SDS-poliakrilamidnem gelu (PAGE). Nato smo gele prenesli na nitrocelulozne membrane podjetja Pall Co (East Hills, NY, ZDA) pri 350 mA in 4 °C 90 minut.

Za blokiranje nespecifičnega obarvanja so bile membrane inkubirane v 5% razmaščenem mleku 60 minut pri sobni temperaturi. Nato so imunsko reagirali z vsakim primarnim protitelesom: zajčjim anti-TRPV1 (razredčenim 1:1000) (Abcam, Cambridge, Združeno kraljestvo), zajčjim anti-TRPV4 (razredčenim 1:1000) (Abcam) in zajčjim anti- - aktin (razredčen 1:2000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) pri 4 ◦C 7 ur.

Nato so reagirali z oslovskim anti-kunčjim IgG, konjugiranim s hrenovo peroksidazo (HRP) (razredčen 1:4500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ZDA) pri sobni temperaturi 1 uro.

Nazadnje je bil za izboljšanje vizualizacije uporabljen komplet za kemiluminiscenco na osnovi aluminola podjetja Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, ZDA).

Kot je opisano prej [68], so bili imunobloti TRPV1 in TRPV4 analizirani s programsko opremo Scion Image podjetja Scion Crop (Frederick, MD, ZDA). Trakovi so bili skenirani in izvedena je bila denzitometrična analiza. Raven beljakovin je bila normalizirana glede na ustrezno raven -aktina.

4.6. Priprava histoloških rezov

Za imunohistokemične in histopatološke preiskave so bili gerbili (n=7 za vsako skupino) žrtvovani v skladu z določenim urnikom (30 min, 12 h, 1 dan, 2 dni in 4 dni po tFI ali navidezni operaciji).

Kot je bilo že opisano [34], so bili gerbili globoko anestezirani z natrijevim pentobarbitalom (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Seul, Koreja). Pod anestezijo smo gerbile transkardialno splaknili z 0,1 M fosfatnim pufrom (pH 7,4) in fiksirali s 4% paraformaldehidom (v 0,1 M fosfatnem pufru, pH 7,4).

Nato so dobili njihove možgane in jih šest ur fiksirali z istim fiksativom. Nato so bila možganska tkiva razrezana (25 µm debeline koronarnih ravnin) v akriostatu (Leica, Wetzlar, Nemčija).

4.7. Histokemično barvanje z uporabo CV

Da bi preučili morfološke in nevronske poškodbe v hipokampusu vsake skupine, smo izvedli barvanje s kresil vijolično (CV), kot smo opisali prej [69]. Na kratko, krezil vijolični acetat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) je bil raztopljen pri 1.0 % (m/v) v destilirani vodi in ledocetni kislini (0).28 Tej raztopini smo dodali %). Odseki so bili obarvani in nameščeni s kanadskim balzamom (Kanto, Tokio, Japonska).

4.8. FJ B Barvanje

Opravljeno je bilo barvanje FJ B, da se preuči nevronska degeneracija (smrt ali izguba). V skladu z objavljenim postopkom [34] so bili pripravljeni možganski odseki namočeni v 1 % natrijevega hidroksida, takoj preneseni v 0.06 % kalijev permanganat in takoj reagirali z 0,0004 % Fluoro-Jade B (Histochem). , Jefferson, AR, ZDA).

Odseke smo na kratko oprali in dali na ogrevalno stekelce (približno 50 ◦C) za reakcijo s FJ B. Za oceno terapevtskega učinka OXC proti tFI smo prešteli število celic FJ B+ v regiji CA1 v skladu z metodo, objavljeno v [ 70].

Na kratko, digitalne slike celic FJ B+ so bile posnete iz petih odsekov na gerbil z uporabo epifluorescentnega mikroskopa (Carl Zeiss) (Oberkochen, Nemčija) pri valovni dolžini 450–490 nm. Celice so bile preštete v 250 µm2, kar je vključevalo SP, v središču regije CA1 z uporabo sistema za analizo slike (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, ZDA).

