3D ledvični organoidi za prevajanje s klopi na posteljo

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Navin Gupta, et al

Povzetek

Ledvice so bistveni organi, ki filtrirajo kri, odstranjujejo urinske odpadke, hkrati pa ohranjajo homeostazo tekočine in elektrolitov. Trenutni konvencionalni raziskovalni modeli, kot so statične celične kulture in živalski modeli, ne zadoščajo za razumevanje zapletene človeške in vivo situacije ali nimajo prevodne vrednosti. Za pospešitevledvicaraziskave, so potrebna nova raziskovalna orodja. Nedavni razvoj je omogočil usmerjeno diferenciacijo induciranih pluripotentnih izvornih celic za generiranje organoidov ledvic.Ledvicaorganoidi so podobni človeški ledvici in vitro in jih je mogoče uporabiti v regenerativni medicini ter kot modele razvoja, toksičnosti in bolezni. Čeprav so trenutne študije pokazale veliko obetavnost, ostajajo izzivi, vključno z nezrelostjo, omejeno ponovljivostjo in pomanjkanjem perfuzibilnih vaskularnih sistemov in sistemov zbiralnih kanalov. Ta pregled daje pregled našega trenutnega razumevanja nefrogeneze, ki je omogočila nastajanje ledvičnih organoidov. Nato potencialne aplikacijeledvicarazpravljamo o organoidih, čemur sledijo prihodnje perspektive. Ta pregled predlaga, da bo napredek pri raziskavah ledvičnih organoidov olajšan z našim vedno večjim znanjem o nefrogenezi in združevanjem obetavnih tehnik, kot so modeli organov na čipu.

Ključne besede Ledvični organoid. Stebelna celica. Bioinženiring.Nefron

Kliknite tukaj za več informacij o zdravilu Cistanche za ledvice

Uvod

Ledvice so bistveni organi, ki filtrirajo kri za ustvarjanje presnovnih odpadkov, namenjenih izločanju z urinom. Ledvice imajo izjemno plastičnost pri prilagajanju sestave urina, usklajevanju vnosa z izločanjem za vzdrževanje homeostaze raztopljenih snovi in ​​ravnovesja tekočin. Ker so ledvice sesalcev neregenerativni organ, se izguba funkcionalnih enot ali nefronov sčasoma kopiči pri vseh posameznikih [1]. Sistemske bolezni z visoko prevalenco, in sicer hipertenzija in sladkorna bolezen, akutna z zdravili ali hemodinamsko povzročenaledvicapoškodba(AKI) in primarne ledvične bolezni so pogosti vzroki za hitro izgubo delovanja ledvic in so glavni vzroki za kronično ledvično bolezen (CKD) [2]. CKD je razdeljen na stopnje glede naledvica disfunkcija, ki povzroča motnje raztopljenih snovi in ​​neravnovesje tekočin, ki so odgovorni za obsežno obolevnost in umrljivost. V ZDA poročajo o razširjenosti CKD v 14 odstotkih [3], njeni letni stroški zdravljenja znašajo 120 milijard $ [4], negativno vplivajo na kakovost življenja [5] in v napredovalih fazah dosežejo vrhunec v končni fazi ledvične odpovedi ( ESRD), ki zahteva potrebo po nadomestnem ledvičnem zdravljenju (NRT). Obliki RRT vključujeta dializo in presaditev, pri čemer prva predstavlja 7 odstotkov proračuna Medicare [6], druga pa je omejena z dobavo ustreznih organov [7]. CKD in ESRD predstavljata veliko breme za zdravstvene vire in stroške ter za bolnike s temi boleznimi [8].

Za reševanje teh bremen so bile izvedene temeljne in translacijske raziskave na področjihledvica razvoj, testiranje nefrotoksičnosti, modeliranje bolezni in regenerativna medicina ledvic. Tradicionalna raziskovalna orodja sestavljajo celične kulture in vitro iz izoliranih primarnih ledvičnih celic in virusno transformiranih ovekovečenih celičnih linij ter živalski modeli in vivo. Čeprav so bili ti običajni modeli z določenim uspehom uporabljeni za preučevanje fiziologije in patologije ledvic, imajo prirojene omejitve, ki lahko prispevajo k slabemu prevodu laboratorijskih študij v klinično terapijo [9]. In vitro modeli so v veliki meri omejeni na analizo enoceličnih vrst, pri čemer zanemarjajo učinke medceličnih in okoljskih interakcij znotraj kompleksnega heterogenega tkiva, kot je ledvica. Čeprav so živalski modeli integrativni za telesne sisteme, so omejeni z razlikami med vrstami, kar ima za posledico nezveste zaključke, ki zahtevajo veliko časa in stroškov [10]. Nove metode eksperimentiranja s človeškimi celicami in tkivi so nujne za premagovanje omejitev tradicionalnih raziskovalnih tehnik [11].

