Nova homozigotna mutacija KLHL3 kot vzrok za avtosomno recesivni psevdohipoaldosteronizem tipa II, diagnosticiran pozno v življenju Ⅱ
Nov 02, 2023
Rezultati
Poročilo primera
Preiskovanka, ženska turškega porekla, je bila v starosti 58 let napotena v ambulanto oddelka za nefrologijo Univerzitetne bolnišnice Düsseldorf zaradi vztrajne hiperkalemije (prvič diagnosticirana pri starosti 47 let), suma na ledvično tubularno acidozo tipa IV v prisotnost kronične ledvične bolezni (KLB) (G3a A2, KDIGO), ciroza leve ledvice, nefrolitiaza z anamnezo kirurške odstranitve kamnov pri starosti 17 let, ponavljajoče se okužbe sečil in hipertenzija (prvič diagnosticirana pri starosti 41 let). leta). Njena pretekla zdravstvena anamneza je bila pomembna za koronarno srčno bolezen, s stanjem po miokardnem infarktu brez elevacije segmenta ST pri starosti 47 let, večkratnimi implantacijami stenta in miokardnim infarktom z elevacijo ST 5 mesecev pred napotitvijo. Po drugem miokardnem infarktu se je raven kalija v serumu dvignila na 7,3 mmol/L in začele so se hude bolečine v mišicah. Bolnik je poročal tudi o paroksizmalni atrijski fibrilaciji, hiperholesterolemiji in alergiji na kontrastna sredstva. Zdravila so vključevala bisoprolol 2,5 mg dvakrat na dan, kalcijev polistiren sulfonat 15 g dvakrat na dan, natrijev hidrogenkarbonat 3 g trikrat na dan, fenprokumon, atorvastatin 40 mg qd, aspirin 100 mg qd, pantoprazol 40 mg qd, L-tiroksin 25 ug qd in klopidogrel 75 mg qd . Začasna prekinitev zdravljenja s statini ni ublažila bolečine v mišicah. Prekinitev antagonista receptorjev AT1, ki je bila na njenem režimu, kot tudi dieta z nizko vsebnostjo kalija nista povzročila izboljšanja hiperkaliemije.
Družinska anamneza je bila pomembna za sorodstvo med starši (bratranci I. stopnje), hipertenzijo pri obeh starših, smrtno kap pri njeni materi v zgodnjih 60-ih in bolezen koronarnih arterij pri očetu. Njen brat je umrl zaradi ledvične bolezni nejasnega izvora v Turčiji v svojih 50. letih (prikazano na sliki 1 a).
V času ocene je bil krvni tlak 148/87 mm Hg, srčni utrip pa 60/min. Klinični pregled je bil brez posebnosti, razen blagega edema spodnjih okončin, multiplih hematomov in striae distensae.
KLIKNITE TUKAJ ZA DOBITE ZELIŠČNO FORMULACIJO CISTANCHE ZA LEVGICE
Laboratorijska preiskava je pokazala hiperkalemijo (serumski kalij 5,3 mmol/L [normalno 3,6–4,8]), normalen serumski natrij (139 mmol/L, normalen 135–145), hiperkloremijo (107 mmol/L, normalen 95 –105), hipomagneziemija pri 0,55 mmol/L (normalno 0,73–1.00), povišan serumski kreatinin pri 1,18 mg/dL (normalno<0.90) with an estimated glomerular filtration rate of 51 mL/min (CKD-EPI [40], normal 90–140), elevated urea of 47 mg/dL (normal 21– 43), suppressed renin concentration (<1.0 pg/mL [normal 1.7–23.9]), and aldosterone of 157 pg/mL (normal 12–236). Serum calcium and phosphate were normal (2.31 mmol/L [normal 2.10–2.42] and 0.95 mmol/L [normal 0.84–1.45], respectively). Venous blood gas analysis revealed pH 7.33 (normal 7.35–7.43), standard bicarbonate 19.8 mmol/L (normal 24–30), and standard base excess −5.3 mmol/L (normal −2 to +3). Spot urinary potassium was low (6.5 mmol/L [normal 10–200]), whereas spot urinary calcium was normal (0.36 mmol/L); urinary creatinine was 24.2 mg/dL. There was no detectable albuminuria or proteinuria.