4.9. Imunohistokemija

Za raziskovanje sprememb v imunoreaktivnosti NeuN, TRPV1 in TRPV4 v regiji CA1 je bila izvedena splošna imunohistokemija. Na kratko, po objavljeni metodi [34] smo pripravljene možganske odseke inkubirali s primarnimi protitelesi-mišji anti-NeuN (razredčen, 1:1100) (Chemicon, Temecula, CA, ZDA), mišji anti-TRPV1 (razredčen, 1:500) (Abcam, Cambridge, UK) in zajčji anti-TRPV4 (razredčen, 1:500) (Abcam, Cambridge, UK).

Nato so bili ti inkubirani odseki inkubirani v ustreznih sekundarnih protitelesih (razredčenih, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, ZDA) in razviti z uporabo Vectastain ABC (razredčenih, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). , ZDA). Končno so imeli ti imunoreagirani odseki barvo po vizualizaciji s 3,3'-diaminobenzidinom.

Število celic NeuN+ smo prešteli, kot sledi. Digitalne slike NeuN + celic so bile zajete iz petih odsekov na gerbil s svetlobnim mikroskopom (AxioM1) (Carl Zeiss, Nemčija).

Celice smo prešteli na enak način kot število FJ B+celic. Za ovrednotenje gostote struktur TRPV1+ in TRPV4+ so bila uporabljena ustrezna območja v regiji CA1 v petih odsekih na žival. Slike struktur TRPV1+ in TRPV4+so bile posnete s svetlobnim mikroskopom AxioM1 (Carl Zeiss) (Nemčija).

Gostoti struktur TRPV{{0}} in TRPV4+so ovrednotili kot relativno optično gostoto (ROD). V ta namen so bile slike pretvorjene v srednjo sivo raven. ROD je bil predstavljen kot odstotek z uporabo programske opreme Adobe Photoshop (različica 8.0) in NIH Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, ZDA).

4.10. Statistična analiza

Podatke smo predstavili kot povprečje ± standardna napaka povprečja (SEM). Vse statistične analize so bile izvedene s pomočjo GraphPad Prism (različica 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, ZDA). Razlike v povprečjih med eksperimentalnimi skupinami so bile statistično analizirane z dvosmerno analizo variance (ANOVA) s post hocBonferronijevim testom večkratne primerjave, da bi pojasnili razlike, povezane s tFI, med vsemi skupinami. Statistična pomembnost je bila upoštevana pri p < 0. 05.

Avtorski prispevki: Konceptualizacija: M.-HW in T.-KL; Metodologija, J.-CL in DWK; programska oprema, H.-IK in MCS; Validacija, PNZ, IJK in JHP; Preiskava, J.-CL, H.-IK in M.CS; Data Curation, JHC, IJK in JHP; Pisanje – Priprava izvirnega osnutka, H.-IK in J.-CL; Pisanje-recenzija in urejanje, M.-HW; Nadzorništvo, S.-SL; Projektna administracija, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL in T.-KL Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.

Financiranje: To delo je podprl Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities forResearch (FOUR, 4220200913807), ki ga financira Korejska nacionalna raziskovalna fundacija (NRF), in Program za temeljne znanstvene raziskave prek Nacionalne raziskovalne fundacije Koreje (NRF) financira Ministrstvo za šolstvo (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Izjava institucionalnega nadzornega odbora: gerbili so bili vzrejeni v eksperimentalnem živalskem centru Nacionalne univerze Kangwon (Chuncheon, Koreja). Za to študijo je eksperimentalni protokol (št. odobritve, KW-200113-1; datum odobritve 18. februar 2020) odobril Institucionalni odbor za nego in uporabo živali.

Protokol raziskave je sledil smernicam, predlaganim v "Trenutnih mednarodnih zakonih in politikah" Vodnika za nego in uporabo laboratorijskih živali, ki ga je objavil The National Academies Press (8. izdaja, 2011).

Izjava o informiranem soglasju: Ni primerno.

Izjava o razpoložljivosti podatkov: podatki, predstavljeni v tej študiji, so na voljo na zahtevo ustreznega avtorja.

Zahvala: Avtorji cenijo Hyun Sook Kim in Seung Uk Lee za njuno tehnično pomoč pri tej študiji.

