2.6. Izraz kaspaze-3 in kaspaze-6

Glikozid cistanche lahko tudi poveča aktivnost SOD v srčnem in jetrnem tkivu ter znatno zmanjša vsebnost lipofuscina in MDA v vsakem tkivu, učinkovito lovi različne reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂ itd.) in ščiti pred povzročeno poškodbo DNK z OH-radikali. Cistanche feniletanoidni glikozidi imajo močno sposobnost lovljenja prostih radikalov, večjo redukcijsko sposobnost kot vitamin C, izboljšajo aktivnost SOD v suspenziji semenčic, zmanjšajo vsebnost MDA in imajo določen zaščitni učinek na delovanje membrane semenčic. Cistanche polisaharidi lahko povečajo aktivnost SOD in GSH-Px v eritrocitih in pljučnem tkivu eksperimentalno starajočih se miši, ki jih povzroča D-galaktoza, pa tudi zmanjšajo vsebnost MDA in kolagena v pljučih in plazmi ter povečajo vsebnost elastina. dober čistilni učinek na DPPH, podaljša čas hipoksije pri starajočih miših, izboljša aktivnost SOD v serumu in upočasni fiziološko degeneracijo pljuč pri eksperimentalno starajočih se miših. Pri celični morfološki degeneraciji so poskusi pokazali, da ima Cistanche dobro antioksidativno sposobnost in ima potencial, da postane zdravilo za preprečevanje in zdravljenje bolezni staranja kože. Hkrati ima ehinakozid v Cistanche pomembno sposobnost čiščenja prostih radikalov DPPH in ima sposobnost čiščenja reaktivnih kisikovih vrst ter preprečuje razgradnjo kolagena, ki jo povzročijo prosti radikali, ima pa tudi dober učinek popravljanja na poškodbe anionov prostih radikalov timina.

Kliknite tukaj, če želite izvedeti Cistanche Tubulosa za antioksidant

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Miši TgAPP so pokazale povečanje ekspresije gena kaspaze {{0}} (slika 8C1, H1), ki je bilo pomembno in večje od 30 odstotkov v primerjavi s hipokampi miši WT (slika 8H1; p < 0,05). Kar zadeva izražanje kaspaze-6, niso opazili razlik med transgenimi in netransgenskimi mišmi (slika 8C2, H2).

Zdravljenje s kvercetinom in rutinom je lahko statistično značilno znižalo ravni mRNA kaspaze{{0}} v hipokampusu (slika 8H1; p < 0.05), z odstotki inhibicije okoli 17 odstotkov in 27 odstotkov za samice in samce miši. V možganski skorji so pomembne razlike opazili le pri zdravljenju z rutinom pri moških (slika 8C1; p < 0,05).

Kar zadeva kaspazo-6, zdravljenje s kvercetinom in rutinom ni imelo nikakršnega statistično pomembnega učinka v korteksu ali hipokampusu (slika 8C2, H2), čeprav je v slednjem kaspaza-6 pri moških s TgAPP pokazala nagnjenost k zmanjšanje (slika 8H2).

2.7. Označevalci vnetja

Dobljeni rezultati za izražanje genov vnetnih mediatorjev IL-1, TNF- in IFN- so prikazani na sliki 9.

Pri TgAPP je prišlo do pomembnega povečanja izražanja gena IL{{0}} za okoli 20 odstotka v skorji in hipokampusu pri obeh spolih v primerjavi z mišmi WT (slika 9C1, H1; p < 0,05). Kar zadeva TNF-, čeprav so v TgAPP prikazane višje ravni mRNA, niso statistično značilne pri miših WT (slika 9C2, H2). Kar zadeva IFN-, je prišlo do približno 30-odstotnega povečanja njegove ekspresije pri moških, kar je bilo statistično pomembno le v korteksu (slika 9C3; p < 0,05).

Zdravljenje s kvercetinom in rutinom, tako pri samicah kot pri samcih, je lahko zmanjšalo izražanje IL{{0}} v možganski skorji in hipokampusu v primerjavi s kontrolnimi mišmi TgAPP (slika 9C1, H1; p < {{8 }}.05), pri čemer dobimo podobne vrednosti kot pri miših WT in zlasti nižje v hipokampusu mišjih samcev (slika 9H1; p <0,05).

Skupnega učinka obeh zdravljenj s flavonoidi na izražanje IL{{0}} niso opazili pri TNF- niti pri INF-. Tako je pri moških s TgAPP po zdravljenju s kvercetinom prišlo do pomembnega zmanjšanja hipokampalne ekspresije TNF- (slika 9H2; p < 0.05) in kortikalne ekspresije IFN-ja (slika 9C3; p < 0,05).