Ultrazvok ledvic je pokazal majhno desno ledvico (8,5 cm v dolžino) s tankim, nehomogenim parenhimom, sumom na brazgotinjenje in 12- mm dobro definirano okroglo cisto. Leva ledvica je bila normalne velikosti (dolžina 10 cm), z normalno debelino parenhima, 22- mm dobro definirano okroglo cisto in zapleteno 12- mm dobro definirano okroglo cisto s sumom na septum . Ni bilo dokazov o hidronefrozi.
Prisotnost hiperkalemične presnovne acidoze z neustrezno nizkim izločanjem kalija v urinu, ki ni bila pojasnjena samo s kronično ledvično boleznijo, hipertenzija z nizkim reninom in aldosteronom, ki je bil neustrezno nizek za hiperkalemijo, in krvno sorodstvo staršev so nas privedli do razmišljanja o PHA II. Uvedba zdravljenja s hidroklorotiazidom 25 mg qd je povzročila znižanje kalija v serumu na 4,2 mmol/L v 1 tednu in krvni tlak se je normaliziral. Kalcijev polistiren sulfonat in natrijev hidrogenkarbonat sta bila hitro opuščena. Začasno zmanjšanje odmerka hidroklorotiazida na 12,5 mg vsak dan je povzročilo ponoven pojav hiperkalemične acidoze. Hiponatremija se je pojavila po terapiji s hidroklorotiazidom in je izginila po dieti, bogati s soljo. Dva meseca po prvem obisku na naši kliniki so prvotno poročane bolečine v mišicah izginile. Manjša bolečina, ki je bila opisana kot drugačen značaj, je bila pripisana terapiji s statini ob prisotnosti blage CK (153 U/L, normalno<145) and LDH (250 U/L, normal <147) elevation. A review of prior therapy for hypertension revealed a regimen of valsartan plus hydrochlorothiazide (12.5 mg) prior to myocardial infarction, after which hydrochlorothiazide had been discontinued, apparently unmasking electrolyte abnormalities and causing muscle pain.
Genetska analiza
Zaradi kliničnega suma na PHA II smo izvedli PCR in Sangerjevo sekvenciranje genov KLHL3, CUL3, WNK1 in WNK4 (glej Metode). Ugotovljene niso bile nobene različice genov WNK1, WNK4 in CUL3. Vendar pa je bila homozigotna različica chr5:g.136973013 G > A (GRCh37) identificirana v genu KLHL3, kar je povzročilo missense mutacijo p.Arg431Trp (NP_059111.2), ki jo je PolyPhen predvidel kot verjetno škodljivo [41] , škodljiv s SIFT [42] in povzročitelj bolezni z MutationTaster [43] (prikazano na sliki 1b). Ta različica je prisotna enkrat v heterozigotnem stanju med 251.436 aleli v gnomAD (frekvenca alelov 4 × 10-6) [44] in enkrat v heterozigotnem stanju med 21.366 aleli v projektu ALFA (www.ncbi.nlm. nih.gov/ snp/docs/gsr/alfa/; frekvenca alelov 5 × 10-5). V dbSNP je naveden kot rs769995865 in ni bil sporočen v ClinVar. Arginin na človeški poziciji 431 je popolnoma ohranjen pri 100 vretenčarjih (http://genome.ucsc. edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=hg19&g=multiz100way, z izjemo konja, za katerega zaporedje ni na voljo), pri C. intestinalis (vazni plaščar), D. melanogaster (sadna muha) in C. elegans (črv ogorčica) (prikazano na sliki 1c). Od 41 paralognih proteinov je arginin ohranjen v 17, pri čemer nobeden od paralogov ne prikazuje triptofana na tem mestu (spletna dopolnitev, slika 1). Ugotovitev homozigotne variante v okolju krvnega sorodstva, v kombinaciji z njeno redkostjo v splošni populaciji in evolucijsko ohranitvijo prizadetega ostanka, nas je pripeljala do tega, da smo mutacijo KLHL3 p.Arg431Trp obravnavali kot kandidata za vzrok bolezni. Različica se nahaja v Kelchu podobni ponovitvi 3 (prikazano na sliki 1d). Homozigotna varianta p.Arg431Gln z identičnim ostankom je bila prej opisana pri enem posamezniku [12] (tabela 1).
