Nov peptid, pridobljen-1-iz netrina, izboljša zaščito pred nevronsko smrtjo in blaži intracerebralno krvavitev pri miših, 1. del

Povzetek:

Poročali so, da je Netrin-1 vključen v nevroprotekcijo po poškodbi centralnega živčnega sistema. Vendar ostaja minimalna funkcionalna domena Netrina-1, ki lahko ohrani nevroprotekcijo, vendar se izogne ​​večjim stranskim učinkom Netrina, nedosegljiva.

Centralni živčni sistem je eden najpomembnejših živčnih sistemov v človeškem telesu, ki nadzoruje človekovo mišljenje, občutke in dejanja. Ko je osrednji živčni sistem poškodovan, bo prizadet tudi spomin ljudi. Vendar ne skrbite, lahko uporabimo nekaj pozitivnih načinov za pomoč pri obnovi spomina.

Najprej morate razumeti vpliv poškodbe spomina. Poškodba centralnega živčnega sistema lahko vpliva na kognitivne sposobnosti ljudi, miselne procese in pozornost, kar vse neposredno vpliva na spomin ljudi. Poleg tega lahko poškodbe osrednjega živčnega sistema povzročijo tudi čustveno nestabilnost, zaradi česar so ljudje bolj nagnjeni h paniki, anksioznosti in depresiji, kar vpliva na okrevanje spomina.

Čeprav lahko poškodbe centralnega živčnega sistema povzročijo nekaj negativnih učinkov, lahko sprejmemo nekaj pozitivnih ukrepov za spodbujanje okrevanja spomina. Najprej lahko poskusimo nekaj kognitivnega treninga, kot je branje, pisanje in reševanje ugank. Te dejavnosti lahko spodbudijo možgane, da proizvedejo nove nevrone in jim pomagajo zgraditi nove spomine in načine razmišljanja.

Drugič, obnovitev spomina lahko spodbudimo tudi s telesno vadbo. Študije so pokazale, da lahko ustrezna vadba spodbudi možgane, da proizvedejo nove nevrone in nevronske povezave ter spodbudi možgansko obdelavo novih informacij. Zato nekateri med tekom ali hojo nenadoma pridejo na pamet dobra ideja ali rešijo težko težavo.

Nazadnje moramo biti pozorni na vlogo pravilnega prehranskega vnosa na spomin. Za normalno delovanje možganov so potrebna nekatera potrebna hranila, kot so beljakovine, vitamini in elementi v sledovih. Če naši hrani primanjkuje teh hranil, bo to vplivalo na naš spomin in sposobnost razmišljanja. Zato bi morali v naši prehrani izbrati nekaj živil, bogatih s temi hranili, kot so ribe, pusto meso, zelenjava in sadje.

Skratka, poškodbe osrednjega živčnega sistema bodo imele določen vpliv na spomin ljudi, vendar lahko spodbujamo okrevanje spomina z ustreznim kognitivnim treningom, telesno vadbo in nadzorom prehrane. Upam, da se bo vsak lahko pozitivno soočil z izzivi v življenju, ohranil optimističen odnos in si prizadeval obnoviti zdrav centralni živčni sistem in dober spomin. Vidi se, da moramo izboljšati spomin in Cistanche lahko bistveno izboljša spomin, saj je Cistanche tradicionalno kitajsko zdravilo s številnimi edinstvenimi učinki, med katerimi je tudi izboljšanje spomina. Učinkovitost Cistanche izhaja iz različnih učinkovin, ki jih vsebuje, vključno s taninsko kislino, polisaharidi, flavonoidnimi glikozidi itd., ki lahko na več načinov spodbujajo zdravje možganov.

Kliknite Know za izboljšanje kratkoročnega spomina

Tukaj smo raziskali nevroprotektivni učinek peptida E1, pridobljenega iz domene EGF3 Netrin-10 (ostanki 407–422). Ugotovili smo, da medsebojno deluje z izbrisanim kolorektalnim karcinomom (DCC), da aktivira fosforilacijo fokalne adhezijske kinaze, ki kaže nevroprotekcijo.