2.8. Ocena degeneriranih nevronov in njihove projekcije

Pri starosti, pri kateri so bile testirane transgene miši TgAPP, v primerjavi z mišmi WT niso opazili nobenih značilnih znakov nevrodegeneracije, niti zdravljenje s kvercetinom in rutinom ni pokazalo nobene spremembe 4 tedne v primerjavi s TgAPP (slika S1, dodatni podatki).

2.9. Izražanje ionotropnih glutamatnih receptorjev

V ekspresiji receptorjev niso ugotovili pomembnih razlik, če primerjamo vrednosti, dobljene za kontrolne miši TgAPP, s tistimi, dobljenimi za miši WT. Prav tako ni bilo opaznih učinkov na izražanje teh ionotropnih receptorjev v prisotnosti zdravljenja s kvercetinom ali rutinom (tabela S5, dodatni podatki).

3. Razprava

Namen naše pričujoče študije je bil oceniti vpliv dveh flavonoidov, kvercetina in rutina, na prvih stopnjah patogeneze AD, ne glede na njun učinek na nevrodegeneracijo in/ali kognitivno funkcijo. Korteks in hipokampus sta bili analizirani predeli možganov, saj sta najbolj prizadeti možganski strukturi pri AD. Upoštevati je treba, da sta bila kvercetin in rutin aplicirana s sestavljeno dieto, ki je vsebovala enega od obeh flavonoidov, da bi v živalskem modelu AD posnemali vnos zdrave človeške prehrane, ki vsebuje aktivno sestavino.

Zlasti je transgen APPswe v mišji C57B6 pomembno vplival na razmerje GSH/GSSG, ravni MDA, kapaciteto antioksidantnih encimov, izražanje APP, aktivnost BACE1 ter izražanje kaspaze-3 in IL-1. Medtem ko mutacije APP pri ljudeh na splošno povzročijo tipično AD, so večinoma povezane samo z amiloidno patologijo pri transgenih miših APP in ni opazne nevrodegeneracije [14,15], saj pri naših transgenih miših TgAPP niso opazili značilnih znakov, v nasprotju z miši WT (dodatni podatki, slika S1). Protibarvanje z 40 -6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI) hipokampalnih nevronov nam je omogočilo opazovanje jedrske morfologije, saj je ta spojina fluorescenčno barvilo za nukleinske kisline. Nismo opazili fragmentiranih ali lobularnih jeder, tipično apoptotičnih; prav tako nismo opazili nobenih izjemnih razlik pri primerjavi histoloških odsekov hipokampusa kontrolne transgene linije TgAPP glede odsekov WT; prav tako nismo opazili nobenih razlik med zdravljenjem s kvercetinom in rutinom v zvezi s kontrolnimi mišmi TgAPP.

V skupini biokemičnih značilnosti AD, ki jih je treba analizirati, smo se osredotočili predvsem na določanje razmerja GSH/GSSG pri eni od dveh flavonoidnih diet, saj zmanjšanje ravni GSH predstavlja enega najpomembnejših zgodnjih biokemičnih označevalcev AD [16,17]. ] in so ga opazili med njegovo patogenezo in napredovanjem bolezni. Merjenje ravni GSH v možganih [18] in v zadnjem času ravni GSH v krvi [19] je bilo obetavno kot diagnostični marker za zgodnje faze AD. Poleg tega so bila vložena tudi prizadevanja za dopolnitev endogenih zalog GSH s samimi ali njihovimi predhodniki [20–22]. V naši študiji so opazili upad celične redukcijske moči (GSH/GSSG) pri miših TgAPP v zvezi z živalmi WT, pri samcih in samicah ter v obeh predelih možganov. V skorji in hipokampusu miši WT in TgAPP je bilo razmerje GSH/GSSG nižje pri samcih kot pri samicah. Diete s kvercetinom in rutinom so znatno povečale razmerje GSH/GSSG v primerjavi z nezdravljenimi mišmi TgAPP in to povečanje je bilo izrazitejše v hipokampusu. Spremembe ravni GSH in GSSG ter razmerja GSH/GSSG po zdravljenju s kvercetinom ali rutinom pri samcih, kar zadeva povečanje redoks moči, so bile bolj izrazite kot pri ženskah. Rezultati naših določitev lahko razkrijejo pomembno podlago za spolno povezane razlike pri miših Tg2576 v dovzetnosti za oksidativne poškodbe makromolekul na eni strani, saj je glutationski sistem vsestranski reducent v številnih bioloških funkcijah in v vplivu preventivnih flavonoidne diete pri ponovni vzpostavitvi njenega fiziološkega stanja na drugi strani. Kot bomo videli v tej razpravi, smo določili povečanje razmerja GSH/GSSG kot glavno os, ki bi lahko pojasnila nabor učinkov, opaženih pri miših TgAPP.

