13-tedenska študija subkronične toksičnosti 2-(l-mentoksi)etanola pri podganah F344

Povzetek: 2-(l-Mentoksi)etanol je bil pogosto uporabljen kot aroma; vendar podatki o toksičnosti 2-(l-mentoksi)etanola ostajajo omejeni. Izvajali smo 13-tedensubkronična toksičnostštudija {{0}}(l-mentoksi)etanola pri samcih in samicah podgan F344 z odmerki 0, 15, 60 ali 250 mg/kg telesne teže (TM)/dan, ki so jih dajali peroralno z gavažo z koruzno olje kot nosilec. V nobeni skupini niso opazili pomembnih toksikoloških sprememb splošnega stanja, telesne teže ali vnosa hrane. Hematološka ocena je pokazalazmanjšan hemoglobin,hematokrit, povprečni korpuskularni volumen in povprečni korpuskularni hemoglobin ter povečano število trombocitov v skupini moških 250 mg/kg.Biokemija serumarazkrilapovišan skupni holesterolv skupini podganjih samcev in samic, ki so jemale 250 mg/kg, znižane trigliceride v skupini samic z odmerkom 250 mg/kg in povečane skupne beljakovine v skupini samcev z odmerkom 250 mg/kg, kar kaže na učinke nametabolizem lipidovinsinteza beljakovin. Za maso organov sta se povečali absolutna in relativna teža jeter in nadledvične žleze v skupini z 250 mg/kg obeh spolov oziroma skupini moških s 250 mg/kg. Histopatološka analiza je pokazalakronična nefropatijav skupinah moških 15 mg/kg ali več, s povečano absolutno in relativno težo ledvic ter povišanim serumskim kreatininom v skupinah moških 60 in 250 mg/kg. Vendar so bila v proksimalnih tubulih ugotovljena eozinofilna zrnca, ki vsebujejo 2u-globulin, kar kaže na 2u-globulinsko nefropatijo, specifično za podganje samce in brez toksikološkega pomena. Ti rezultati so pokazali, da je bila raven 2-(l-metoksi)etanola brez opaženih neželenih učinkov 60 mg/kg telesne mase/dan za oba spola. (DOI: 10.1293/tox.2020-0091; J Toxicol Pathol 2021; 34: 309–317)

Ključne besede: 2-(l-mentoksi)etanol, 2-l-mentoksietanol, aditiv za živila, aroma, podgana Fischer, mentol

Cistanche dodatek za podporo ledvične funkcije PhGs75% Ech 30% Act 12%

Uvod

{{0}}(l-Mentoksi)etanol (št. CAS 38618-23-4) je bistra in brezbarvna tekočina z značilnim vonjem in se pogosto uporablja kot aroma. Skupni strokovni odbor FAO/WHO za aditive za živila (JECFA) je ocenil 2-(l-mentoksi)etanol kot aromo, kategorizirano kot snovi, ki so strukturno povezane z mentolom1. Na podlagi strukturnega razreda arom je bil 2-(l-mentoksi)etanol uvrščen v razred I. V Združenih državah in Evropi so ravni vnosa 2-(l-mentoksi)etanola pri ljudeh so bili ocenjeni na 12 ug/osebo/dan oziroma 0,01 ug/osebo/dan, oba pod pragom I. razreda 1800 ug/osebo/dan. Na podlagi teh ocen se šteje, da 2-(l-mentoksi)etanol med rutinsko uporabo kot aroma morda ne predstavlja varnostnih pomislekov.

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(l-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg telesne teže [TT])1. Kljub uporabi 2-(l-men thoksi)etanola kot arome so na voljo omejeni podatki o toksičnosti te spojine pri ponavljajočih se odmerkih. Naš laboratorij je raziskal toksičnost več aditivov za živila, vključno z reprezentativnimi aromami iz vsake kategorije, na modelih glodalcev2–7. Da bi razjasnili toksikološki profil in določili raven brez opaznih neželenih učinkov (NOAEL), smo izvedli 13-tedensko študijo subkronične toksičnosti 2-(l-mentoksi)etanola, ki je bil peroralno dajan F344 podgane z gavažo.