Ker je nujnost mati inovacij, je napredek v protokolih, ki uporabljajo človeške pluripotentne izvorne celice (hPSC), ustvaril kompleksno tridimenzionalno, večcelično in organsko specifično tkivo, imenovano organoidi. Organoidi jeter, pljuč, srca, črevesja in ledvic omogočajo eksperimentiranje na človeških tkivih in vitro [12]. V teoriji se lahko tkiva, ki sestavljajo celotno človeško somo, razmnožujejo v velikem obsegu na podlagi hPSC, ki določajo značilnosti pluripotentnosti in samoobnavljanja. Dve vrsti hPSC sta izvorne celice človeškega zarodka (ESC) in pluripotentne matične celice, ki jih povzroči človek (iPSC). Leta 1998 so Thomson et al. prvi opisal generacijo linij ESC, pridobljenih iz človeških blastocist. Da bi se izognili polemiki v zvezi z embrionalnim izvorom ESC, so leta 2006 Takahashi et al. opisal revolucionarno metodo za induciranje pluripotentnosti v terminalno diferenciranih somatskih celicah. Te celice, imenovane iPSC, nastanejo s transkripcijsko aktivacijo faktorjev Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc) [13]. Poleg izogibanja etičnim vprašanjem iPSC-ji poleg tega omogočajo pristope prilagojene medicine. iPSC predstavljajo neomejeno količino celic, ki so izogene njihovi starševski somatski celici [13]. Pacient-specifični iPSC-ji z ​​naravno prisotnimi mutacijami se lahko uporabijo za ustvarjanje klinično pomembnih modelov bolezni v človeškem tkivu, zlasti v pogojih, za katere ni živalskega modela. V modelih dednih bolezni lahko kontrole, popravljene z genomom, vzpostavijo neposredno povezavo med genotipom in fenotipom [14]. Pristopi imunokompetentne regenerativne medicine lahko uporabljajo množično tkivo, specifično za organe, ustvarjeno iz bolnikovih iPSC, s čimer zanikajo potrebo po imunosupresiji in zaobidejo pomanjkanje organov za presajanje [15]. Izkoriščanje translacijske uporabnosti hPSC, zlasti iPSC, lahko revolucionira področja razvoja zdravil in presajanja organov, kar vodi do dramatičnih rezultatov za zdravje ljudi in bolezni.

Sposobnost hPSC, da rekonstituirajo vse celice v telesu, predstavlja velik izziv, natančneje, kako nadzorovati diferenciacijo proti specifičnim vrstam celic in tkiv, ki nas zanimajo. Organogeneza pri sesalcih služi kot arhetip za usmerjeno diferenciacijo, učinkovito zaporedno indukcijo vmesnih tipov celic, ki se pojavijo med razvojem organov [16]. Nasprotno pa neposredno reprogramiranje vključuje indukcijo transkripcijskih faktorjev, specifičnih za tip celice, ki obidejo vmesne tipe celic med pretvorbo somatske celice v določeno ciljno populacijo. Medtem ko ima koristi od enostavnejše metodologije, neposredno reprogramiranje pogosto povzroči nepopolno pretvorbo v ciljno celico zaradi profila metilacije DNA in epigenetike starševske celice [17]. Tudi če bi prišlo do neposrednega reprogramiranja s popolno pretvorbo, bo rezultat verjetno enotna celična populacija [18]. V zvezi z ledvicami več kot ducat različnih tipov celic prispeva k strukturi in delovanju nefrona in vivo. Rekonstitucija nefrona bi zahtevala neposredno reprogramiranje v skupnega prednika vseh sodelujočih vrst celic, in sicer matičnih celic nefrona, endotelijskih matičnih celic in stromalnih matičnih celic [19]. Potreben pristop k razvoju tkiva, podobnega izvorni ledvici, je usmerjena diferenciacija, metoda, ki temelji na poglobljenem poznavanju razvoja ledvic. V tem pregledu poudarjamo bistveno vlogo, ki jo je imela razvojna biologija ledvic pri ustvarjanju ledvičnih organoidov, pridobljenih iz hPSC, na kratko komentiramo aplikacije organoidne tehnologije ledvic in razpravljamo o prihodnjih smereh, ki obravnavajo sedanje omejitve in izzive kliničnega prevajanja.

Razvoj ledvic

Razvoj ledvic služi kot zlati standard za usmerjeno diferenciacijo, da se proizvede in vitro tkivo, ki je biološko najbolj podobno svojemu in vivo dvojniku. Desetletja razvojnih študij na modelih sesalcev so pokazala, da poti Wnt, FGF, retinojska kislina in TGF-/BMP urejajo morfogenezo, oblikovanje tkivnih vzorcev in indukcijo začetkov organov [12]. Te poti so ključnega pomena za ponavljajoči se razvoj tkiv v treh zarodnih plasteh, vključno z ledvico, ki izvira iz mezoderma. Mezoderm, stisnjen med endodermalno in ektodermalno plastjo, je oblikovan z gastrulacijo hPSC (sprednji epiblasti) skozi primitivno progo, prehodno strukturo, ki definira anteriorno-posteriorno in medialno-lateralno os razvijajočega se zarodka [12]. Anteriorno-posteriorna os mezoderma je določena s trajanjem involucije skozi primitivno progo s časovno izpostavljenostjo signalizaciji Wnt, saj hPSC, ki se involucirajo skozi primitivno progo, migrirajo spredaj, da na začetku prispevajo k sprednjim strukturam, nato pa se polnijo posteriorno [1]. Medialno-lateralna os mezoderma je določena z rostrokavdalnim gradientom BMP v primitivni črti, ko hPSC, ki so podvrženi gastrulaciji skozi rostralno primitivno progo (nizka aktivnost BMP), postanejo paraksialni mezoderm, skozi sredinsko primitivno progo (zmerna aktivnost BMP) postanejo vmesni mezoderm (IM) in skozi kavdalni primitivni trak (visoka aktivnost BMP) postane mezoderm lateralne plošče [20, 21]. V primitivni progi sta trajanje signala Wnt in stopnja signala BMP glavni determinanti oblikovanja vzorcev v mezodermalni zarodni plasti.