Pred kratkim je bilo predlagano, da bi razmerje GSH/GSSG, namesto da bi preprosto delovalo kot redoks pufer, namesto tega delovalo kot glavni regulativni mehanizem, ki bi beljakovinam omogočil, da dosežejo svojo naravno konformacijo in funkcionalnost s strogim nadzorom tiol-disulfidnega ravnovesja v celici. proteom. Skratka, glutationski sistem se pojavi kot nujen za ohranitev zdravega proteoma, kar kaže, da motnje redoks homeostaze glutationa (tj. genetsko ali farmakološko) povečajo agregacijo beljakovin zaradi motenj v učinkovitosti avtofagije [23]. Zato imajo lahko strategije, namenjene vzdrževanju redoks homeostaze glutationa, terapevtski potencial pri boleznih, povezanih z agregacijo beljakovin, kot je AD. Z ohranjanjem proteoma je tesno povezan mehanizem razgradnje ubikvitin-proteasom, ki je vključen v patogenezo AD. Proteasom selektivno razgradi več substratov, ki so ključni pri vzdrževanju nevronske homeostaze, vključno s katabolizmom oksidiranih in agregiranih beljakovin. BACE1 je podvržen ubikvitinaciji in dokazano je, da bo blokiranje poti ubikvitin–proteasom zaviralo razgradnjo BACE1 in posledično vodilo do povečane proizvodnje encimske aktivnosti BACE1, več produkta cepitve C99 in povečanja A 1-40 in A { {8}} v nevronskih in ne-nevronskih celicah [10]. Naše prejšnje študije so pokazale, da flavonoidi, kvercetin in rutin vplivajo na različne signalne poti in molekularna omrežja, povezana z modulacijo funkcije proteasoma v celicah nevroblastoma [9]. Poleg tega je bilo dokazano, da so nevroni, dopolnjeni z reduciranim glutationom (GSH), obnovili aktivnost proteasoma in zmanjšali tvorbo agregatov [11], ker je funkcija proteasoma regulirana z redoks statusom [24]. Zato je povečanje razmerja GSH/GSSG, ki so ga doživele živali po dieti s kvercetinom ali rutinom, skladno z modulacijo proteasoma s kvercetinom in rutinom, ki je bila predhodno dokazana ex vivo.

Kot je bilo že omenjeno, redoks neravnovesje vodi do visoko oksidativno spremenjenih proteinov, ki se nagibajo k kopičenju in ustvarjanju agregatov, kar povzroči okvaro proteasomov [25]. Tako so glede na ključno vlogo oksidativnega stresa v patogenezi AD ocenili biomarkerje oksidativnega stresa, vključno s peroksidacijo lipidov (ravni MDA) in antioksidativnimi encimi, v skorji in hipokampusu pri miših TgAPP in WT. SOD, CAT, GR in GPx so najpomembnejši antioksidativni encimi, ki delujejo proti prostim kisikovim radikalom in uravnavajo metabolizem prostih radikalov v telesu ter igrajo vlogo v sistemu za lovljenje prostih radikalov in ščitijo celice v telesu pred peroksidacijo lipidov. . V naši študiji so kot posledico prekomerne ekspresije APP opazili splošno zmanjšanje aktivnosti antioksidantnih encimov pri miših TgAPP v primerjavi z mišmi WT, kar je statistično pomembno za CAT. V skladu z znižanimi ravnmi GSH je bila lipidna peroksidacija znatno povečana pri miših TgAPP. Medtem ko je vir oksidativnega stresa pri človeku AD zelo zapleten in večfaktorski, se zdi, da amiloidna patologija, razvita pri miših, zadostuje za sprožitev patološkega procesa, ki vodi do povečanega oksidativnega stresa v možganih [26]. Pri živalih, zdravljenih z rutinom, se je povečala aktivnost CAT v korteksu in aktivnost GR v hipokampusu, tako pri samcih kot samicah. Samo živali, zdravljene z rutinom, so imele spremembe v izražanju genov CAT in GR v skorji in hipokampusu pri samcih in samicah ter GPx v hipokampusih mišjih samic. V tem kontekstu se je pokazalo, da več naravnih spojin vpliva na preslušavanje med proteasomom in redoks regulacijo. Natančneje, kvercetin je znani aktivator Nrf2 [27], ki kaže antioksidativne lastnosti s stimulacijo funkcije proteasomov, spodbuja povečano odpornost proti oksidativnemu stresu in daje podaljšano življenjsko dobo celic [28].