Strukturna analiza
Kelchova domena (prikazana na sliki 2a) je sestavljena iz šestih "lopatic propelerja", stabiliziranih z vodikovimi vezmi med lopaticami [45]. Prejšnje simulacijske študije površinskih mutacij domene Kelch so pokazale zmanjšano interakcijo s peptidom WNK4, vendar so odkrile majhne motnje vezave Kelch-WNK4 zaradi mutacij v jedru proteina [46]. Tu smo uporabili simulacije ravnotežne molekularne dinamike, da bi določili strukturne in dinamične posledice mutacije jedra R431W. R431W je nameščen na vmesniku med tretjim (K3) in četrtim (K4) krakom propelerja, ki se nahaja neposredno pod mestom vezave WNK4- (prikazano na sliki 2a). Izračun razlike v srednjih kvadratnih nihanjih (merilo variance v strukturi proteina) med simulacijama R431W in WT je ponovljivo pokazal, da se motnje v dinamiki proteina, ki jih povzroča mutacija, širijo po celotnem proteinu, z močno povečano strukturno dinamiko na K3– K4 vmesnik in okoliško regijo K3–K5, ampak tudi zmanjšano dinamiko na bolj oddaljenih mestih (prikazano na sliki 2b). Globalni izračuni RMSD so pokazali rahlo povečanje strukturne nestabilnosti mutanta v simulacijah 1.1-µs – osredotočeni izračuni RMSD vmesnika K3–K4 (ostanki 425–465) in mesta vezave WNK4- (ostanki 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 in 577), kar kaže na motnjo terciarne strukture v mutantu R431W (prikazano na sliki 2c, e; glej spodaj).
Za nadaljnjo kvantifikacijo interakcije med rezili K3 (ostanki 425–441) in K4 (ostanki 442–465) sta bili izračunani število vodikovih vezi (h-vezi) in razdalja COM med obema skupinama. Vmesnik WT vzdržuje v povprečju sedem več h vezi kot pri mutantu R431W. R431 sam sodeluje le pri 4–5 h-vezeh – kar predstavlja ∼27 % h-vezi K3–K4 – kar kaže, da mutacija R431W moti celoten vmesnik (prikazano na sliki 2d, e). Poleg tega mutant R431W kaže povečano razdaljo COM med obema poddomenama (prikazano na sliki 2d), kar potrjuje analizo h-vezi.
Za oceno učinkov mutacije na vezavo WNK4 smo izračunali elektrostatiko veznega žepa skozi simulacijo 1.1-µs. Mutacija R431W povzroči zmerno spremembo elektrostatike veznega žepa proti negativnim napetostim (prikazano na sliki 2d). Čeprav je skromen, zmanjšan pozitivni potencial v veznem žepu ne bi bil naklonjen povezavi negativno nabitega kislega motiva WNK4.