Dajanje peptida E1 je lahko izboljšalo funkcionalno okrevanje z zmanjšano apoptozo v eksperimentalnem mišjem modelu intracerebralne krvavitve (ICH).

Če povzamemo, razkrivamo funkcionalno zaporedje Netrin-1, ki je vključeno v proces okrevanja po ICH, in identificiramo kandidatni peptid za zdravljenje ICH.

Ključne besede: intracerebralna krvavitev; hemin; nevroprotekcija; Netrin-1; peptid.

1. Uvod

Intracerebralna krvavitev (ICH) je uničujoča podvrsta možganske kapi z visoko stopnjo umrljivosti in obolevnosti [1–3], ki vključuje nenormalno rupturo možganskih krvnih žil v možganih [4, 5].

Za doseganje hemostaze in zmanjšanje intrakranialnega tlaka je prednostna kirurška odstranitev hematomov [6]. Vendar pa lahko ostanki hematike in produkti razgradnje krvi še vedno spodbujajo sekundarno poškodbo možganov po ICH, povzročijo poškodbo nevronov in zakasnijo funkcionalno okrevanje [7–9].

Tako bi bil razvoj učinkovitih strategij, ki ciljajo na poškodbe nevronov, ki jih povzroči sekundarna možganska poškodba, koristen za zdravljenje možganske kapi. Netrin-1 je eden najbolj dobro raziskanih proteinov, ki uravnava aksonsko vodenje in sinaptogenezo [10–12] prek interakcije z njegovimi receptorji izbrisan pri raku debelega črevesa in danke (DCC) in UNC5H (nekoordinirani-5 homolog) za aktiviranje celičnega preživetja, diferenciacije in proliferacije [13–15].

Receptorji inducirajo signal smrti za posredovanje apoptoze, ko je netrin-1 odsoten [16]. Znano je, da vezava Netrina-1 z DCC povzroči dimerizacijo DCC in sproži fosforilacijo tirozina 861 fokalne adhezionkinaze (FAK), da inducira izraščanje nevrita in aksonsko vodenje [17,18].

Vezava Netrin-1 z DCC vključuje domeno EGF3 Netrin-1 in FN5 domeno DCC pri aktivaciji signalne poti Netrin-1 [19,20]. Pred kratkim je bilo dokazano, da ima Netrin-1 nevroprotektivne učinke v ishemičnih regijah [21].

Raven izražanja netrina-1 v serumu, ki zavira celično apoptozo in spodbuja regeneracijo nevronov, je v pozitivni korelaciji z okrevanjem bolnika po ishemični možganski kapi [22,23].

Zanimivo je, da presaditev mezenhimskih matičnih celic kostnega mozga, ki izločajo Netrin-1 v poškodovani ishiadični živec podgan, sproži regeneracijo aksonov [24] in zmanjša smrt motoričnega nevrona [25]. Stereotaksična injekcija proteina Netrin-1 v ventrikle zmanjša smrt živčnih celic po subarahnoidni krvavitvi z aktivacijo signalizacije DCC/APPL1/AKT [26].

Polipeptid, pridobljen iz domene EGF3 Netrin-1 (aminokisline 423–433), izrazito aktivira fosforilacijo ERK in spodbuja proizvodnjo NO, ki ima kardioprotektivne učinke [27,28]. Vendar pa je bil Netrin-1 identificiran kot potencialni biomarker za tumorigenezo [29–31], ker je uravnavanje statusa Netrin-1 ugotovljeno pri več rakih, ki izhajajo iz tkiv [32].

Ko je Netrin-1 vezan na svoj receptor DCC ali Unc5H, receptorji transducirajo pozitiven signal, ki vodi do preživetja, vnetja, angiogeneze in anti-apoptoze, kar nato uravnava tumorigenezo [31].