Tkivno specifična ekspresija BACE1 je kritična za normalno obdelavo APP, njegova disregulirana ekspresija pa lahko igra vlogo pri patogenezi AD. BACE1 se pretežno izraža v hipokampalnih nevronih, skorji in zrnati plasti malih možganov [10]. Treba je opozoriti, da so prejšnje študije pokazale, da so imele švedske mutirane transgene miši APP znatno povečane možganske ravni A v stanju dinamičnega ravnovesja [29], kar kaže, da ima BACE1 bistveno vlogo v amiloidogeni poti v patogenezi AD in je dobra terapevtska tarča za zdravljenje AD. V naši študiji smo opazili znatno zmanjšanje aktivnosti BACE1 pri zdravljenju s kvercetinom in rutinom, kar bi lahko prispevalo k zmanjšanju odlaganja A pri miših. Trdimo, da več kot zgolj delovanje zaviralcev BACE1 encima, kvercetina in rutina lahko povzroči zmanjšanje aktivnosti BACE1, povezano s povečanjem razmerja GSH/GSSG, na podlagi hipoteze o izboljšanju obnovitve aktivnosti proteasoma. V tem smislu je znano, da se ciljanje zaviralcev BACE1 na mesto cepitve APPswe (švedska mutacija) pojavi, preden doseže plazemsko membrano, medtem ko se APPwt (divji tip) predela v zgodnjem endosomu, ki izvira iz celične površine. Zato je BACE1, ki cepi APPwt, včasih vezan na zaviralec BACE1 na celični površini pred obdelavo APP, vendar pa encim, ki predeluje APPswe, ni [30]. Zaradi tega razloga lahko nenormalna lokalizacija obdelave APPswe znatno zmanjša moč kvercetina in rutina kot zaviralcev BACE1. Tako smo bolj nagnjeni k podpori, da zmanjšanje aktivnosti BACE v tem in vivo modelu ni toliko posledica inhibicije encima, temveč povečanja razmerja GSH/GSSG. V vsakem primeru bi lahko zmanjšano aktivnost BACE1 razlagali kot domnevni poskus zmanjšanja proizvodnje -amiloida pri miših TgAPP. Kar zadeva najbolj izjemen učinek kvercetina in rutina v hipokampusu na oslabitev aktivnosti BACE1, je treba omeniti, da ima skorja znatno večjo gostoto nevronov kot hipokampus [31], selektivna okvara proteasoma pri patološkem fenotipu AD povzroči korteks bolj ranljiv in prizadet kot hipokampus [32].

Po določitvi učinka zdravljenja na aktivnost encima BACE1 nas je zanimalo vrednotenje njegovega izražanja. Zanimivo je, da med mišmi TgAPP v primerjavi z mišmi WT niso ugotovili pomembnih razlik v izražanju BACE1 in pri zdravljenju s kvercetinom ali rutinom niso opazili nobenih opaznih sprememb. Zato se zdi, da povečanje aktivnosti encima BACE1 ni povezano s povečanjem izražanja. V tem kontekstu je izjemno, da Apelt et al. [14] so ugotovili povečanje kortikalne aktivnosti BACE1 pri miših Tg2576, starih od 9 do 13 mesecev, medtem ko se raven izražanja proteina BACE1 in mRNA s starostjo ni spremenila. Poleg tega so bili najdeni dokazi, ki podpirajo, da lahko fibrilarni amiloid A 1–42., namesto topnega amiloida A 1–42, poveča ekspresijo proteina BACE1, zato lahko majhne spremembe v razmerju izooblik amiloida modulirajo konformacije amiloidnih agregatov in poškodbe celic. 33]. Tako lahko odsotnost spremembe izražanja BACE1 ob povečanju njegove aktivnosti, ki smo jo ugotovili, pojasni razširjenost topnega amiloida A 1–42 nad izoformo fibrilarnega amiloida A 1–42 v našem mišjem modelu TgAPP.

