Nov peptid, pridobljen-1-iz netrina, izboljša zaščito pred nevronsko smrtjo in ublaži intracerebralno krvavitev pri miših, 3. del

Skupine za zdravljenje fiziološke raztopine, TAT ali TE1 (raztopljene v fiziološki raztopini) so bile dane mišem 2 po ICH in vsak dan 5 dni z intraperitonealno injekcijo v skupnem volumnu 0.1 ml na žival. Peptide so dajali na slep način v odmerkih 12 mg/kg.

Fiziološka raztopina je običajno uporabljen fiziološki pufer, ki se pogosto uporablja v medicinskih in bioloških poskusih. Toda ali ste vedeli? Fiziološka raztopina nam lahko izboljša tudi spomin!

Prvič, fiziološka raztopina ima pomembno vlogo pri normalnem delovanju celic. Ohranja lahko normalen celični osmotski tlak in ohranja normalno morfologijo in delovanje celic. V možganih veliko število živčnih celic potrebuje fiziološko raztopino kot osnovno snov, dodatek fiziološke raztopine pa lahko spodbuja normalno delovanje možganskih celic, zagotovi dovolj kisika in hranilnih snovi za možgane in naredi možgane bolj zdrave.

Drugič, fiziološka raztopina lahko spodbuja prenos signala med možganskimi nevroni in poveča sposobnost učenja možganov. Študije so pokazale, da lahko v procesu učenja nalog vbrizgavanje fiziološke raztopine bistveno izboljša učni učinek učencev, izboljša čustveno stanje učencev, zmanjša učno tesnobo in stres. Obenem lahko fiziološka raztopina poveča tudi število nevronov in kompleksnost nevronov v hipokampusu, kar je ugodno za nastanek in ohranjanje spomina.

Poleg tega lahko fiziološka raztopina izboljša presnovno okolje možganov in zmanjša različne škodljive učinke na možgane, kot so poškodbe, lezije, ishemija in hipoksija. To so dejavniki, ki lahko poškodujejo možgane, injiciranje fiziološke raztopine lahko poveča sposobnost možganov za obvladovanje in zmanjša njihovo poškodbo, s čimer se izboljša spomin in sposobnost razmišljanja možganov.

Na splošno je fiziološka raztopina idealna snov za izboljšanje spomina. Ima lahko številne pozitivne učinke na možgane, vključno s povečanjem števila in kompleksnosti nevronov, izboljšanjem presnovnega okolja in spodbujanjem prenosa signala med nevroni. Zato bi lahko, ko moramo izboljšati svoj spomin, razmislili o vbrizgavanju fiziološke raztopine, da zagotovimo boljšo zaščito in podporo našim možganom. Vidi se, da moramo izboljšati svoj spomin, in Cistanche lahko bistveno izboljša naš spomin, saj lahko uravnava tudi ravnovesje nevrotransmiterjev, kot je povečanje ravni acetilholina in rastnih faktorjev, ki so zelo pomembni za spomin in učenje. Poleg tega lahko Cistanche izboljša pretok krvi in ​​spodbuja dostavo kisika, kar lahko zagotovi, da možgani dobijo dovolj hranil in energije, s čimer se izboljša vitalnost in vzdržljivost možganov.

Kliknite Spoznajte načine za izboljšanje spomina

4.13. Mišji model ICH, induciran s kolagenazo

Injekcija kolagenaze se običajno uporablja za indukcijo ICH [60]. Samci miši C57BL/6 (stari od 8 do 12 tednov) so bili anestezirani z izofluranom (2 do 5 %) in postavljeni na stereotaksični okvir.

Med postopkom smo telesno temperaturo vsake živali vzdrževali pri 37 ◦C s homeotermično odejo. Z uporabo stereotaksičnega instrumenta (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Shenzhen, Kitajska) in brizge (Hamilton Company, Reno, NV, ZDA), 0.3 µLof kolagenaze (0.{{12 }}45 ie; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ZDA) je bilo infundirano v desni striatum (AP: +0,2 mm; ML: -2,3 mm; DV: -3,5 mm) s pretokom 0,1 µL/min.

Skupno 0,3 µL fiziološke raztopine je bilo infundirano kontrolnim živalim. Vsi kirurški posegi so bili izvedeni v aseptičnih pogojih. V tej študiji je bilo uporabljenih več kot 66 mišjih samcev, živali pa so bile pred vsakim poskusom naključno razporejene v skupine [57].

4.14. Vedenjska analiza

Nevrološka vedenjska analiza miši po nastanku možganskega hematoma je bila odkrita s testom odstranjevanja lepilnega traku [61] in testom cilindra [60]. Preizkus zoženja lepila je bil izveden z namestitvijo lepilnega traku na območje sadilnika vsake sprednje šape (desne in leve) miši.