Zato je zelo pomembno identificirati minimalno funkcionalno domeno Netrina-1, ki lahko ohrani nevroprotekcijo in se izogne ​​večjim stranskim učinkom Netrina-1. Tu smo ugotovili, da peptid E1 (ostanki 407–422), ki izhaja iz domene EGF3 netrina-1, sodeluje z DCC, da zaščiti nevrone pred toksičnostjo, ki jo povzroči hemin.

V eksperimentalnem modelu miši ICH je uporaba peptida E1 izboljšala funkcionalno okrevanje, kot je bilo ugotovljeno z vedenjskimi testi. Poleg tega lahko peptid E1 prepreči degeneracijo nevronov po ICH.

Na podlagi teh rezultatov smo identificirali funkcionalno zaporedje Netrin-1, ki sodeluje pri okrevanju po ICH, in ugotovili, da se ta peptid lahko uporablja za zdravljenje ICH.

2. Rezultati

2.1. Domena EGF3 je kritična za interakcijo Netrin-DCC

Netrin-1 je sestavljen iz domene VI, treh ponovitev EGF in C-terminalne domene [33]. Kristalna struktura človeškega kompleksa Netrin-1/DCC razkriva, da je domena Netrin-1 EGF3 ključna za interakcijo Netrin-1/DCC, ne pa tudi domeni EGF1 in EGF2 [34].

Mutageneza ključnih aminokislinskih ostankov (His407, Gln442 ali Gln443) na domeni EGF3 je popolnoma prekinila vezavo Netrin-1/DCC [19]. Domene EGF1/2 so potrebne za preklop privlačne signalizacije v odbijajočo signalizacijo, ko Unc5 obstaja skupaj z DCC [20].

Tako smo najprej ustvarili konstrukte polne dolžine in EGF3-izbrisane (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 (slika 1A) in te konstrukte začasno izrazili v gojenih celicah HEK293T za GSTpulldown .

Vezavo so opazili pri konstruktih, ki izražajo Netrin-1, ne pa tudi Netrin-1(∆407–443) (slika 1C). Ti rezultati kažejo, da je domena EGF3, ki vsebuje aminokisline 407–443, odgovorna za interakcijo Netrin-1 z DCC. Da bi raziskali vlogo domene EGF3 v Netrin-DCC, smo najprej očistili myc-tagged Netrin{{12 }} ali okrnjeni Netrin-1 (∆407–443) (slika 1B).

Nato smo celice HEK293T transfektirali s plazmidom, ki je nosil DCC cDNA, in inkubirali z proteinom Netrin-1, nato pa smo z imunskim barvanjem ocenili vezavo Netrin-1.

Ugotovili smo, da se je Netrin-1 celotne dolžine, vendar ne okrnjen Netrin-1, lahko vezal na DCC na plazemski membrani (slika 1D). Da bi ugotovili, ali lahko domena EGF3 sodeluje z DCC, smo ustvarili konstrukt GST-EGF3 za odstranjevanje liziranih celic, ki prekomerno izražajo DCC. Opazili smo specifično vezavo DCC z GST-EGF3 (slika 1E).

Poleg tega smo sintetizirali s FITC označen peptid EGF3 in potrdili, da se je lahko, tako kot Netrin-1 polne dolžine, vezal na DCC na plazemski membrani (slika 1F). Naši podatki skupaj kažejo, da je domena EGF3 odgovorna za interakcijo Netrin-1 z DCC.

2.2. Domena EGF3 inducira fosforilacijo spodnjih poti netrina-1

Interakcija Netrin-1 in DCC aktivira več signalnih poti, vključno s FAK, SFK in ERK [16,35]. Fokalna adhezijska kinaza (FAK) je ena glavnih dejavnosti tirozinfosforilacije, povezana s signalizacijo Netrin-1/DCC.

Netrin-1 aktivira fosforilacijo FAK in fosforilacijo proteinskih tirozin kinaz družine Src (SFK) [17]. Tako signalni poti FAK kot SFK igrata ključno vlogo v razvojni fazi živčnega sistema in popravljanju poškodb [36,37]. Poleg tega lahko Netrin-1 aktivira z zunajceličnim signalom regulirano kinazo-1/2 (ERK1/2), ki posreduje pri delovanju poti proteinkinaze, aktivirane z mitogenom (MAPK) [38–40].