Po določitvi genske ekspresije encimov, ki sodelujejo pri predelavi APP, smo ovrednotili učinek kvercetina in rutina na encim -sekretazo, ki sodeluje pri neamiloidogenem procesiranju APP. Osredotočili smo se na ADAM10, ker je fiziološko najpomembnejša konstitutivna izoforma -sekretaze. ADAM10 preprečuje nastanek nevrotoksičnih oligomernih A plakov s cepitvijo APP znotraj domene A, da proizvede sAPP in C-terminalne fragmente (-CTF) [34,35]. Čeprav spremembe v izražanju ADAM10, ugotovljene v naši študiji, niso bile statistično značilne, so pri miših TgAPP opazili rahlo zmanjšanje izražanja ADAM10 v primerjavi z mišmi WT. Pretežno je zdravljenje z rutinom pokazalo težnjo k povečanju ekspresije gena ADAM10 v obeh proučevanih predelih možganov. Postina idr. [36] je pokazalo, da povečana regulacija divjega tipa ADAM10 v hipokampusu AD mišjega modela posreduje izločanje sAPP, kar vodi do zaviranja nastajanja A plakov. Učinek kvercetina so proučevali na modelu AD podgan, ki ga povzroča aluminijev klorid, kar je pokazalo znatno izboljšanje -sekretaze (ADAM10 in ADAM17) v hipokampusu v primerjavi z nezdravljenimi. To kaže, da ima kvercetin potencial za povečanje neamiloidogene poti z aktivacijo genov -sekretaze [37]. Predklinični podatki potrjujejo hipotezo, da je povečanje ravni sAPP v možganih možna strategija za izboljšanje simptomov, povezanih z AD, in zmanjšanje sinaptičnih pomanjkljivosti. ADAM10 in BACE1 tekmujeta za cepitev APP, zato lahko potenciranje aktivnosti ADAM10 zavre nastajanje nevrotoksičnega amiloida. Poleg tega lahko sAPP prepreči aktivacijo stresne JNK-signalne poti, kar vodi do aktivacije fosforilacijske aktivnosti, ki jo povzroča NF-κB, kar vodi do razgradnje proteasoma [38]. Zato sta tvorba in kopičenje z boleznijo povezanih beljakovinskih agregatov znatno zmanjšana, aktivnost celičnih proteasomov pa je okrepljena, kar zagotavlja dokaze o delovanju sAPP pri regulaciji proteostaze [39]. Poleg tega je bilo dokazano, da sAPP posebej uravnava sintezo glutamatnega receptorja AMPA in njegovo trgovanje [40]. V naši študiji smo raziskali, ali rahlo povečanje izražanja ADAM10 pri zdravljenju z rutinom nekoliko vpliva na glutamatergični sinaptični prenos. Kot je prikazano v razdelku z dodatnimi podatki, pri dietah s kvercetinom in rutinom niso opazili pomembnih učinkov na izražanje tega ionotropnega receptorja, morda zaradi šibkega povečanja izražanja ADAM10, ki ne zadošča za uravnavanje receptorja AMPA (dodatni podatki , slika S2 in tabela S5).

Upoštevati je treba, da so študije in vitro pokazale široko paleto substratov ADAM10 [41], zato lahko neželene učinke, pridobljene z nespecifičnim ciljanjem na ADAM10-, najdemo v proliferaciji raka, celični adheziji, spodbujanju prekurzorja T-celic/NK-celic in vnetja itd. [42]. Da bi se izognili tej omejitvi, naša študija predlaga strategijo, namenjeno bolj fiziološkemu spodbujanju sproščanja sAPP. Ta pristop lahko temelji na dolgotrajnem uživanju učinkovine (kvercetin ali rutin), ki jo človek zaužije z zdravo prehrano. Vendar pa so potrebne nadaljnje študije, da bi ugotovili, ali je povečanje ADAM10 odvisno od odmerka flavonoida in ali potencialni koristni učinki odtehtajo domnevne stranske učinke.

Kar zadeva izražanje APPswe, čeprav vstavitev človeškega transgena APP v mišji genom zagotavlja, da je APPswe prekomerno izražen od rojstva, so poročali, da ravni mRNA APP in beljakovin v hipokampulu med razvojem živali znatno nihajo in so največje pri miših. asimptomatski (1-mesečni) in se zmanjša, ko se pojavi popolna simptomatologija [43]. Ne glede na to težavo je bila ekspresija APP v skorji in hipokampusu znatno višja v primerjavi z miši WT v naši študiji. Nadaljnje zdravljenje s kvercetinom ali rutinom je lahko bistveno zmanjšalo takšno izražanje tako pri mišjih samcih kot samicah v obeh predelih možganov. Te ugotovitve so v skladu s tistimi, ki so jih poročali Augustin et al. [44], ki so preučevali standardiziran izvleček ginka (Egb761), bogat s flavonoli, kot je kvercetin, pri 4-mesečnih samicah miši TgAPP in ugotovili zmanjšano raven mRNA in beljakovin APP. Ob upoštevanju, da se uravnavanje translacije APP pri miših Tg2576 pojavi v prodromalnih in zgodnjih simptomatskih fazah [45], je verjetno, da je do obnovitve translacije APP s kvercetinom ali rutinom prišlo pri naših miših TgAPP in verjetno v zgodnji fazi. simptomatsko stopnjo, kar ima za posledico zmanjšanje kortikalnih in hipokampalnih ravni APP, aktivnosti BACE1 in aktivacije kaspaze-3.