Vsaka miška je bila postavljena v novo kletko.

Za vsako tačko je bil zabeležen čas od trenutka, ko je bil trak nalepljen, do trenutka, ko ga je miška uspešno odstranila. Za vsako šapo je bilo dovoljenih največ 300 s. Med poskusi so bile živali nameščene v njihovih domačih kletkah v objektu brez patogenov.

Preizkus cilindra je bil izveden tako, da so miš v prozornem valju iz akrilnega stekla (premer: 8 cm; višina: 25 cm) postavili pred 2 ogledali in kamero za 5 minut. Kamera je bila postavljena na sredino pred 2 ogledali in valj, da bi dobili optimalen video.

Za oceno neodvisne uporabe sprednjih okončin sta bili ocenjeni (1) zmožnost miši, da se dotaknejo stene cilindra z eno sprednjo okončino med polno vzrejo in (2) sposobnost miši, da pristanejo samo z eno prednjo okončino na tleh po polni vzreji. Vsaj 20 kontaktnih točk za vsako sprednjo okončino je bilo preštetih s počasnim gibanjem.

Za osnovno analizo pred operacijo je bil test izveden dvakrat na miš z 1-urnim premorom med poskusi. Sprednja okončina je izražena kot razmerje med desno in levo stransko neodvisno uporabo sprednje okončine.

4.15. Analiza volumna hematoma

Da bi ugotovili, ali je zdravljenje zmanjšalo volumen hematoma, so miši žrtvovali 5 dni po ICH; možgani so bili odstranjeni in zamrznjeni v OCT. Koronalni rezi so bili narezani na debelino 30 µm in postavljeni neposredno na stekelca. Za kvantificiranje volumna hematoma so bili rezi digitalizirani na standardiziranih koronarnih ravneh.

Slepi uporabnik je izmeril konture in hematome na levi in ​​desni hemisferi v vsakem odseku. Volumen hematoma in oteklina sta bila izmerjena in izračunana s pomočjo ImageJ (NIH).

Vsaj 5 možganov na skupino je bilo podvrženih meritvam hematoma, volumen hematoma pa je bil izmerjen v vseh možganih.

4.16. Fluoro-Jade C barvanje

Nevrodegeneracijo pri miših po ICH, povzročenem s kolagenazo, so ocenili z obarvanjem s kompletom za obarvanje Fluoro-jade C Ready-to-Dilute (TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Avstralija) v skladu s protokolom proizvajalca [62].

Na kratko, kontrolne miši in miši ICH (±ip peptid) so žrtvovali 5 dni po modeliranju in možgane obdelali v skladu s protokolom, uporabljenim za imunocitokemijski poskus.

Plavajoče možganske dele smo za 5 minut potopili v 1 % raztopino natrijevega hidroksida, 2 minuti spirali v 7 0 % etanolu in nato 2 minuti spirali v destilirani vodi. Nato smo plavajoče odseke za 10 minut potopili v 0, 06% raztopino kalijevega permanganata (KMnO4 v destilirani vodi).

Sekcije so bile sprane z ddH2O, preden so bile potopljene v 0.0001% raztopino za barvanje s fluoro-žadom (fluoro-žad C v destilirani vodi) za 20 minut z nežnim stresanjem v temi.

Odseke smo sprali z ddH2O, namestili na prevlečena stekelca in čez noč sušili pri sobni temperaturi v temi. Fluoro-Jade C barvanje znotraj perihematomske regije je bilo pregledano z uporabo konfokalnega mikroskopa Zeiss LSM 880. Kvantifikacija obarvanja s fluoro-žadom je bila izvedena s programsko opremo ImageJ.

4.17. Tkivna imunofluorescenca

Imunofluorescenčno barvanje tkiv je bilo izvedeno z nizom 30-µm debelih rezov. Odseke smo inkubirali z naslednjimi primarnimi protitelesi: protitelesi mišje antiNeuN (1:500, Millipore, MAB377, Billerica, MA, ZDA) ali mišje protitelesa anti-GFAP (1:200, SigmaAldrich, G3893, St Louis, MO, ZDA) pri 4. ◦C čez noč. Po izpiranju s PBS so rezine nato inkubirali z Alexa Fluor 488-konjugiranim oslovskim protimišjim protitelesom (1:1000; Invitrogen, A21202, Carlsbad, CA, ZDA).

4.18. Test TUNEL

Za identifikacijo apoptotičnih celic z jedrsko DNAfragmentacijo v možganski perihematomski regiji so uporabili terminalno deoksinukleotidil transferazo posredovano deoksiuridin trifosfat (dUTP)nick end-labeling (TUNEL) analizo.