Da bi raziskali, ali je domena EGF3 kritična za aktivacijo spodnjih signalnih poti preko vezave Netrin-1 na DCC, smo najprej preučili učinek domene EGF3 na fosforilacijo tirozina 861 FAK (slika 2A) . Ugotovili smo, da je delecija EGF3 zavirala fosforilacijo FAK v kultiviranih kortikalnih nevronih (slika 2B, C), kar je potrdilo bistveno vlogo EGF3 v signalni poti Netrin-1.

Nato so kultivirane kortikalne nevrone 20 minut stimulirali s fuzijskim proteinom GST-EGF3, western blot pa je nadalje potrdil, da je zdravljenje s fuzijskim proteinom GST-EGF3 povzročilo fosforilacijo FAK, ERK in SFK (slika 2D–G).

Ti rezultati kažejo, da domena EGF3 Netrin-1 deluje kot močan stimulator za aktiviranje spodnjih signalnih poti.

Slika 1. Domena EGF3 Netrin-1 je kritična regija za interakcijo Netrin-1/DCC. (A) Ilustracije konstruktov Netrin-1. Konstrukti Netrin-1 so Netrin-1 polne dolžine, Netrin-1-(∆407–443) in GST-EGF3. (B) Očiščen netrin-1-(∆407–443)-Myc/His je bil kvantificiran s primerjavo s standardno krivuljo BSA. (C) Imunoblotiranje padajoče frakcije s fuzijskim proteinom domene GST-DCC FN5 in samim GST. (D) Imunofluorescenčne slike Flag-DCC, ki izražajo celice 293T, inkubirane s kontrolnim medijem, Netrin-1-myc/his in Netrin-1-(∆407–443) -Myc/his 30 minut, in kvantitativno analizo. Merilna lestvica, 10 µm. (E) Imunoblotiranje padajoče frakcije s fuzijskim proteinom GST-EGF3 in GST skupaj. (F) Imunofluorescenčne slike Flag-DCC, ki izražajo celice 293T, inkubirane s kontrolnim medijem in FITC označenim Pep EGF3 30 minut, in kvantitativna analiza. Merilna lestvica, 10 µm.

Slika 2. Domena EGF3 aktivira spodnje poti Netrina-1. (A) Eksperimentalni postopek. (B) Kortikalni nevroni (E17 in DIV3) so bili stimulirani z Netrin-1, Netrin-1-(∆407–443) ali kontrolnim medijem 20 min. Celične lizate smo inkubirali s protitelesom proti p-FAK-861, da potrdimo aktivnost Netrin-1. (C) Kvantitativna analiza rezultatov Western blota je prikazana v (B). n=3. (D) Kortikalni nevroni (DIV3) so bili 20 minut obdelani z 1,5 µM GST (+), 1,5 µM GST-EGF3 fuzijskega proteina (+) ali 1,5 µM Netrin-1 (+) medijem. Celične lizate smo inkubirali z anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 in anti-p-ERK-202/204. (E–G) Kvantitativna analiza western rezultati blota, prikazani v (D). n=3. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Za vse statistične analize, prikazane na tej sliki, je bila uporabljena enosmerna ANOVA (* p < 0,05, ** p < 0,01; ns, ni pomembno). Podrobnosti analize podatkov so prikazane v dodatni tabeli S1.

2.3 peptida E1 in E2 sodelujeta z DCC, da aktivirata nadaljnjo signalno pot netrina-1

Kot je bilo že opisano, je majhen peptid, pridobljen iz domene EGF3 Netrin-1 (aminokisline 423–433), povzročil fosforilacijo ERK [27]. Sintetizirali smo peptide E1 (ostanki 407–422) in E2 (ostanki 423–433), ki so bili pridobljeni iz domene EGF3 Netrin-1 (slika 3A).