Nasprotje interesov: Avtorji so izjavili, da ni finančnega navzkrižja interesov.

Okrajšave

CA1: podpolje Cornu Ammonis 1; CNS, centralni živčni sistem; CV, kresil vijolična; DG, zobati girus; FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, hipotermija; NeuN, nevronska jedra; OXC, okskarbazepin; PAT, test pasivnega izogibanja; ROD, relativna optična gostota; SMA, spontana motorična aktivnost; SO, stratum oriens;SP, stratum pyramidal; SR, stratum radiatum; tFI, prehodna ishemija prednjih možganov; TRPV1, prehodni receptorski potencial vaniloid tipa 1.

Reference

1. Busto, R.; Dietrich, WD; Globus, MOJ; Valdes, I.; Scheinberg, P.; Ginsberg, MD Majhne razlike v intraishemični možganski temperaturi kritično določajo obseg ishemične nevronske poškodbe. J. Cereb. Pretok krvi Metab. 1987, 7, 729–738. [CrossRef][PubMed]

2. Maher, J.; Hachinski, V. Hipotermija kot možno zdravljenje cerebralne ishemije. Cerebrovasc. Brain Metab. Rev. 1993, 5,277–300.

3. Medicinska sestra, S.; Corbett, D. Nevrozaščita po več dneh blage hipotermije, povzročene z zdravili. J. Cereb. Pretok krvi Metab. 1996, 16,474–480. [CrossRef]

4. Fisher, M.; Feuerstein, G.; Howells, DW; Hurn, PD; Kent, TA; Savitz, SI; Lo, EH; Group, S. Posodobitev predkliničnih priporočil okrogle mize za terapijo kapi. Stroke 2009, 40, 2244–2250. [CrossRef]

5. Liu, L.; Yenari, MA Terapevtska hipotermija: nevroprotektivni mehanizmi. Spredaj. Biosci. 2007, 12, 816–825. [CrossRef]

6. Lyden, PD; Krieger, D.; Yenari, M.; Dietrich, WD Terapevtska hipotermija za akutno možgansko kap. Int. J. Stroke 2006, 1, 9–19. [CrossRef][PubMed]

7. Klassman, L. Terapevtska hipotermija pri akutni možganski kapi. J. Neurosci. Nurs. 2011, 43, 94–103. [CrossRef]

8. Groysman, LI; Emanuel, dipl. Kim-Tenser, MA; Sung, GY; Mack, WJ Terapevtska hipotermija pri akutni ishemični kapi. Neurosurg. Focus 2011, 30, E17. [CrossRef] [PubMed]

9. Schwab, S.; Georgiadis, D.; Berrouschot, J.; Schellinger, PD; Graffagnino, C.; Mayer, SA Izvedljivost in varnost zmerne hipotermije po masivnem hemisferičnem infarktu. Možganska kap 2001, 32, 2033–2035. [CrossRef]

10. Katz, LM; Young, AS; Frank, JE; Wang, Y.; Park, K. Regulirana hipotermija zmanjša oksidativni stres možganov po hipoksični ishemiji. Brain Res. 2004, 1017, 85–91. [CrossRef]

11. Liu, K.; Khan, H.; Geng, X.; Zhang, J.; Ding, Y. Farmakološka hipotermija: potencial za prihodnjo terapijo možganske kapi? Nevrol. Res.2016, 38, 478–490. [CrossRef]

12. Ma, J.; Wang, Y.; Wang, Z.; Li, H.; Wang, Z.; Chen, G. Nevroprotektivni učinki terapevtske hipotermije, povzročene z zdravili, pri boleznih centralnega živčnega sistema. Curr. Drug Targets 2017, 18, 1392–1398. [CrossRef]

13. Calabresi, P.; Cupini, LM; Centonze, D.; Pisani, F.; Bernardi, G. Antiepileptična zdravila kot možna nevroprotektivna strategija pri ishemiji možganov. Ann. Nevrol. 2003, 53, 693–702. [CrossRef]

14. Tanaka, T.; Litofsky, NS Antiepileptična zdravila pri pediatrični travmatski možganski poškodbi. Strokovnjak Rev. Neurother. 2016, 16, 1229–1234.[CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com