Poleg tega so drugje poročali, da se pri miših Tg2576 (brez izgube nevronov) poveča aktivacija kaspaze-3 v hipokampusu [46], kot je bilo ugotovljeno v naši študiji, ob nastopu motenj spomina. , skupaj z zmanjšanjem dendritičnih bodic pred odlaganjem zunajceličnega amiloida [46]. Obstajajo dokazi, ki podpirajo neapoptotične vloge kaspaz v živčnem sistemu brez smrti nevronov [47], aktivnost kaspaze-3 pa je bila lokalizirana na dendritične bodice, kjer lahko zviša raven kalcinevrina. Defosforilacija podenote GluR1 AMPA podobnih receptorjev, ki jo sproži kalcineurin, pa naj bi povzročila postsinaptično disfunkcijo. Naše vrednosti izražanja kaspaze-3 kot posledice transgeneze se ujemajo s tistimi, ki so jih pridobili drugi raziskovalci, ki so poročali o povečanju izražanja kaspaze-3 na ravni dendritičnih bodic v hipokampusu miši TgAPP [48]. Ker APP vsebuje tri različna mesta cepitve za kaspazo-3 v svojem aminokislinskem zaporedju, od katerih se dve nahajata na ravni zunajcelične domene in eno v intracelularnem C-terminalnem delu repa APP [49], hidroliza APP s kaspazo-3 lahko spremeni proteolitično procesiranje APP v korist amiloidogene poti [50], kar vodi do sproščanja citotoksičnega peptida, pridobljenega iz C-terminala, dolžine 31 aminokislin (C31), za primer [51]. To nakazuje, da ker lahko kaspaza-3 posreduje pri povečanju sproščanja toksičnih fragmentov iz APP, lahko znižanje izražanja kaspaze-3 s kvercetinom ali rutinom omogoči očistek agregiranih beljakovin. Poleg tega smo, kot smo že omenili, raziskali vpliv tako povečanja kot zmanjšanja izražanja kaspaze-3 pri glutamatergičnem sinaptičnem prenosu, ki temelji na sposobnosti s kalcinevrinom aktivirane kaspaze-3, da defosforilira podenoto GluR1 receptorjev AMPA na postsinaptični ravni. Te molekularne modifikacije spremenijo glutamatergični sinaptični prenos in nevronsko plastičnost na ravni dendritičnih bodic v hipokampusu [48]. Teoretično lahko farmakološka inhibicija aktivnosti kaspaze-3 pri miših TgAPP reši AD-podobne fenotipe pred mehanizmom, ki poganja sinaptično odpoved. Vendar pa kljub povečanju izražanja kaspaze-3 pri naši mišji TgAPP nismo našli pomembnih razlik v izražanju receptorja AMPA v primerjavi s tistim pri miših WT, kot je bilo omenjeno prej. Lahko se zgodi, da spremembe v izražanju kaspaze -3 niso dovolj izrazite, da bi povzročile pomembne spremembe v izražanju receptorja AMPA (dodatni podatki, slika S2 in tabela S5).

Kar zadeva vrednosti izražanja kaspaze-6, med mišmi TgAPP in WT niso ugotovili pomembnih razlik. Aktivacija kaspaze-6 je bila ugotovljena kot pomemben mediator nevronskega stresa, ki cepi pomembne citoskeletne proteine ​​(Tau in -tubulin), s čimer moti ubikvitin-proteasomsko razgradnjo napačno zvitih proteinov in več postsinaptične gostote, ki uravnava aktin beljakovine [52]. Nespremenjena ekspresija kaspaze -6 v naši študiji se ujema z odsotnostjo značilnih znakov nevrodegeneracije v starosti, pri kateri so bile ocenjene te transgene miši, v primerjavi z mišmi WT (dodatni podatki, slika S1).