V razvoju ledvic pri sesalcih obstajajo 3 nefrične stopnje, pronefros, mezonefros in metanefros, ki vse izhajajo iz mezoderma. Študije na miših so pokazale, da metanefros, ki obstaja kot odrasla ledvica, izhaja iz vzajemne indukcije dveh tkiv, ki izhajata iz IM, metanefričnega mezenhima (MM) in sečničnega popka (UB) [22]. MM je sestavljen iz nefronskih progenitornih celic (NPC), prepredenih s stromalnimi celicami, medtem ko se UB tvori kot ostanek, ki izstopa iz Wolffijevega voda, degenerativne strukture, ki odvaja primitivne mezonefrose v kloako [23]. Koncentrirani NPC mezenhima kapice MM so podvrženi progresivni morfogenezi od teles v obliki vejice do teles v obliki črke S, ki se segmentno diferencirajo v sosednje epitelne strukture, ki sestavljajo nefron, in sicer podocite, proksimalne tubule, Henlejevo zanko, distalne tubule in povezovalne tubule [ 24–27]. Povezovalni tubuli posameznih nefronov se združijo v razvejan zbiralni sistem, ki izhaja iz UB, po recipročni indukciji med obema tkivoma [28]. Signalizacija Wnt, ki izhaja iz UB, katalizira prehod iz mezenhima v epitel (MET) NPC-jev v epitelij nefrona [29], medtem ko signali GDNF, ki izhajajo iz MM, prek kompleksa Ret/GFRA1 urejajo morfogenezo razvejanja [30] (slika 1).

Slika 1 Razvoj človeške ledvice od primitivne žile do zrelega nefrona. [1] Primitivni trak (PS) povzroči nastanek mezoderma in nato vmesnega mezoderma (IM), iz katerega je med zgodnjo gastrulacijo mogoče ločiti posteriorni IM (PIM) in sprednji IM (aIM). [2] Metanefrični mezenhim (MM), ki vključuje matične celice nefrona (NPC) in stromalne celice, se oblikuje iz PIM, medtem ko aIM tvori Wolffijev kanal, iz katerega se razvije ureterični popek (UB). UB se začne razvejati z NPC, stromalnimi matičnimi celicami (SPC) in endotelijskimi matičnimi celicami (EPC). Na tej stopnji se vaskulatura ne infiltrira v populacije NPC. [3] Nato NPC razvijejo ledvične vezikle, ki tvorijo telo v obliki vejice, ki mu sledi telo v obliki črke S. Sčasoma se ta struktura poveže z UB in postane zrel nefron. Kri se filtrira v glomerulu (sivo), ki premika ultrafiltrat v zbiralni tubul (rumen) skozi proksimalni tubul (oranžen), Henlejevo zanko (moder) in distalni tubul (zelen). Podani so markerji, ki ustrezajo vsaki strukturi.

Velik preboj v našem razumevanju razvoja ledvic se je zgodil leta 2014, ko so Taguchi et al. je nepričakovano odkril, da se predhodniki T plus MM razvojno razlikujejo od prednikov Osr1 plus UB [31], pri čemer so uporabili tehnike sledenja rodu, pri čemer so ugotovili, da je prejšnje delo nakazovalo skupno poreklo v Osr1 plus IM brez nadaljnje razmejitve [22]. V zgoraj omenjeni študiji je bila uporabljena miška Osr1-GFP, da bi ugotovili, da se Osr1 izraža ob različnih časih in na različnih lokacijah v nefričnem območju IM. S histološko analizo in razvrščanjem/ponovnim združevanjem celic OSR1-GFP plus na različnih razvojnih stopnjah so avtorji lahko dokazali, da anteriorni IM prispeva k mezonefrosu, mezonefričnemu vodu (Wolffijev kanal) in ureteričnemu popku (izstop iz Wolffijev kanal), medtem ko posteriorni IM vsebuje Six2 plus Sall1 plus NPC MM, ki se diferencirajo v epitelijske celice nefrona. Ugotovitev, da MM izhaja iz posteriornega IM, UB pa iz sprednjega IM, skupaj z izražanjem značilnega markerja zagotavlja načrt za specifično indukcijo ledvično specifičnih linij in je omogočila protokole usmerjene diferenciacije za učinkovito induciranje nefrona, pridobljenega iz MM epitelija brez kontaminacije drugih derivatov IM. Pomembno je, da so zgodovinske študije domnevale, da razvoj mišjih ledvic odraža človeško nefrogenezo. S primerjavo razvoja človeških in mišjih ledvic so nedavne študije razjasnile konvergentne in divergentne lastnosti, vključno s tvorbo režnjev, organizacijo progenitornih niš in izražanjem domnevnih označevalcev, ki opredeljujejo tip celic [32]. V takih študijah so bili podatki o človeških ledvicah pridobljeni iz posmrtnega embrionalnega tkiva, kar je omogočilo vpogled v nasprotju z eksperimentiranjem. Pojav ledvičnih organoidov, pridobljenih iz hPSC, omogoča hipoteze, ki jih je mogoče preveriti pri razvoju človeških ledvic, med translacijskimi aplikacijami.

3D organoidi ledvic

Nedavni razvoj je omogočil tvorbo ledvičnih organoidov iz pluripotentnih matičnih celic, ki jih povzroči človek (hiPCS) z usmerjeno diferenciacijo [33], kar je ustvarilo novo translacijsko platformo za razvoj zdravil in tehnike regenerativne medicine. Organoidi so mini in vitro organi, ki se sami organizirajo iz (matičnih) celic v 3D mikrookoljih. Kažejo veliko podobnosti s svojimi in vivo primerki v smislu morfologije tkiva, števila celic, proliferacije in diferenciacije [34].