Funkcionalna analiza
Za nadaljnje preučevanje patofiziologije, povezane s KLHL3 p.Arg431Trp, smo pridobili plazmide, ki kodirajo 3x FLAG-označen človeški WNK4 v vektorju pTRE2hyg in Halo-označen človeški KLHL3 v vektorju pFN21A [47]. Mutacijo p.Arg431Trp smo uvedli v plazmid WT KLHL3 z uporabo na mesto usmerjene mutageneze in heterologno izrazili ustrezne plazmide v celicah COS7. Pri sočasni ekspresiji WT in mutantnega KLHL3 z WT WNK4 so Western bloti s primarnimi protitelesi proti Halotagu razkrili pasove WT KLHL3. Vendar ponavljajoče se transfekcije dveh neodvisnih klonov KLHL3 p.Arg431Trp sprva niso povzročile zaznavnih pasov (relativna intenzivnost, normalizirana z ekspresijo -aktina, 0.761 ± 0.144 v WT proti {{25 }}.0{{3{{40}}}}9 ± 0.002 v str.Arg431Trp, p < { {60}}.0001, t=12.81). Ravni ekspresije WNK4, določene z anti-FLAG Western blotom, so bile znatno višje v celicah, ki sočasno izražajo KLHL3 p.Arg431Trp, kot v celicah, ki so izražajo WT KLHL3 (relativna intenzivnost, normalizirana z ekspresijo -aktina, 0,721 ± 0,137 z WT v primerjavi z 0,967 ± 0,115 z Arg431Trp , p=0.005, t=3.546). Vse vrednosti so podane kot povprečje ± SEM, primerjava pa je bila izvedena z dvostranskim t-testom razmerja, df=11 (prikazano na sliki 3a, b). Da bi ocenili, ali je bil KLHL3 p.Arg431Trp izražen v nižjih količinah, smo transfektirali naraščajoče količine (0, 0,5, 1, 2, 4 in 8 µg) WT in mutantnih plazmidov. Pri 8 µg smo opazili povečano smrtnost (podatki niso prikazani), toda z izražanjem 4 µg mutantnega plazmida smo lahko zaznali šibek pas pri pričakovani velikosti (upoštevajte daljši čas izpostavljenosti v primerjavi z WT, prikazan na sliki 3c). Da bi ocenili, ali bi lahko zmanjšana stabilnost beljakovin povzročila zmanjšane ravni izražanja mutantnega proteina, smo izvedli teste zasledovanja cikloheksimida. KLHL3 p.Arg431Trp se je razgradil hitreje kot WT (prikazano na sliki 3d).
Slika 3. Reprezentativni Western bloti celičnih lizatov, transficiranih z WNK4 in praznim vektorjem, WT ali p.Arg431Trp (R431W) KLHL3. b Škatlaste in brkaste ploskve (Turčija) s kvantificiranjem rezultatov iz 12 poskusov z uporabo dveh neodvisnih klonov vsakega plazmida. **, str=0.0046; ****, p < 0,0001 (dvostranski parni testi razmerja). c Reprezentativni Western bloti celičnih lizatov, transficiranih z naraščajočimi količinami WT ali R431W KLHL3. Upoštevajte različne čase izpostavljenosti za WT in R431W. Spodnji in zgornji HaloTag pozitivni pas lahko odražata monomer oziroma dimer KLHL3. d Reprezentativni Western bloti celic, transficiranih z 2 µg WT ali 4 µg plazmida R431W KLHL3, obdelanih s cikloheksimidom in liziranih ob navedenih časovnih točkah. Upoštevajte različne čase osvetlitve. Analiza 2 bioloških ponovitev z 2 tehničnima ponovitvama vsaka kaže zmanjšano stabilnost mutantnega proteina, normalizirano na beta-aktin in časovno točko 0 h (povprečje ± SD). Po 12 urah je prisotnega znatno manj R431W kot WT proteina (Mann-Whitneyjev test, *, p=0.029).