Ugotovili smo, da je inkubacija peptida E1 povečala ravni fosforiliranega FAK in SFK (slika 3B, D, E) v celicah kulture na način, ki je odvisen od odmerka, vendar ni spremenila ravni fosforiliranega ERK (slika 3B, F).

Za razliko od peptidaE1, peptid E2 ni samo induciral tirozinske fosforilacije FAK (slika 3C, G) in tirozinske fosforilacije SFK (slika 3C, H), ampak je induciral tudi tirozinsko fosforilacijo ERK (slika 3C, I) v kultiviranih kortikalnih nevronih.

Kontrolni peptid (Pep Ctrl) ni imel zaznavnega učinka na fosforilacijo tirozina FAK, SFK in ERK (slika S1). Poleg tega smo opazili, da je fosforilacija komponent signalne poti FAK, inducirane s peptidom E1, odvisna od časa (slika S2). Ti rezultati kažejo, da sta E1 in E2 minimalno funkcionalna peptida Netrina-1.

Slika 3. Minimalne sekvence domene EGF3 aktivirajo spodnje poti Netrina-1. (A) Ilustracije peptidov. (B) Kortikalni nevroni (DIV3) so bili stimulirani z gradientnimi koncentracijami peptida E1. Celični lizati so bili inkubirani z anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 in anti-p-ERK-202/204. (C) Gojene kortikalne nevrone smo obdelali z gradientnimi koncentracijami peptida E2.

Lizate smo zbrali in inkubirali z navedenimi protitelesi za merjenje fosforilacije FAK, SFK in ERK. (D–F) Kvantifikacija obsega fosforilacije FAK, SFK in ERK, ki jo inducira peptid E1 v nevronih, je prikazana v (B). n=3. (G–I) Kvantifikacija obsega fosforilacije FAK, SFK in ERK, ki jo povzroči peptid E2, je prikazana v (C). n=3. (J) Kortikalni nevroni, pridobljeni iz DCC divjega tipa in homozigotnih mutantembrijev, so bili stimulirani s peptidi, pridobljenimi iz Netrin-1 ali Netrin-1-, in bili lizirani.

Dobljene lizate smo podvrgli imunoblotingu. (K) Kvantifikacija FAK PY{{0}} in ravni DCC v mutiranih nevronih DCC je prikazana v (J). n=3. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti ± SEM. Enosmerna ANOVA je bila uporabljena za vse statistične analize, prikazane na tej sliki (* p < 0,05; ns, ni pomembno). Podrobnosti analize podatkov so prikazane v dodatni tabeli S1.

Da bi ugotovili, ali je aktivacija signalne poti FAK odvisna od DCC, smo izmerili obseg tirozinske fosforilacije FAK, ki jo inducirajo ti peptidi v DCC+/+ in DCC-/- nevronih. Ugotovili smo, da oba peptida E1 in E2 nista uspela inducirati fosforilacije FAK v DCC-/- nevronih (slika 3J, K).

Ugotovili smo tudi, da se sintetizirana N-terminalno Flag-označena peptida E1 in E2 (Flag-E1 in Flag-E2) neposredno vežeta na domeno DCCFN5 (slika S3).

2.4. Peptid E1 ščiti nevrone pred s heminom povzročeno celično smrtjo in vitro

Da bi pokazali zaščito pred nevronsko poškodbo peptida E1, smo uporabili reakcijo toksičnosti, ki jo povzroči Hemin, da posnemamo sekundarno možgansko poškodbo po intracerebralni krvavitvi [41, 42].

Kulturne nevronske celice, ki izražajo GnRH (NLT) [43–45], so bile inkubirane s heminom pri različnih koncentracijah in trajanjih. Inkubacija celic NLT s heminom pri srednjem letalnem odmerku (60 µM) je povzročila časovno odvisno zmanjšanje stopnje preživetja celic, kar nakazuje, da so hemin prevzeli nevroni in ga presnovili (slika S4).