Barvanje je bilo izvedeno s komercialnim kompletom za testiranje apoptoze v enem koraku TUNEL (Beyotime, C1090, Nanjing, Kitajska) in izvedeno v skladu z navodili proizvajalca. Po tkivni imunofluorescenci je bila izvedena reakcija TUNEL.

Odseke možganov smo inkubirali z reakcijsko mešanico TUNEL (1 h pri 37 °C), nato pa odseke sprali s PBS in kontrastno obarvali z DAPI. Ko-lokalizacijo barvanja NeuN-TUNEL smo pregledali z uporabo konfokalnega mikroskopa Zeiss LSM 880.

TUNEL-pozitivni nevroni (NeuN pozitivni) v perihematomski regiji znotraj striatuma so bili kvantificirani s programsko opremo ImageJ na treh različnih slikah na miško, posnetih pod 20-kratnim objektivom. Kolokalizacija barvanja z GFAP-TUNEL je bila podobna kot pri barvanju z NeuN-TUNEL.

4.19. Preskus prepustnosti krvno-možganske pregrade in vivo

In Vivo so bili izvedeni testi prepustnosti krvno-možganske pregrade, kot je opisano prej [63–65]. Na kratko, kontrolnim mišim in mišim ICH (±ip peptid) smo intraperitonealno injicirali s FITC označen 4 kDa dekstran (100 µL 2 mM zaloge v PBS, Sigma Aldrich, 46944-100 MG-F, St Louis, MO, ZDA) po modeliranju 5 dni, čemur sledi anestezija 5 minut kasneje.

Po 10-minutnem času kroženja sledilnika so bile živali pripravljene za transkardialno perfuzijo in ~ 300 µl krvi je bilo zbranih iz prsne votline takoj po atrijski punkciji, čemur je sledila 3-minutna perfuzija s PBS. Hemibrain (brez vohalnih režnjev, malih možganov in zadnjih možganov) in eno samo ledvico smo zbrali in takoj zamrznili v tekočem dušiku ter shranili pri –80 ◦C.

Za merjenje fluorescence so bili vzorci odmrznjeni na ledu, stehtani in homogenizirani v PBS (400 µL za hemicebrum in 600 µL za ledvice), čemur je sledilo centrifugiranje 20 minut pri 4 ◦C in 15,000× g.

Supernatante (100 µL) in enake količine seruma (1/5 razredčitve v PBS) smo naložili v črno ploščo z 96-vdolbinicami in izmerili fluorescenco pri ustrezni ekscitaciji (490 nm)/emisiji (520 nm) ) v bralniku plošč (Tecan, Männedorf, Švica). Za odštevanje vrednosti avtofluorescence so bile uporabljene lažne živali (brez injekcije sledilca). Indeks prepustnosti (mL/g) je bil izračunan kot razmerje RFU v tkivu/g teže tkiva proti RFU v serumu/mL seruma.

4.20. Fluorescentno barvanje z lektinom

Za vizualizacijo možganskih mikrožil smo uporabili lektin Lycopersicon esculentum, konjugiran s fluoresceinom (1:200, Vector Laboratories, FL -1171, Burlingame, CA, ZDA), da smo za 1 uro potopili lebdeče dele.

Odseki so bili posneti na konfokalnem mikroskopu Zeiss LSM 880 pod objektivom 20 × in slike so bile obdelane z nastavitvijo gama 1,3. Tri slike so bile posnete iz 3 vnaprej določenih področij v perihematomski regiji koronarnih možganov živali. Zaslepljeni raziskovalec je kvantificiral žilne veje v vsakem možganu. Točka razvejanja je bila definirana kot ena sama žila, označena s fluoresceinom, ki se opazno ločuje na 2 različni in ločeni sledi žil [66].

4.21. Statistična analiza

Vsi eksperimentalni postopki so bili izvedeni na slepo in izvedeni 3-krat neodvisno, kot je opisano prej [67]. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Statistična analiza je bila izvedena z enosmerno ANOVA, dvosmerno ANOVA in Student'st-testom, kot je primerno, z uporabo GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ZDA). ) in različica programske opreme SPSS 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, ZDA).

Statistične parametre najdete v ustreznih legendah slik. Statistična značilnost je bila nastavljena na *p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.]

5. Sklepi

Domena EGF3 netrina-1 je ključna za interakcijo netrina-1 z DCC in lahko aktivira različne signalne poti. Skrajšan peptid E1 netrina-1 (ostanki 407–422) sodeluje z DCC, da zaščiti nevrone pred toksičnostjo, ki jo povzroči hemin.

Uporaba peptida E1 izboljša funkcionalno okrevanje v eksperimentalnem modelu ICH. Poleg tega lahko peptid E1 zaščiti nevrone pred degeneracijo in apoptozo po ICH.