Materiali in metode

Preskusna kemikalija

2-(l-Mentoksi)etanol (št. serije 5I0002, čistost 99,9 %) proizvaja Takasago Int. Corp. (Tokio, Japonska) je zagotovil Oddelek za standarde in vrednotenje, Oddelek za varnost hrane, Ministrstvo za zdravje, delo in socialno skrbstvo, Japonska, s podporo Japonskega združenja za okuse in dišave (Tokio, Japonska). Čeprav je bila preskusna snov zagotovljena kot mešanica optičnih izomerov (št. CAS 38618-23-4), jo je proizvajalec potrdil kot l-enantiomer (št. CAS 75443-64-0). Oralna gavaža s koruznim oljem (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonska) kot nosilec je bila izbrana kot pot dajanja zaradi netopnosti v vodi in hlapnosti 2-(l-mentoksi)etanola. Raztopine 2-(l-mentoksi)etanola smo pripravljali dnevno, tik pred dajanjem. Po 2 urah shranjevanja pri sobni temperaturi so bila razmerja ostankov 2-(l-mentoksi)etanola v 4, 40 in 400 mg/ml raztopini potrjena kot 96,8 %, 99,8 % oziroma 96,5 %, s plinsko kromatografijo (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokio, Japonska).

Poskusne živali

Skupno je bilo 40 samcev in 40 samic podgan brez specifičnih patogenov (F344/DuCrlCrlj, 5-teden starosti) kupljenih pri Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japonska) in uporabljenih po aklimatizaciji en teden. Med študijo so bile živali nameščene v polikarbonatnih kletkah z mehko steljo, vzdrževane v prostoru z zapornim sistemom za nadzor cikla svetloba/tema (12 h), prezračevanje (hitrost izmenjave zraka 18-krat/h), temperatura ( 24 ± 1 stopinja) in relativno vlažnost (55 ± 5 %). Kletke in steljo so zamenjali dvakrat na teden. Vsaka žival je imela prost dostop do vode iz pipe in bazalne prehrane (CRF-1; Oriental Yeast, Tokio, Japonska). Na začetku poskusa so bile živali naključno razdeljene v štiri skupine po 10 podganjih samcev in samic, na podlagi telesne mase, izmerjene neposredno pred začetkom zdravljenja s preskusno kemikalijo.

Oblikovanje študija

V predhodni {{0}}dnevni študiji, ki je ocenjevala 2-(l-mentoksi)etanol, dajan v odmerkih 0, 200, 400 in 800 mg/kg telesne mase/dan, je absolutna in relativna teža jeter se je znatno povečala v vseh zdravljenih skupinah obeh spolov (podatki niso prikazani). Na podlagi teh rezultatov smo izbrali odmerke 2-(l-mentoksi) etanola 0, 15, 60 in 250 mg/kg telesne mase/dan za dajanje podganjim samcem in samicam v sedanjosti 13- tedensko študijo toksičnosti

Dnevno so ocenjevali splošno stanje in umrljivost. Telesne teže, kot tudi količine zaužite hrane in ostankov hrane so merili enkrat tedensko v poskusnem obdobju. Vse podgane so bile ob zaključku zdravljenja čez noč tešče in vzorci krvi za hematološke in biokemijske preiskave seruma so bili zbrani iz trebušne aorte pod globoko inhalacijsko anestezijo z uporabo izoflurana. Načrt študije je bil v skladu s Smernicami za označevanje aditivov za živila in revizijo standardov za uporabo aditivov za živila na Japonskem (1996) in odobril ga je Odbor za nego in uporabo živali Nacionalnega inštituta za zdravstvene vede na Japonskem.