Da bi preverili, ali se je ekspresija Netrin-1 in DCC odzvala na smrt nevronskih celic, ki jo je povzročil hemin, so bile kultivirane NLT celice različno dolgo inkubirane s heminom. Rezultati Western blota so pokazali, da so se ravni izražanja Netrin-1 in DCC znatno povečale 6 ur po inkubaciji s heminom in nato postopoma upadale (slika 4A, B).

Da bi raziskali, ali sta peptida E1 in E2 zmožna oslabiti s heminom povzročeno nevronsko smrt, smo izvedli test CCK-8 z Netrin-1, PepCtrl, peptidom E1 in peptidom E2.

Ugotovili smo, da ti peptidi niso imeli zaznavnega učinka na sposobnost preživetja celic (slika 4C in slika S5). V primerjavi z inkubacijo s Pep Ctrl in peptidomE2 sta peptid E1 in Netrin-1 izboljšala nevronsko smrt, ki jo je povzročil hemin (slika 4D). Prav tako smo obarvali s kalceinom-AM in PI, da smo ločili žive in mrtve celice.

Rezultati so pokazali, da tako Netrin-1 kot peptid E1 in vitro ščitita pred smrtjo, ki jo povzroči hemin (slika 4E–G). Poleg tega je 1,5 µM peptid E1 ublažil s heminom povzročeno smrt v primarno gojenih nevronih (slika 4H, I). Skupaj so ti rezultati pokazali, da peptid E1 ščiti nevrone pred celično smrtjo, ki jo povzroči hemin.

2.5. Netrin-1-izvedeni peptid E1 spodbuja funkcionalno okrevanje po ICH

Da bi raziskali, ali ima peptid E1, pridobljen iz Netrin-1, pomembno vlogo pri funkcionalnem okrevanju po možganski kapi s krvavitvijo, smo vzpostavili eksperimentalni model ICH pri miših z injiciranjem kolagenaze, pomešane s črnilom, v striatum (slika S6A).

Po treh dneh so bile prikazane slike rezine možganov za sledenje položaju injiciranja in volumnu kolagenaze s črnilom (slika S6B, C). Miši s striatno krvavitvijo so pokazale šibkost na ipsilateralni strani zaradi možganske poškodbe (slika S7A–C).

Hematomi v striatumu po ICH so bili vidni v primerjavi z injiciranjem fiziološke raztopine (slika S7D). Relativne ravni beljakovin Netrin-1 in DCC v perihematomski skorji so bile 2. dan povečane pri miših ICH v primerjavi s kontrolnimi mišmi, Netrin-1 pa je bil 3. dan še vedno znatno višji, kar kaže, da je Netrin-1 je pomemben za okrevanje po možganski poškodbi (slika S7E, F).

Nato so miši ICH vbrizgali s FITC označen TAT-peptid E1 (FITC-Pep TE1), ki je dodal zaporedje TAT N-konca peptida E1 in pokazalo se je, da FITC-Pep TE1 prehaja krvno-možgansko pregrado ( Slika S8).

ICH in kontrolnim mišim smo intraperitonealno injicirali peptid (12 mg/kg) na dan ali enako količino fiziološke raztopine (slika 5A). Ugotovili smo, da je uporaba peptida TE1 izboljšala stopnjo preživetja in rešila okvare telesne teže po ICH (slika 5B, C).

Ugotovili smo tudi, da je bil volumen kolagenaze, izsleden z enakim razmerjem črnila v vsaki skupini, podoben, kar potrjuje, da je ta standardni ICH model kolagenaze povzročil ponovljive intrastriatalne hematome (slika 5D). Peptid TE1 je izboljšal vedenjske rezultate miši ICH v testu odstranjevanja traku (slika 5E). ) in preskus jeklenke (slika 5F).

Kot je bilo pričakovano, je peptid TE1 zmanjšal volumen infarkta po ICH (slika 5G, H). Ti rezultati skupaj kažejo, da je peptid E1 lahko zmanjšal volumen hematoma in izboljšal funkcionalno okrevanje v mišjem modelu ICH.