Pri bolnikih z AD so opazili izrazito povečanje nevroinflamatornih mediatorjev, predvsem okoli senilnih plakov [53–55]. Astrociti so glavni dobavitelj GSH za mikroglijo in nevrone. Med kroničnim vnetjem in oksidativnim stresom astrociti sproščajo toksične vnetne mediatorje in proste radikale, pospešujejo aktivacijo mikroglije in nevrodegeneracijo [56]. Treba je omeniti, da je zmanjšan intracelularni glutation povezan z aktivacijo vnetnih poti, p38 MAP-kinaze, Jun-N-terminalne kinaze (JNK), NF-κB, v človeški mikrogliji in astrocitih [57]. V zvezi s tem smo se odločili kvantificirati ravni IL-1, IFN- in TNF- v našem živalskem modelu ter določiti učinek kvercetina in rutina nanje. Kot je znano, vnetje spodbuja nepravilno obdelavo peptida A in APP, spodbuja agregacijo peptida A in posledično spreminja reaktivnost A [58]. Tako smo v naši študiji opazili, da so imele miši TgAPP povečane ravni mRNA vnetnih mediatorjev IL-1, TNF- in IFN- v primerjavi z mišmi WT, kar kaže, da lahko čezmerna ekspresija APPswe povzroči nevrovnetne kaskade sproži vrsto molekularnih poti v gliji in nevronih, kar bi aktiviralo vnetni odziv. Kvercetin in rutin sta lahko oslabila ekspresijo gena IL-1 pri moških in ženskah ter v proučevanih možganskih področjih. Več dokazov podpira protivnetni učinek kvercetina na ravni centralnega živčnega sistema, saj lahko zavira aktivacijo transkripcijskih faktorjev, kot je jedrski faktor kapa B (NF-κB) [59], ki sodeluje pri indukciji iNOS, in zato zmanjšajte sproščanje mediatorjev, kot so IL-1, TNF- in IFN- [60]. V zvezi z vplivom GSH na vnetni odziv je treba opozoriti, da GSH sodeluje pri vzdrževanju optimalnih ravni citokinov na tak način, da pride do izražanja protivnetnih citokinov (TNF-, IL-1 in IL -6) so povečane zaradi zmanjšanja GSH, medtem ko je izražanje protivnetnih citokinov (tj. IL-10) ostalo nespremenjeno. Ta sprememba homeostaze GSH se zgodi zaradi povečane regulacije v signalnih poteh NF-κB in JNK, ki bi lahko bila izvedljiva apoptotična pot do smrti nevronskih celic [61]. V naši študiji bi lahko bila znižana regulacija NF-κB s kvercetinom in rutinom verjeten mehanizem za obnovitev homeostaze GSH/GSSG in s tem vzrok za ravnovesje med protivnetnimi in protivnetnimi citokini. Nazadnje, ker ima promotor BACE1 vezavno mesto NF-κB, aktivacija NF-κB, ki jo povzroči vnetje, olajša regulacijo ekspresije BACE1 in posledično poveča proizvodnjo A [62]. Če torej pride do znižane regulacije NF-κB pri dietah s kvercetinom in rutinom, bi se aktivnost BACE1 zmanjšala zaradi regulacije sproščanja protivnetnih in ne protivnetnih citokinov.

4. Material in metode

4.1. Poskusne živali

Transgena miš (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha), ki izraža švedsko dvojno mutacijo humanega amiloidnega prekurzorskega proteina (hAPP), je bila uporabljena kot živalski model eksperimentalne AD [14]. Miš je heterozigotna linija, ki izraža človeško izoobliko A PP695 z dvojno švedsko mutacijo (K670N/M671L; Lys670→Asn in Met671→Leu) pod nadzorom promotorja prionskega proteina hrčka [63]. Posledično ima ta miš ravni humanega amiloidnega prekurzorskega proteina (A PP), šestkrat višje od ravni A PP pri miših. Poleg tega ta miška kaže višje ravni A 40 in A 42. A depoziti se začnejo pri 9 mesecih starosti [63]. V hipokampusu in skorji Tg2576 je izražanje transgena APPswe predvsem nevronsko [64].

Kot negativno kontrolo so uporabili miši divjega tipa (WT) iz iste kolonije [65,66]. Kolonijo miši Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) smo razvili v našem laboratoriju iz heterozigotnih samcev Tg2576 in samic divjega tipa. Transgene starše je podarila dr. Diana Frechilla iz oddelka za nevroznanost Centra za uporabne medicinske raziskave na Univerzi v Navarri (Pamplona, ​​Španija) [67].

Živali so bile nameščene v ločeno prezračenih kletkah in hranjene pri 22–24 ◦C v 12- ciklu svetloba/tema pri 50–60-odstotni vlažnosti. Protokole za živali je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali (IACUC) na Univerzi Complutense v Madridu in so bili popolnoma v skladu z Evropsko direktivo 2010/63/o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene, in špansko zakonodajo o dobrem počutju živali ( Kraljevi odlok 53/2013, 1. februar 2013).

4.2. Genotipske analize miši

Transgenost je bila določena v 30 dneh po rojstvu z biopsijo repa. Genotipske analize živali so bile izvedene s PCR. Glede na to, da je Tg2576 (TgAPP) heterozigotna linija, smo kot pozitivno reakcijsko kontrolo uporabili insercijski gen (PrP, iz prionskega proteina). Genomsko DNA smo ekstrahirali iz mišjih repov, prebavljenih s proteinazo K (0.1 µg/µL) v pufru NID (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM MgCl2, 0,05 odstotka želatine, 0,45 odstotka NP-40 in 0,4 odstotka Tween 20) pri 56 ◦C 3 ure in stresajte. Fragmente DNA smo oborili z izopropanolom in sprali s 70-odstotnim etanolom. Precipitate DNA smo raztopili v 30 µL pufra TE (10 mM Tris-1 mM EDTA). Čistost in koncentracijo DNA smo določili pri 260 in 280 nm.