Razprava/Sklep
Pri starosti 58 let so bolniku, o katerem so poročali tukaj, diagnosticirali recesivno mutacijo KLHL3 pozneje v življenju kot pri katerem koli od prej prijavljenih primerov. Najstarejši bolnik, o katerem poroča literatura, je bil diagnosticiran pri starosti 56 let [15]. Vendar pa sta bili retrospektivno hipertenzija in hiperkalemija pri našem bolniku prisotni že nekaj let. Značilna hiperkalemična presnovna acidoza, povezana s PHA II, je bila verjetno prikrita z dajanjem tiazidnega diuretika. Prekinitev hidroklorotiazida po miokardnem infarktu je bila verjeten vzrok za masivno hiperkalemično acidozo, povezano z bolečino v mišicah in hipertenzijo, ki je sčasoma vodila do diagnoze PHA II. Zato predlagamo, da bi morala prisotnost hiperkalemične presnovne acidoze, ki je neustrezna za delovanje ledvic, v kombinaciji z zmanjšanim reninom vzbuditi sum na PHA II tudi pri bolnikih, starejših od 50 let. Diagnozo PHA II lahko zapletejo učinki obstoječega zdravljenja z antihipertenzivnimi zdravili, ki vplivajo na sistem renin-angiotenzin-aldosteron in lahko povzročijo lažno povišane ali nizke vrednosti renina in/ali aldosterona [48, 49]. Hiperkalemija kljub normalni hitrosti glomerulne filtracije je pogosto opisana kot značilna značilnost PHA II [6]. Čeprav je to lahko značilno za otroke, lahko pri odraslih, na primer pri bolniku, o katerem poročajo tukaj, dolgotrajna hipertenzija, nefrolitiaza in ponavljajoče se okužbe sečil vodijo do okvarjenega delovanja ledvic, kot so že poročali pri bolniku s heterozigotno mutacijo [14]. Nefrolitiaza, kot je bila pri našem bolniku, je bila opisana v PHA II [50], vendar ni pogosta ugotovitev. Zanimivo je, da razmerje med kalcijem in kreatininom v urinu pri našem bolniku ni bilo povišano (0,17 in<0.06 mmol/mmol creatinine, respectively), contrary to observations in large kindred with the WNK4 mutation and average urinary calcium of 0.85 ± 0.27 mmol/mmol creatinine [51]. Severe target-organ damage in our patient, including myocardial infarctions and CKD, emphasizes the need for early diagnosis and adequate therapy of PHA II, although hypertension and target-organ damage in our patient's parents may also point to a genetic risk independent of the homozygous PHA II mutation. To prevent delayed diagnosis, after more common causes, such as primary aldosteronism, have been excluded, genetic testing for Mendelian forms of hypertension should be considered by practitioners when patients present with low-renin hypertension in the presence of hormonal and/or electrolyte abnormalities.
Vzorci bolnikove družine niso bili na voljo za analizo; vendar pa je glede na sorodstvo zelo verjetno, da sta bila oba starša heterozigotna nosilca mutacije p.Arg431Trp. Podrobnejši podatki o pacientovem umrlem bratu niso bili na voljo. Možno je, da je tudi on trpel za PHA II, kar je povzročilo KLB, ki je bila na koncu usodna.
Možno je, da mutacija p.Arg431Trp, opažena pri našem bolniku, prepreči zvijanje Kelchove domene, kar je skladno z zmanjšano strukturno stabilnostjo mutirane domene, opažene v naših simulacijah, kjer je bila substitucija stranske verige vstavljena v že zvit protein. V skladu s tem je Western blot analiza pokazala znatno zmanjšane ravni izražanja p.Arg431Trp KLHL3 (prikazano na sl. 3a-c). Preskus zasledovanja cikloheksimida (inhibitor biosinteze proteinov) je dodatno pokazal zmanjšano stabilnost proteina p.Arg431Trp KLHL3 (prikazano na sliki 3d), podobno kot predhodna opažanja v različici p.Ser410Leu [52]. Ti podatki kažejo, da je primarna posledica mutacije p.Arg431Trp destabilizacija zvitega stanja proteina, medtem ko je zmanjšanje interakcij zvitega KLHL3 z WNK4 kvečjemu sekundarni učinek. V vsakem primeru nižje ravni KLHL3 zmanjšajo ubikvitinilacijo WNK, kar ima za posledico večjo številčnost WNK4 (prikazano na sliki 3) in domneva se, da povzročajo višjo fosforilacijo NCCT, kot tudi manjše izločanje kalija preko ROMK, kar pojasnjuje osnovno patofiziologijo.
Zahvala
Zahvaljujemo se dr. Shinichi Uchida (Tokijska medicinska in zobozdravstvena univerza) za prijazno zagotovitev plazmidov pTRE2hyg WNK4 in pFN21A KLHL3, Iani Lukianovi za podporo pri poskusih Western blot in Gabrielu Stöltingu za koristne razprave.
Izjava o etiki
Protokol raziskave je odobril Odbor za etiko Medicinske fakultete Univerze Heinrich Heine Düsseldorf (številka študije 4330), od udeleženca raziskave pa je bilo pridobljeno pisno informirano soglasje v skladu s Helsinško deklaracijo za raziskavo in objavo tega poročila o primeru. .