Slika 4. Peptid E1 ublaži s heminom povzročeno celično smrt in vitro. (A) Western blot netrina-1 in DCC v gojenih NLT celicah, izpostavljenih heminu (60 µM). (B) Kvantitativna analiza rezultatov Western blotresa je prikazana v (A). n=3. (C) Testi CCK-8 so pokazali, da serijski peptidi niso spremenili sposobnosti preživetja celic. n=4. (D) 1,5 µM Pep E1 je ohranilo viabilnost celic NLT, ko je bilo dodano precej po izpostavitvi heminu (60 µM). n=4. (E) Živi (zeleni)/mrtvi (rdeči) test NLT celic, izpostavljenih heminu (60 µM, 6 h). Lestvica, 50 µm. (F, G) Kvantitativna analiza testa živo/mrtvo v (E). n=9. (H) CCK-8testi so pokazale, da lahko Pep E1 zmanjša s heminom povzročeno celično smrt v nevronih primarne kulture. n=8. (I) Testno slikanje živih/mrtvih nevronov primarne kulture (50 µM, 6 h). Lestvica, 50 µm. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti ± SEM. Enosmerna ANOVA ali dvosmerna ANOVA je bila uporabljena za vse statistične analize, prikazane na tej sliki (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, ni pomembno). Podrobnosti o analizi podatkov so prikazane v dodatni tabeli S1.

Slika 5. Netrin-1-izvedeni peptid E1 spodbuja proces okrevanja po ICH. (A) Shema eksperimentalne paradigme intraperitonealne (IP) injekcije peptida TE1 pri ICH modeliranju miši. (B) Zabeleženo je bilo razmerje preživetja po ICH vsake skupine in uporabljena je bila Kaplan-Meierjeva metoda. n=10. (C) Telesna teža se spremeni 5 dni po ICH. n=6.(D) Mešanica kolaža/fiziološke raztopine z enakim razmerjem črnila (skupaj 0.6 µL), vbrizgana v striatum miši C57, reprezentativne slike, ki prikazujejo površino črnila, so bile podobne pri miših, zdravljenih z/ brez peptida TE1 5 dni po ICH. (E, F) IP injekcija peptida TE1 (12 mg/kg), vendar ne kontrola TAT (12 mg/kg), izboljšano vedenje, kot ga spremlja naloga odstranjevanja traku (E) ali naloga kota (F).

Fiziološka raztopina,n=10 posamezne živali; ICH, n=6 posamezne živali; ICH + TAT, n=6 posamezne živali; ICH + TE1, n=8 posamezne živali. (G) Reprezentativni odseki, obarvani s hematoksilinom in eozinom, pri miših, zdravljenih s/brez peptida TE1 5 dni po ICH. Merilna lestvica, 1 mm. (H) Kvantifikacija volumna krvavitve v možganskih delih, prikazanih v (G).

Fiziološka raztopina, n {{0}} posameznih živali; ICH, n=6 posamezne živali; ICH + TAT, n=6 posamezne živali; ICH + TE1, n=8 posamezne živali. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti ± SEM. Enosmerna ANOVA ali dvosmerna ANOVA je bila uporabljena za vse statistične analize, prikazane na tej sliki (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, ni pomembno). Podrobnosti analize podatkov so prikazane v dodatni tabeli S1.

2.6. Netrin-1-izvedeni peptid E1 zmanjša apoptozo nevronov po ICH

Raziskati osnovne mehanizme peptida E1 v procesu funkcionalne obnove ICH. Odkrili smo nevronsko degeneracijo v perihematomski regiji z barvanjem s fluoro-jade C (FJC).

Ugotovili smo, da je dajanje peptida TE1 znatno zmanjšalo število FJC-pozitivnih celic v perihematomskih regijah, kar kaže, da je pep TE1 zaviral nevronsko degeneracijo po ICH (slika 6A, B). Izvedli smo barvanje s TUNEL in ugotovili, da je peptid TE1 znatno zmanjšal število nevronov, pozitivnih na TUNEL (slika 6C, D).