Po razmejitvi različnih izvorov MM in UB med razvojem ledvic pri sesalcih in delovanju nazaj v postopnem pristopu za identifikacijo vmesnih stopenj in njihovega značilnega izražanja markerjev, Taguchi et al. vzpostavil protokole usmerjene diferenciacije za MM v mišjih in človeških PSC [31]. Natančneje, embrioidna telesa, oblikovana iz OCT3/4 plus SOX2 plus hPSC, so bila podvržena razširjeni signalizaciji Wnt in BMP4, da inducirajo T plus CDX2 plus nastajajočo mezodermo, ki je namenjena prispevanju k celicam posteriorne nastajajoče mezoderme. Medialno-lateralna os mezoderma je bila usmerjena proti WT1 plus HOXD11 plus OSR1 plus posteriorni IM s sočasnim zdravljenjem z BMP4, aktivinom in retinojsko kislino. Nato sta bila uporabljena nizka Wnt in FGF9 za podporo razvoju OSR1 plus SIX2 plus SALL1 plus WT1 plus NPC, s poročano indukcijsko učinkovitostjo ~62 odstotkov. Medtem ko so bili NPC ustvarjeni iz mišjih in človeških PSC, je bila sokultura z mišjim embrionalnim hrbtenjačem potrebna za njihovo nadaljnje razlikovanje v proksimalne tubule, distalne tubule in grozde podocitov.

Z uporabo hESC in hiPSC v enoslojni kulturi so Morizane et al. opisal protokol usmerjene diferenciacije, ki je induciral SIX2 plus SALL1 plus WT1 plus NPC z do 90-odstotno učinkovitostjo do dneva diferenciacije 8–9. Na kratko, razširjeno signaliziranje Wnt je povzročilo pozno primitivno črto, ki je bila podvržena aktivinu, da se je oblikoval PIM, ki se je diferenciral v NPC kot odziv na FGF9. NPC-je so nato agregirali v tridimenzionalni suspenzijski kulturi s centrifugiranjem, podvrženi prehodnemu impulzu CHIR99021 (CHIR) za simulacijo signalizacije Wnt, pridobljene iz UB, za kataliziranje MET v NPC-jih, in še naprej podvrženi FGF9 za razširitev in ohranitev stebla NPC-jev. NPC niša [35]. Po impulzu CHIR je MM prešel v PAX8 plus LHX1 plus peritubularni agregat, ki se je nadalje diferenciral v LAM1 plus ledvični mehurček do 14. dne diferenciacije. strukture, sestavljene iz sosednjih epitelijev, ki nosijo več markerjev za vsakega od podocitov (NPHS1 plus PODXL plus), proksimalnih tubulov (LTL plus), Henlejeve zanke (CDH1 plus UMOD plus), distalnih tubulov (CDH1 plus UMOD−) in povezovalnih tubulov ( CDH1 plus AQP2 plus ) [36].

Freedman et al. so uporabili drugačen pristop za ustvarjanje poenostavljenega protokola za pridobivanje ledvičnih organoidov. Tukaj so avtorji uporabili metodo sendvič Matrigel, da bi zagotovili 3D mikrookolje za hPSC, da bi oblikovali sferoide, ki obkrožajo votle amnijske votline [37]. Z usmerjeno diferenciacijo so ti sferoidi stimulirani, da postanejo organoidi ledvic z dvostopenjskim protokolom. Oblikovane sferoide smo 1,5 dni obdelali s CHIR, čemur je sledila izpostavljenost medijem z dodatkom B{6}}. Na 10. dan so po prehodu iz mezenhima v epitel nastali zviti, prosojni, cevasti organoidi. Takato idr. so identificirali razvojne značilnosti tako zbiralnega kanala kot progenitorjev mezenhima ledvic [38]. Tu so avtorji uporabili te informacije za induciranje metanefričnega (v primerjavi z mezonefričnim) mezenhima in uretičnega epitelija s 4 dnevi izpostavljenosti CHIR, ki ji je sledila 3 dni izpostavljenosti FGF9. Agregate smo nato gojili 20 dni, kar je omogočilo nastanek organoidov, ki so ustrezali ledvicam v prvem trimesečju. Avtorji so trdili o prisotnosti zbirnega kanala s prisotnostjo markerjev GATA3 in ECAD. Vendar je bilo to pozneje ocenjeno kot nezanesljivo, saj lahko distalni in zbiralni tubuli, ki izhajajo iz MM, izražajo tudi te markerje [39, 40] (slika 2).

Slika 2 Protokoli usmerjene diferenciacije za ustvarjanje pluripotentnih ledvičnih organoidov, ki jih povzroči človek. Vizualizirane so podobnosti in razlike med štirimi protokoli za ustvarjanje organoidov človeških ledvic. Vsak vizualizirani protokol vključuje časovni okvir v dnevih, stopnjo razvoja organoidov in dopolnjene dejavnike za spodbujanje usmerjene diferenciacije in zorenja organoidov. Protokoli Taguchi et al. in Takasato et al. povzročil organoide na membranah Transwell. Morizane et al. omogočili generiranje ledvičnih organoidov v 96-ploščah z jamicami in Freedman et al. v pristopu Matrigel sendvič