Gena PrP in APP smo pomnožili s PCR. Zaporedja primerjev, uporabljenih za presejanje transgenih miši, so bila naslednja: PrP naprej: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP zadaj: GTGGATACCCCCCCCCCCCAGCCTAGACC; Hrbtna stran APP: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. Koraki reakcije PCR so bili naslednji: denaturacija pri 94 °C za 90 s, 39 ciklov pri 60 °C za 60 s in 72 °C za 90 s, nato končno podaljšanje pri 72 °C za 7 minut.

V vseh primerih so bile upoštevane negativne kontrole (brez DNA plesni) in pozitivne kontrole gena APP. Dobljene produkte PCR smo ločili z elektroforezo v 1,5-odstotnem agaroznem gelu v pufru 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija) pri 70 V (konstantna napetost) in jih nato slikali z barvanjem z GelRed (Millipore).

4.3. Zdravljenje živali

TgAPP miši in divji tipi sorodnikov iz legla, stari 6–7 tednov z začetno telesno težo 16,2 ± 0,8 g, so bili randomizirani v naslednje štiri skupine (n=8/skupino): ( a) neobdelani TgAPP; (b) s kvercetinom obdelan TgAPP; (c) z rutinom obdelan TgAPP; in (d) neobdelani divji tip. Ker so preučevali mišje samce in samice, sta bili ustanovljeni dve skupini skupin. Pri starosti 45 tednov so miši začeli 4 tedne zdraviti s kvercetinom ali rutinom.

Kvercetin (3,30,40,5,7-pentahidroksiflavon) in rutin hidrat (kvercetin-3-O-rutinozid hidrat) sta bila večja ali enaka 95-odstotni čistosti in kupljena pri Sigma–Aldrich. Vsak od flavonoidov je bil vključen v standardno prehrano (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Španija) v koncentraciji 200 ppm, kar ustreza vnosu 30 mg flavonoida/kg telesne teže/dan. Nezdravljene miši so prejele izključno standardno prehrano brez dodatkov. Dieta in voda sta bili zagotovljeni za vnos ad libitum.

4.4. Priprava možganskega tkiva za biokemične in histološke preiskave

Na koncu zdravljenja so miši čez noč postili, jih evtanazirali z dislokacijo materničnega vratu in hitro odstranili celotne možgane. Možgane smo splaknili s fiziološko raztopino pri 4 °C in skrbno odstranili arahnoidno membrano. Nato smo izolirali hipokampus in skorjo. Vzorce smo takoj shranili pri –80 ◦C do nadaljnje uporabe.

Celotni možgani nekaterih živali so bili uporabljeni za pridobitev histoloških rezov, za katere so bili po evtanaziji z uporabo cervikalne dislokacije možgani zamrznjeni s potopitvijo v izopentan pri –80 ◦C. Takoj zatem so v kriostatu (Leica CM1850, Nussloch, Nemčija) izdelali koronalne odseke možganov (debeline 30 µm) od vohalne čebulice do malih možganov, 120 µm narazen. Celoten postopek smo izvedli pri –20 ◦C. Histološke odseke smo zbrali na stekelcih in hranili pri –80 ◦C do analize (glejte dopolnilne metode).

4.5. Glutation

Za glutationske teste smo vzorce možganske skorje in hipokampusa homogenizirali v pufru za dušenje redoks -5 odstotkov triklorida ocetne kisline (RQB-5 odstotkov TCA) (pred tem 15 minut prepihanega z N2 na ledu) pri koncentraciji 25 mg/ml (m/v). Vzorce smo resuspendirali z ultrazvočno sonikacijo 10 s, nato centrifugirali pri 12,000× g 10 minut pri 4 ◦C in zbrali supernatante.

Nato so bile v dobljenem supernatantu sprejete spektrofluorometrične metode za določanje ravni GSH in GSSG z uporabo o-ftalaldehidne metode, ki so jo opisali Senft et al. [68]. Vrednosti GSH in GSSG so bile popravljene za spontano reakcijo v odsotnosti biološkega vzorca. V obeh primerih smo supernatante inkubirali 30 minut pri sobni temperaturi in nato izmerili fluorescenco z bralnikom mikroplošč FLUOSTAR (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Nemčija), pri čemer je bil vzbujevalni filter nastavljen na 360 nm (pasovna širina 5 nm). in emisijski filter nastavljen na 460 nm (pasovna širina 5 nm). Koncentracija GSH in GSSG v vsakem vzorcu je bila interpolirana iz znanih standardov GSH. Koncentracije GSH in GSSG so bile izražene kot nmol GSH/mg proteina, kar je omogočilo izračun redoks razmerja glutationa GSH/GSSG.

Preostale pelete smo vrtinčili, dokler se niso popolnoma raztopile v 240 µL 0,1 M NaOH, da smo izmerili koncentracijo beljakovin z metodo bicinhoninske kisline (BCA), pri čemer smo kot standard uporabili goveji serumski albumin.

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】