Avtorski prispevki: Konceptualizacija, LL, Z.-XH in X.-JZ; metodologija, LL, K.-JL in J.-BC; validacija H.-LY in X.-XH; preiskava, X.-JZ; urejanje podatkov, JY; sredstva LL in Z.-XH; pisanje LL, Z.-XH in X.-JZ; nadzorstvo, Z.-XH, X.-JZ; pridobitev sredstev, Z.-XH in X.-JZ Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.

Financiranje: To raziskavo je financirala Nacionalna naravoslovna fundacija Kitajske (31671065 in 32071018), Načrt razvoja znanosti in tehnologije province Jilin (202520YY01017404).

Izjava institucionalnega nadzornega odbora: vse postopke je odobril institucionalni odbor za oskrbo in uporabo živali Northeast Normal University (NENU/IACUC, AP2016200299). Nacionalni standardi Ljudske republike Kitajske (GB/T 35892–2018), Laboratory Animal-Guideline for Ethical Review of Animal Welfare, so bili vodilo za našo oskrbo živali in protokole.

Izjava o informiranem soglasju: Ni primerno.

Zahvala: To delo sta podprla Kitajska nacionalna naravoslovna fundacija (31671065 in 32071018) in razvojni načrt znanosti in tehnologije province Jilin (202520YY01017404).

Navzkrižje interesov: Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov. Financerji niso imeli nobene vloge pri oblikovanju študije; pri zbiranju, analizah ali interpretaciji podatkov; pri pisanju rokopisa ali pri odločitvi o objavi rezultatov.

Reference

1. Kirshner, HS Zdravstveno zdravljenje intracerebralne krvavitve: Nazaj k osnovam. Int. J. Clin. Prakt. 2008, 62, 521–522 [CrossRef] [PubMed]

2. Anderson, CS; Heeley, E.; Huang, Y.; Wang, J.; Stapf, C.; Delcourt, C.; Lindley, R.; Robinson, T.; Lavados, P.; Neal, B.; et al. Hitro znižanje krvnega tlaka pri bolnikih z akutno intracerebralno krvavitvijo. N. angl. J. Med. 2013, 368, 2355–2365. [CrossRef][PubMed]

3. Qureshi, AI; Mendelow, AD; Hanley, DF Intracerebralna krvavitev. Lancet (Lond. Engl.) 2009, 373, 1632–1644. [CrossRef]

4. Drži, RF; Hua, Y.; Xi, G. Intracerebralna krvavitev: Mehanizmi poškodb in terapevtski cilji. Lancet Neurol. 2012, 11.720–731. [CrossRef]

5. Šrag, M.; Kirshner, H. Upravljanje intracerebralne krvavitve: fokusni seminar JACC. J. Am. Coll. kardiol. 2020, 75, 1819–1831 [CrossRef] [PubMed]

6. Kandasamy, R.; Idris, Z.; Abdullah, JM Kirurgija intracerebralne krvavitve. V nevrovaskularni kirurgiji Kirurški pristopi za nevrovaskularne bolezni; Juli, J., Wahjoepramono, EJ, ur.; Springer: Singapur, 2019; strani 201–210.7. Broughton,

7. Broughton, BR; Reutens, DC; Sobey, CG Apoptotični mehanizmi po cerebralni ishemiji. Stroke 2009, 40, e331–e339. [CrossRef][PubMed]

8. Kristiansen, M.; Graversen, JH; Jacobsen, C.; Sonne, O.; Hoffman, HJ; Zakon, SK; Moestrup, SK Identifikacija receptorja za odstranjevanje hemoglobina. Narava 2001, 409, 198–201. [CrossRef]

9. Madangarli, N.; Bonsack, F.; Dasari, R.; Sukumari-Ramesh, S. Intracerebralna krvavitev: komponente krvi in ​​nevrotoksičnost. Brain Sci. 2019, 9, 316. [CrossRef]

10. Deiner, MS; Kennedy, TE; Fazeli, A.; Serafini, T.; Tessier-Lavigne, M.; Sretavan, DW Netrin-1 in DCC posredujeta vodenje aksona lokalno na optičnem disku: izguba funkcije vodi do hipoplazije optičnega živca. Neuron 1997, 19, 575–589. [CrossRef]

11. Kennedy, TE; Serafini, T.; de la Torre, JR; Tessier-Lavigne, M. Netrini so difuzibilni kemotropni faktorji za komisuralne aksone v embrionalni hrbtenjači. Celica 1994, 78, 425–435. [CrossRef]

12. Flores, C. Vloga netrina-1 pri organizaciji in delovanju mezokortikolimbičnega dopaminskega sistema. J. Psychiatry Neurosci. Jpn.2011, 36, 296–310. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com