Potem ko so bili zgornji štirje diferenciacijski protokoli objavljeni leta 2015, je več skupin sledilo podobnemu pristopu za zaporedno pretvorbo hPSC v pozno primitivno črto, PIM, MM, peritubularni agregat, ledvične mešičke in končno ledvične organoide [41–44]. Wu et al. izvedli enocelično transkriptomijo kot primerjalno analizo med protokoloma Morizane in Takasato, tako drug proti drugemu kot proti ledvicam človeškega ploda (16 tednov nosečnosti) in ledvicam odraslega človeka (62-letni moški z normalnimledvicafunkcijo). Pri vrednotenju v statičnih pogojih na dan diferenciacije sta oba protokola ustvarila nezrelo tkivo, pri čemer je vsak izražal približno 20 odstotkov transkripcijskih faktorjev proksimalnih tubulov in podocitov odraslih [41]. Vendar pa Tran et al. uporabil enocelično transkriptomiko na ledvičnih organoidih, razvitih s protokolom Morizane za podporo uporabe podocitov, pridobljenih iz organoidov, za modeliranje bolezni in obnovo filtracijske funkcije. Podociti iz organoidov so si pri presaditvi delili zelo podobne, progresivne transkripcijske profile z ledvicami človeških plodov in rekrutirano gostiteljsko vaskulaturo, da bi spodbudili nadaljnje zorenje [42]. Garreta idr. ugotovili, da je bil transkripcijski profil ledvičnih organoidov razširjen na profil ledvic človeških plodov v drugem trimesečju do 16. dne diferenciacije z uporabo mehkega hidrogela za podaljšanje trajanja 3D mikrookolja za olajšanje interakcij med celicami in celičnim matriksom [44] . Po podobnem protokolu diferenciacije so Low et al. opravili enocelično sekvenciranje RNA (RNAseq), ki je identificiralo podmnožico matičnih celic nefrona kot potencialni vir ledvične vaskulature, kar se razlikuje od študij razvoja miši, ki dokazujejo vir kot FLK1 in endotelne matične celice, ki se razlikujejo od NPC-jev MM [45] in delno izhajajo iz stromalnih matičnih celic FOXD1 [46]. Vendar pa so druge pomembne ugotovitve vključevale, da signalizacija Wnt uravnava vaskularizacijo in delež proksimalnih v primerjavi z distalnimi segmenti nefrona, funkcionalno zorenje organoidov po implantaciji in modeliranje avtosomno recesivne policistične bolezni ledvic (ARPKD) z uporabo iPSC, pridobljenih s strani bolnikov [43].

Translacijska uporabnost ledvičnih organoidov

Na splošno so trenutni raziskovalni modeli za preučevanje bolezni ali spojin pogosto omejeni na celične študije in živalske modele. Celični modeli so enostavni za uporabo in jih je mogoče uporabiti v velikem številu. Vendar te pogosto vključujejo enocelične linije in ne morejo razumeti kompleksnosti človeških in vivo ledvic, kot je 3D mikrookolje in več prisotnih celic. Zato celični modeli ne morejo posnemati in vivo 3D morfologije tkiva ter heterogenega in kompleksnega mikrookolja. Da bi pojasnili kompleksno okolje in vivo, so bili živalski modeli, kot so miši, običajen raziskovalni model. Vendar pa so ti modeli slabo prevedljivi na človeške pogoje [47, 48]. Prav tako se povečujejo etični pomisleki glede uporabe živali v raziskovalne namene [49, 50]

Zato so potrebni novi modeli, ki lahko natančneje posnemajo človeško situacijo in vivo [51].

Organoidi lahko premagajo te omejitve zaradi svoje edinstvene sposobnosti posnemanja in vivo situacije ljudi. In ker so organoidi pridobljeni iz hiPSC, jih je mogoče uporabiti tudi za personalizirano medicino. Na primer, določene (kombinacije) spojin je mogoče testirati z organoidi, pridobljenimi iz celic določene osebe, da se preveri toksičnost ali učinkovitost. Možne so tudi aplikacije v večjem obsegu. Na primer, organoide je mogoče uporabiti kot predklinične modele za določanje značilnosti določenih spojin. Poleg tega se lahko v kliničnih preskušanjih uporabijo zanesljivi modeli bolezni pri ljudeh, da se pospeši razvoj zdravljenja posebej redkih bolezni, za katere je malo bolnikov.

Čeprav je za ustvarjanje popolnoma delujočih ledvic in vitro potrebnih več napredkov, dosedanje študije veliko obetajo. Nekatere študije so že pokazale uporabo ledvičnih organoidov, kot so danes. Ta napredek v ledvičnih organoidih omogoča (prihodnjo) uporabo za regenerativno medicino in kot modele razvoja, toksičnosti in bolezni. Med temi translacijskimi aplikacijami se organoidi obravnavajo tudi kot možne metode za uporabo regenerativne medicine za ustvarjanje bioinženirskih ledvic za uvedbo alternativnih terapij dializi in presaditvi ledvic (slika 3). Ker številni pregledi poročajo o objavljenih translacijskih aplikacijah ledvičnih organoidov [1, 52–59], se ta pregled osredotoča na prihodnjo generacijo ledvičnega tkiva, pridobljenega iz izvornih celic, ki je histološko biološko podobno naravni človeški ledvici, da bi olajšali prevod raziskav ledvičnih organoidov vplivati ​​na klinično oskrbo.