Izjava o navzkrižju interesov
AE, NH, BGH, JPM in TM nimajo navzkrižij interesov, ki bi jih morali prijaviti. LCR je prejemal osebne honorarje za svetovanje in nastope od Astellasa, Baxterja, Bayer-Vitala, Boehringerja, Freseniusa, Medtronica, Novartisa in Recorja, kar za časopis ni bilo pomembno. UIS je naveden kot izumitelj na patentih US 10,696,739 in 16/614,401, kar ni pomembno za dokument.
Viri financiranja
To študijo so financirali Ministerium für Kultur und Wissenschaft der Landes Nordrhein-Westfalen (Rückkehrprogramm), Stiftung Charité (BIH_PRO_406) in Nemška raziskovalna fundacija (DFG, SCHO 1386/{ {4}}; ID projekta 431984000, CRC 1453), vse za UIS Financiral ga je Deutsche Forschungsge meinschaft (Nemška raziskovalna fundacija) za JPM (MA 7525/2- 1), kot del raziskovalne enote FOR 5046 , projekt P2) in s štipendijo Interdisciplinarnega centra za klinične raziskave v okviru Medicinske fakultete Univerze RWTH Aachen (IZKF TN1- 3/IA532003). Avtorji se hvaležno zahvaljujejo za računalniški čas, ki je bil odobren prek JARA na superračunalniku JURECA v Forschungszentrum Jülich. Agencije za financiranje niso imele nobene vloge pri pripravi rokopisa.
Reference
1 Sodelovanje NCDRF. Svetovni trendi krvnega tlaka od 1975 do 2015: združena analiza 1479 populacijskih merilnih študij z 19,1 milijona udeležencev. Lanceta. 7. januar 2017; 389 (10064): 37–55.
2 Oparil S, Acelajado MC, Bakris GL, Berlowitz DR, Cifkova R, Dominiczak AF, et al. Hipertenzija. Primeri Nat Rev Dis. 22. marec 2018; 4: 18014.
3 Rimoldi SF, Scherrer U, Messerli FH. Sekundarna arterijska hipertenzija: kdaj, koga in kako presejati? Eur Heart J. 2014, maj; 35 (19): 1245–54.
4 Athimulam S, Lazik N, Bancos I. Hipertenzija nizkega renina. Endocrinol Metab Clin North Am. 2019 december;48(4):701–15.
5 Bao M, Li P, Li Q, Chen H, Zhong Y, Li S, et al. Genetski pregled za monogeno hipertenzijo pri hipertenzivnih posameznikih v kliničnem okolju. J Med Genet. 2020 avgust;57(8):571–80.
6 Healy JK. Psevdohipoaldosteronizem tipa II: zgodovina, argumenti, odgovori in še nekaj vprašanj. Hipertenzija. 2014, april; 63 (4): 648–54.
7 Paver WK, Pauline GJ. Hipertenzija in hiperkaliemija brez ledvične bolezni pri mladem moškem. Med J Aust. 1964 22. avgust; 2: 305–6.
8 Stokes GS, Gentle JL, Edwards KD, Stewart JH. Sindrom idiopatske hiperkalemije in hipertenzije z zmanjšano aktivnostjo renina v plazmi: učinki na renin v plazmi in aldosteron zmanjšanja ravni kalija v serumu. Med J Aust. 7. december 1968; 2 (23): 1050–4.
9 Arnold JE, Healy JK. Hiperkaliemija, hipertenzija in sistemska acidoza brez odpovedi ledvic so povezane s tubularno okvaro izločanja kalija. Am J Med. 1969 Sep; 47 (3): 461–72.
10 Gordon RD, Geddes RA, Pawsey CG, O'Halloran MW. Hipertenzija in huda hiperkalemija sta povezani z zaviranjem renina in aldosterona in se popolnoma odpravita z omejitvijo natrija v prehrani. Australas Ann Med. 1970 nov; 19 (4): 287–94.
Podporna storitev Wecistanche-največjega izvoznika cistanche na Kitajskem:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/telefon:+86 15292862950
Trgovina za več podrobnosti o specifikacijah:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