Hematologija in biokemija seruma

Naslednji hematološki parametri so bili analizirani z avtomatskimi hematološkimi analizatorji ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, ZDA): število belih krvnih celic (WBC), število rdečih krvnih celic (RBC), koncentracija hemoglobina (HGB), hematokrit (HCT), povprečni korpuskularni volumen (MCV), srednji korpuskularni hemoglobin (MCH), srednja koncentracija korpuskularnega hemoglobina (MCHC), število trombocitov (PLT) in diferencialne levkocitne celice, vključno z nevtrofilci (Neut), limfociti (limfa), monociti (mono), eozinofili (Eosino) in bazofilci (Baso). Biokemijsko analizo seruma je opravil Oriental Yeast za naslednje parametre: celokupne beljakovine (TP), albumin (Alb), razmerje albumin/globulin (A/G), celokupni bilirubin (Bil), glukoza, skupni holesterol (T-Chol), trigliceridi (TG), sečninski dušik (BUN), kreatinin (Cre), kalcij (Ca), anorganski fosfor (IP), natrij (Na), kalij (K), klor (Cl), aspartat aminotransferaza (AST), alanin aminotransferaza (ALT), alkalna fosfataza (ALP) in -glutamil transpeptidaza (-GTP).

Teža organov in histopatološka ocena

Za vse živali so opravili popolno obdukcijo in stehtali možgane, timus, pljuča, srce, vranico, jetra, nadledvične žleze, ledvice, moda in jajčnike. Ti organi, kot tudi tkiva iz hrbtenjače, trigeminalnega živca, hipofize, nosne votline, žlez slinavk, jezika, požiralnika, sapnika, aorte, ščitnice, obščitnice, trebušne slinavke, želodca, tankega in debelega črevesa, submandibularnega in mezenteričnega bezgavke, vagina, maternica, sečni mehur, prostata, semenski vezikli, epididimis, stegnenica in prsnica s kostnim mozgom, vretenca, skeletne mišice, ishiadični živec, koža in mlečna žleza so bili fiksirani v 10% nevtralnem pufru formalina; nato so bili pripravljeni v parafin vgrajeni rezi in obarvani s hematoksilinom in eozinom za histopatološko preiskavo. Testise in oči s Harderjevimi žlezami smo fiksirali v Bouinovem fiksativu oziroma v Davidsonovi raztopini. Kostna tkiva, vključno z nosno votlino, vretenci, prsnico in stegnenico, so bila dekalcificirana z uporabo mešanice 10 % mravljinčne kisline in 10 % pufrskega formalina do 2 tedna. Histopatološka ocena je bila izvedena za vsa tkiva, pridobljena od živali v kontrolni skupini in skupini, ki je prejela največji odmerek, razen če so opazili lezije, povezane z zdravljenjem.

Imunohistokemija za 2u-globulin

Pri podganjih samcih so kopičenje 2u-globulina v ledvicah preiskali z imunohistokemično analizo rezin, vgrajenih v parafin. Za pridobivanje antigena smo odseke, pridobljene iz 5 podgan v vsaki skupini, inkubirali s proteinazo K (DAKO, Glostrup, Danska) 1 minuto pri sobni temperaturi. Vse sekcije so bile potopljene v 3% raztopino H2O2/metanol za 10 minut pri sobni temperaturi za inaktivacijo aktivnosti endogene peroksidaze. Po blokiranju nespecifičnih reakcij z 10 % normalnim kunčjim serumom smo odseke inkubirali s primarnim protitelesom za 2u-globulin (razredčeno 1:400; protitelo proti podganji 2u-globulin; R&D Systems, Minneapolis, MN, ZDA) čez noč pri 4 stopinjah 8. Vizualizacija vezave protiteles je bila izvedena z uporabo kompleta Vecta Stain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ZDA) in 3,3'-diaminobenzidina. Vsi odseki so bili kontrastno obarvani s hematoksilinom.

Statistična analiza

Razlike v podatkovnih vrednostih za telesno težo v poskusnem obdobju, kot tudi za hematologijo, serumsko biokemijo in težo organov so bile ocenjene glede homogenosti z uporabo Bartlettovega testa. Za homogene in heterogene podatke smo uporabili enosmerno analizo variance oziroma Kruskal-Wallisov test. Pri ugotavljanju statistično značilnih razlik je bil za primerjavo kontrolnih in zdravljenih skupin uporabljen Dunnettov test večkratne primerjave. Primerjave histopatoloških incidenc in stopenj so bile analizirane z uporabo Fisherjevega natančnega verjetnostnega testa oziroma Mann-Whitneyjevega U testa. P vrednosti<0.05 were considered statistically significant.