Trenutni izzivi in ​​prihodnje perspektive

Ledvice so visoko vaskulariziran organ, ki skupno prejme 20 odstotkov minutnega volumna srca in filtrira do 180 l krvi na dan [60]. Devetnajst kilometrov glomerularnih kapilar s površino ~ 6000 cm2 prispeva k glomerulni filtracijski pregradi (GFB) [61]. Sestavine GFB so fenestrirane glomerularne kapilare, negativno nabita glomerularna bazalna membrana in podociti, ki imajo razrezane diafragme med stopalnimi procesi [61]. Struktura GFB povzroči njegovo funkcijo, filtracijo krvi, ki temelji na velikosti in naboju raztopljenih snovi. Primitivni urin, ki nastane pri glomerulni filtraciji, vstopi v tubule nefrona, kjer se predela z absorpcijskimi in sekretornimi mehanizmi. Od do 180 l filtrata se ~ 99 odstotkov absorbira, le 1–2 l pa sta namenjena izločanju z urinom v normalnih pogojih. Glede na znatno resorpcijo volumna v peritubularnih kapilarah ni presenetljivo, da več nefronov odteče v skupne zbiralne kanale, ki se združijo v ledvični medenici in tvorijo samotne sečevode. Celotna struktura, od obsežne vaskularizacije proksimalnega nefrona do razširjene komunikacije tubularnega epitelija in peritubularnega kapilarnega korita do arborizirane drenaže distalnega nefrona, igra ključno vlogo pri delovanju ledvic. Ledvice ohranijo razmeroma potrebno funkcijo, tudi ko se zmogljivost zmanjša na 20 odstotkov, pri čemer veliko teh bolnikov ostane asimptomatskih. Vendar pa znižanje pod 15 odstotkov pogosto pomeni potrebo po RRT [62, 63]. NPC z regenerativnimi sposobnostmi se pri ljudeh izgubijo pred rojstvom, zato se nefroni ne morejo obnoviti. Trenutno ni na voljo nobenih terapij za obnovitev izgubljene ledvične funkcije, zato obstaja veliko povpraševanje po aplikacijah regenerativne medicine. Poleg tega je GFB potreben za modeliranje bolezni, ki vplivajo na filtracijo, funkcionalni tubularni transport, potreben za široko paleto testiranj toksičnosti in modeliranje bolezni, ter kombinacijo nefronov, pridobljenih iz MM, z zbiralnimi kanali, pridobljenimi iz UB, potrebnih za modeliranje večine prirojenih anomalij ledvic. in urinarni trakt (CAKUT) [64]. Razvoj organizirane ledvične vaskulature in razvejanega zbiralnega sistema bi predstavljal pomembne translacijske skoke v tehnologiji organoidov ledvic.

Vaskularizacija ledvičnih organoidov

Vaskularizacija ledvic vključuje dva različna procesa: vaskulogenezo in angiogenezo [65]. Pri vaskulogenezi pride do sestavljanja vaskulature de novo, medtem ko angiogeneza vključuje razvejanje ali razširitev že obstoječih žil. Medsebojno delovanje med tema dvema procesoma med nefrogenezo ostaja neznano, vendar se lahko vaskulogene ledvične mikrožile pojavijo pred razvojem angiogene ledvične arterije [65]. Pri miših MM med invazijo uretičnega popka nima vaskulature, vendar do naslednjega dne razvije bogato kapilarno mrežo s kasnejšo tvorbo vaskulariziranih glomerulov. Slednjo realizirajo endotelne celice, ki vdrejo v žilno špranjo in tvorijo glomerule v fazi enojne kapilarne zanke [66–68]. Medtem vaskulogeni FLK1 in endotelne matične celice, vmešane v MM, prispevajo k bogati glomerularni kapilarni mreži [69]. Podobno kot pristopi usmerjene diferenciacije za oblikovanje MM ex vivo bi morala vaskularizacija ledvičnega tkiva, pridobljenega iz hPSC, slediti njegovemu embrionalnemu izvoru, da bi razvili vzorčeno, hierarhično ledvično vaskularno mrežo.

Ugotovljeno je bilo, da 3D ledvični organoidi, razviti iz začetnih protokolov za MM, pridobljen iz PIM, vsebujejo žilne celice; vendar so glomeruli ostali večinoma avaskularni in splošna številčnost krvnih žil je bila slaba v primerjavi z naravnim ledvičnim tkivom [70]. Pomembno je, da ti vaskulogeni sklopi krvnih žil posnemajo zgodnjo tvorbo mikrožil v razvojuledvicatkivo, ki se pojavi pred angiogeno invazijo ledvične arterije [65]. V svojem temeljnem delu so Taguchi et al. presadili svoj inducirani mišji MM v miši, z angiogeno vaskulaturo, ki izvira iz gostitelja, kar je povzročilo povečane glomerularne kapilare. Skupki WT1 plus podocitov so lokalizirani z žilami PECAM1 plus, za katere je bilo na slikanju ugotovljeno, da vsebujejo rdeče krvne celice gostitelja [31]. Podobna subkapsularna presaditev ledvičnih organoidov je bila ponovljena, kar dokazuje, da vaskulatura znotraj glomerulov organoidov vztrajno izhaja iz gostitelja in nastajanje zgodnje glomerularne bazalne membrane, ki jo sestavljajo fenestrirane endotelne celice in procesi stopala podocitov [71]. Pri subkutani presaditvi ledvičnih organoidov je bila ugotovljena majhna stopnja glomerulne filtracije, ki je temeljila na intracelularni detekciji sistemsko danih fluorescenčnih dekstranov v tubulih, ki so bili vzeti za označevanje privzema iz glomerulnega filtrata [72]; vendar ni mogoče izključiti apikalnega privzema, ki je omogočen zaradi pomanjkanja tesnih stikov skozi Bowmanovo kapsulo s proksimalnim tubulom, ali bazolateralnega privzema prek tubularnih fagocitnih mehanizmov [73]. Van den Berg et al., ki nadgrajujejo svoje delo, v katerem organoidi ledvic, presajeni pod ledvično kapsulo, postanejo vaskularizirani s strani gostitelja in pokažejo glomerularno in tubulno zorenje [71], van den Berg et al. razvil eleganten in vivo sistem, ki uporablja večfotonsko slikanje visoke ločljivosti za prikaz velikostno selektivnega glomerulnega sejanja [74]. Predvsem vaskularizirani glomeruli, oblikovani iz interspecies himernega tkiva, ne uspejo premagati omejitev, povezanih s stalno odvisnostjo od živalskih sistemov, vključno z razvojnimi in fiziološkimi razlikami med vrstami, znatno izgubo zaradi prilagojenih medicinskih pristopov, nizko prepustnostjo in visokimi stroški.