Število TUNEL-pozitivnih astrocitov ni bilo zaznavne spremembe po zdravljenju s peptidom TE1 (slika 6E, F). Poleg tega smo z uporabo 4 kDa dekstrana, označenega s FITC, kot atracerja za označevanje prepustnosti krvno-možganske pregrade (BBB) ​​ugotovili, da peptid TE1 ni vplival na obnovitev prepustnosti BBB (slika S9A, B).

Ravni surovih fluorescenčnih enot (RFU) v serumu so bile podobne, kar potrjuje prisotnost vbrizganega sledilca pri vseh analiziranih živalih (slika S9C). Za označevanje mikrožil smo uporabili tudi lektin, označen s fluoresceinom, vendar nismo opazili nobenega izboljšanja po zdravljenju s TE1 (slika S9D, E). Predvsem te ugotovitve kažejo, da peptid E1 spodbuja okrevanje nevronov po ICH z zaviranjem apoptoze nevronov.

Slika 6. Netrin-1-izvedeni peptid E1 lahko ščiti pred smrtjo in degeneracijo nevronov, ne pa tudi astrocitov po ICH. (A) Reprezentativni odseki, obarvani s fluoro-jadom C, pri miših, zdravljenih z/brez TE1 5 dni po ICH. Lestvica, 50 µm oziroma 10 µm. (B) Kvantifikacija fluoro-jade C pozitivnih celic v perihematomski regiji (n=4). (C) TUNEL barvanje, ki kaže učinke TE1 na sekundarno možgansko poškodbo (SBI) 5 dni po začetku ICH. Reprezentativne slike iz skupin Saline, ICH, ICH + TAT in ICH + TE1.

Vsaka skupina je bila izpostavljena ICH, razen skupine s fiziološko raztopino. Lestvica, 50 µm oziroma 10 µm. (D) Kvantitativne analize za odstotek TUNEL-pozitivnih nevronov so prikazane v (C). n=4. (E) Kolokalizacija TUNEL z GFAP 5 dni po ICH. Reprezentativne slike iz skupin Saline, ICH, ICH + TAT in ICH + TE1. Lestvica, 50 µm oziroma 10 µm. (F) Kvantitativne analize za odstotek TUNEL-pozitivnih astrocitov so prikazane v (E). n=4. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti ± SEM.

Enosmerna ANOVA je bila uporabljena za vse statistične analize, prikazane na tej sliki (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001; ni pomembno). Podrobnosti analize podatkov so prikazane v dodatni tabeli S1.

3. Razprava

Naša študija je identificirala jedrno peptidno zaporedje Netrin-1, ki je ključnega pomena za funkcionalno okrevanje po ICH. Z interakcijo z DCC ta peptid, pridobljen iz Netrin-1-, ščiti pred nevronsko smrtjo zaradi sekundarne poškodbe po ICH in je tako obetavno zdravljenje ICH.

Terapevtska uporaba netrina-1, proteina z visoko molekulsko maso, zahteva identifikacijo minimalnega funkcionalnega zaporedja netrina-1, ki spodbuja signalizacijo navzdol. V naši študiji so bili ustvarjeni peptidi E1 (ostanki 407–422) in E2 (ostanki 423–433), ki izhajajo iz domene EGF3 Netrin-1. Ugotovili smo, da je peptid E1 (ostanki 407–422) zaščiten pred smrtjo nevronov po ICH.

Ugotovili smo, da sta se ravni izražanja netrina-1 in DCC povečali v celicah NLT po zdravljenju s heminom. Hemin se sprosti iz hemoglobina po ICH in povzroči sekundarno poškodbo celic glije in nevronov [46–48].

Poleg tega smo opazili tudi povečane ravni beljakovin Netrin-1 in DCC po eksperimentalnem ICH. Poleg tega smo opazili tudi povečane ravni beljakovin netrina-1 in DCC po eksperimentalnem ICH.

Ti rezultati so skladni s prejšnjimi rezultati, ki kažejo, da ima netrin-1 pomembno vlogo pri okrevanju po ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com