Vaskularizacija ledvičnih organoidov je bila dosežena in vitro s podobnimi rezultati, kot so poročali v poskusih s presaditvijo. Z združitvijo ledvičnih organoidov in tehnologij ledvic na čipu za povzetek fluidnega mikrookolja in vivo sta Homan in Gupta et al. ugotovili, da je fluidni strižni stres, uporabljen za vgrajene ledvične organoide na čipu, olajšal tvorbo perfuzibilnih žilnih mrež, razvitih iz širjenja in diferenciacije so-induciranih endotelijskih progenitornih celic. Poleg tega so avtorji dokazali povečano polarnost in zorenje tubularnih epitelijskih celic in podocitov, ki kažejo procese stopal, ki se dotikajo glomerularnih kapilar, da tvorijo primitivni GBM [70, 75]. Čeprav so bili ledvični organoidi superfuzirani, v nasprotju s pretokom, omejenim znotraj vaskulature, uporaba fluidnega strižnega stresa na celih organoidih simulira intersticijski tok, ki nastane zaradi premikov tekočine v predelih med reabsorpcijo ~ 99 odstotkov glomerularnega filtrata. Z drugimi besedami, ~ 99 odstotkov volumna v tubularnih lumnih se prenese čez intersticij in reabsorbirajo peritubularne kapilare in vivo. Medtem ko je bila perfuzibilna vaskulatura dokazana s fluorescenčnimi sondami, glomerulna filtracija ni bila podprta z zaznavanjem fluorescence v tubularnih lumnih zaradi uporabe kroglic s premerom 500 nm, medtem ko je povprečni premer fenestracij v glomerularnih kapilarah ~ 70 nm [ 76]. Predvsem vsa vaskulatura v sistemu izhaja iz organoidov ledvic brez angiogene invazije.

Metode za premagovanje sedanjih izzivov vključujejo povezovanje angiogenih vaskularnih mrež in vitro z vaskulogenimi organoidi ledvic, da se omogoči zorenje GBM s funkcionalno glomerulno filtracijo. Obstaja veliko verjetnih razlogov, zaradi katerih še ni prišlo do dokončne glomerulne filtracije pri pristopih ledvičnih organoidov na čipu, vključno s pomanjkanjem vzdolžnega eksperimentiranja, omejenim hidrostatičnim tlakom, ki se prenaša v glomerulnih kapilarah, nezrelostjo epitelija nefrona in možnostjo bistvenega kroženja dejavniki, ki pospešujejo razvoj ledvic zarodka. Prej so bile opisane neposredno perfuzijske angiogene vaskularne mreže in vitro, ki so sposobne podpreti debelo tkivo ali vdreti v vgrajene celične konstrukte na čipu [77, 78]. Takšna vaskulatura lahko anastomozira z mikrožilami, pridobljenimi iz organoidov, da omeji perfuzijo na žilni del, kar omogoči prenos znatnega hidrostatičnega tlaka na glomerularne kapilare. Druge omejitve je mogoče obravnavati z uporabo longitudinalnih študij, perfuzijo z embrionalnim serumom in uporabo optimalnih organoidov na dan diferenciacije (ki vplivajo na zrelost) v takih napravah. Če bi bilo angiogeno vaskularno omrežje sestavljeno iz človeških celic, bi se omejitve, povezane z razlikami med vrstami, izognile. Podobno bi uporaba krvnih žil, pridobljenih iz hPSC, kot je bilo opisano [79], olajšala pristope prilagojene medicine tako za razvoj zdravil kot za strategije regenerativne medicine.

Oblikovanje ureteričnih popkov

Proizvodnja glomerularnega ultrafiltrata ex vivo bi predstavljala pomembno odkritje za olajšanje translacijskih aplikacij ledvičnega tkiva, pridobljenega iz izvornih celic, vendar bi bil potreben zbiralni sistem za kasnejšo drenažo. Dihotomno razvejana mreža zbiralnih kanalov konvergira izločanje ~ 1 milijona nefronov posamezne ledvice v en sam sečevod [60]. Zbirni kanali ne samo prenašajo filtrat, temveč so vključeni tudi v reabsorpcijo vode in ravnotežje elektrolitov prek različnih prenašalcev in kanalov v različnih vrstah tubularnih epitelijskih celic. Zbirni kanali so produkt razvejane morfogeneze sečničnega popka, ki je pod nadzorom različnih molekularnih signalov, ki jih je mogoče uporabiti in vitro za posnemanje tega procesa, vključno s signalnimi potmi FGF, GDNF/RET in Wnt [68].

Študije razvoja ledvic z uporabo mikrodiseciranih mišjih MM in UB zagotavljajo pomemben vpogled v zgodnjo tvorbo tega, kar bo predstavljalo ledvico odraslega človeka. Neinduciran MM, ločen od epitelijskih struktur UB, preprečuje zorenje obeh tkiv. Vendar pa lahko kokultura MM in UB ex vivo rekonstituira mišjo ledvico, kar nakazuje, da imajo te populacije prekurzorjev ledvic samostojen program, ki zadostuje za spodbujanje organogeneze ledvic [80]. Z razvojnega vidika bo optimalna metoda za razvoj funkcionalnega ledvičnega tkiva iz hPSC in vitro verjetno vključevala ločeno indukcijo MM in UB z visoko učinkovitostjo in kokulturo dveh različnih populacij.

Prej opisani protokoli diferenciacije pretežno ustvarjajo MM, ki naj bi postal nefronske strukture. Usmerjena diferenciacija v smeri zbiranja kanalskih matičnih celic UB je bila prvič objavljena leta 2013, preden je Taguchi razmejil divergentni izvor IM MM in UB. Xia et al. pretvoril hPSC v mezodermalno predano tkivo z uporabo FGF2 in BMP4 za 2 dni, nato induciral matične celice UB z uporabo kombinacije aktivina, BMP2 in retinojske kisline za 2 dodatna dneva v dvostopenjskem protokolu diferenciacije [81, 82]. Progenitorne celice UB, pridobljene iz hPSC, so se v kombinaciji z embrionalno mišjo MM samosestavile v himerno tkivo med vrstami. Leta 2017 so Taguchi in sod. z analizo profilov izražanja genov med razvojem popka sečnice pri mišjih zarodkih. so vzpostavili protokol za vključitev tkiva MM in UB v organoide ledvic z uporabo mišjih ESC (mESC) [83]. Ta protokol je temeljil na FACS-razvrščanju CXCR4 plus KIT plus Wolffian duct progenitors. Sokultura prednikov Wolffijevih kanalov z MM, pridobljenimi iz mESC, je zahtevala prisotnost stromalnih predniških celic za tvorbo ponovno sestavljenih organoidov, ki so bili podvrženi organogenezi višjega reda, da so tvorili nefrone, povezane z razvejanim epitelijem sečnice. Končno ugotovitve niso bile ponovljene v MM in UB, pridobljenih iz hPSC, zaradi prezgodnjega prenehanja razvejanja UB, za kar so avtorji menili, da je lahko posledica pomanjkanja stromalne matične skupine [83]. Vzpostavitev usmerjene diferenciacije na stromalne prednike človeških ledvic in povečan dostop do primarnih ledvičnih tkiv človeškega ploda lahko razkrije vzrok poročane nepopolne morfogeneze razvejanja. Kljub temu lahko obstajajo omejitve v učinkovitosti indukcije zahtevane vrste celic, in sicer proliferirajočih celic Ret plus UB konice, ki so odgovorne za razvejanje in oblikovanje strukturne povezave s povezovalnimi tubuli distalnih nefronov [84].

Obstaja malo protokolov usmerjene diferenciacije hPSC proti UB in njenim derivatom, pri čemer objavljeni protokoli kažejo omejitve. Potrebni so izboljšani protokoli, da se omogoči dodajanje mreže zbiralnih kanalov, ki zajema celotne organoide ledvic, ki vsebujejo nefron. Podobno maksimiranju indukcijske učinkovitosti za NPC, ki temelji na ekspresiji SIX2, je maksimiranje indukcijske učinkovitosti za celice konice UB na podlagi Ret ekspresije ena takih strategij. V ta namen je potrebno razumevanje razvoja ledvic. Predvsem se UB oblikuje kot izboklina Wolffijevega voda (imenovanega mezonefrični kanal), ki nastane zaradi kavdalne migracije sprednjih celic IM navzdol po urogenitalnem sinusu do kloake, pri čemer opazimo, da so te celice med potjo podvržene MET. Zaobljen izvor UB predstavlja izziv za vzpostavitev robustnega protokola usmerjene diferenciacije. Vendar so mezenhimske celice, ki izražajo Ret in so prisotne v aIM, sposobne prispevati k UB [84], tako da 3-stopenjski protokol lahko pretvori hPSC v zgodnjo primitivno črto (1. korak), nato pa v aIM (2. korak) , nato Ret plus celice s konico UB (3. korak). Predvsem celični repozitorij konzorcija NIH ReBuilding a Kidney (RBK) vključuje linijo poročevalcev Ret

Zaključek

Ledvice so izjemen organ, ki med drugim uravnava homeostazo vode in elektrolitov v telesu. Neregulacija teh procesov lahko povzroči resne zdravstvene zaplete z velikim družbenim in ekonomskim bremenom. Z našim razumevanjem človeške nefrogeneze in vivo smo osvetlili ponovno kapitulacijo tega procesa in vitro. Trenutni napredek je omogočil generiranje organoidov ledvic, pridobljenih iz hiPSC. Ti organoidi ledvic so podobni človeški ledvici in zagotavljajo dodatne prednosti v primerjavi z običajnimi raziskovalnimi modeli. Uporaba ledvičnih organoidov vključuje regenerativno medicino ter modele razvoja, toksičnosti in bolezni. Kljub napredku v zadnjih letih ledvični organoidi zahtevajo izboljšane protokole in modifikacije za zorenje tkiva, perfuzibilno vaskulaturo in integracijo zbiralnega sistema. Nato morajo biti ti sistemi primerni za zagotavljanje dodatne vrednosti običajnim modelom raziskav celic in živali ali jih celo nadomestiti. Izboljšanje protokolov za generiranje organoidov z našim vedno večjim znanjem o razvoju ledvic, skupaj z uporabo tehnologije organov na čipu, lahko olajša in pospeši prevajanje 3D ledvičnih organoidov v klinično uporabo.

Od: '3D ledvični organoidi za prevajanje s klopi na posteljo' avtorNavin Gupta, et al

---J Mol Med (2021) 99:477–487