Nov pripravek humanega serumskega albumina s S-sulfhidratom zavira sintezo melanina

Kontakt:jaslyn.ji@wecistanche.com

Človeški serumski albumin (HSA) je najpogostejši protein v serumu in se pogosto uporablja kot nosilec zdravil zaradi svoje biokompatibilnosti in lastnosti dolgega zadrževanja v plazmi [14,15]. HSA vsebuje skupaj 35 ostankov Cys in eden od njih, Cys34, je prisoten v obliki proste tiolne skupine [16]. Cys34 je včasih tarča za mesto vezave zdravila zaradi svoje reaktivne tiolne skupine [17,18]. Na primer, v prisotnosti dušikovega oksida (NO) je tiolna skupina Cys34 S-nitrozirana. Prej smo dokazali, da S-nitroziran HSA (SNO-HSA) omogoča dolgotrajno zadrževanje NO v serumu [19]. SNO-HSA ima različne biološke funkcije, vključno z zaščitnim učinkom na jetra pred ishemijo/reperfuzijo [20] in učinki zaviranja tumorjev [21].

Posledično smo domnevali, da bi HSA lahko uporabili kot nosilec RSS (kot je SNO-HSA) prek S-sulfhidracije Cys34-SH. Kot vir poližvepla sta DATS in DMTS omejena zaradi svoje lipofilnosti in hlapnosti. Zato je bil v tej študiji uporabljen komercialno dostopen Na2Sn (Na2S, Na2S2, Na2S3 in Na2S4). Ogasawara et al. predhodno pripravljen serumski albumin, vezan na žveplo, reagira z natrijevim sulfidom (NaHS) s preprostim mešanjem reagentov [22]. Žveplo iz NaHS je bilo dodano Cys34 in nastali pripravek je zaščitil poškodbe jeter, ki jih povzroča lipidni peroksid. To metodo smo sprejeli za pripravo RSS-dodanega HSA z uporabo Na2Sn za dostavo RSS.

V tem delu smo poročali o pripravi HSA, obdelanega z Na2Sn, in njegovi uporabi kot novega sistema za dostavo RSS. Dodano žveplo smo analizirali s pomočjo sulfanske žveplove sonde [23] in eliminacijo sulfida iz polisulfida [24]. Za ovrednotenje učinka HSA, obdelanega z Na2Sn, na beljenje kože, so preučevali učinek HSA, obdelanega z Na2Sn, na sintezo melanina z uporabo celične linije melanoma B16.

2. Material in metode

2.1. Materiali

Humani serumski albumin (HSA) je bil kupljen pri KAKETSUKEN (Kumamoto, Japonska) in vsi vzorci HSA so bili razmaščeni z obdelavo z ogljem. Natrijev sulfid in natrijev tetrasulfid sta bila kupljena pri laboratoriju DOJINDO (Kumamoto, Japonska). Sulfanska žveplova sonda 4 (SSP4) je bila pripravljena, kot je opisano prej [23]. L-DOPA, glutation (DTNB), askorbinska kislina in natrijev satirični Griessov reagent (sulfanilamid, naftiletilendiamin-HCl) so bili kupljeni pri Nakarai Chemicals (Kyoto, Japonska). Sephadex G-25 kolona za razsoljevanje (φ 1,6 × 2,5 cm) je bila kupljena pri GE Healthcare (Kjoto, Japonska). Dulbeccov modificirani medij Eagle (DMEM) in 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) sta bila pridobljena pri Wako Pure Chemical (Osaka, Japonska). Gobja tirozinaza je bila kupljena pri Sigma-Aldrich. Vse druge kemikalije so bile najboljšega razreda, ki je bil komercialno dostopen, vse raztopine pa so bile pripravljene v deionizirani in destilirani vodi.

ekstrakt cistanche

2.2. BCA beljakovinski test

Koncentracije beljakovin so bile izmerjene s testom beljakovin BCA. 10 μL alikvote vzorcev in standarde govejega serumskega albumina (BSA) smo inkubirali v 100 μL reakcijskega pufra pri 25 stopinjah 30 minut. Po reakciji smo z čitalcem mikroplošč izmerili absorbanco pri 540 nm. BSA je bil uporabljen za izdelavo standardne krivulje.

2.3. Sinteza obdelanega z Na2Sn-HSA

HSA (300 μM) smo inkubirali z 1 mM natrijevih polisulfidov (Na2Sn) v PBS (pH 7,4) 1 uro pri 37 stopinjah. Po reakciji smo odvečne natrijeve polisulfide odstranili z gelsko filtracijo s kolono Sephadex G-25.

2.4. Določanje stopnje vezave žvepla z metodo izločanja sulfida iz polisulfida (EMSP)

EMSP smo pripravili, kot je opisano prej (3 × EMSP z dodatkom 792 mg L-askorbinske kisline v 5 ml 3 N NaOH) [24]. Vzorce (7,5 μM, 133 μL) smo inkubirali s 66,7 μL 3 × EMSP 3 ure pri 37 stopinjah. Reakcijski raztopini smo nato dodali 1-odstotno raztopino cinkovega acetata (600 μL), čemur je takoj sledilo vrtinčenje. Vzorce centrifugiramo pri 8,000×g 5 minut in dvakrat speremo s fosfatnim pufrom (PBS). Po odstranitvi supernatantov smo oborini dodali deionizirano in destilirano vodo (200 μL). Po dodatku 1 odstotka cinkovega acetata (300 μL), 50 μL 20 mM N,N-dimetil-p-fenilendiamina in 20 mM FeCl3 v 7,2 N HCl smo raztopino inkubirali 30 minut pri 25 stopinjah. Vzorce smo centrifugirali pri 8000 × g 1 minuto in jih prenesli v 96-plošče z vdolbinicami in izmerili OD pri 665 nm. Za izdelavo standardne krivulje smo uporabili Na2S.

2.5. Odkrivanje sulfanskega žvepla s SSP4

Vsak vzorec (20 μM) smo inkubirali s 5 μM SSP4 v 1 mM cetiltrimetilamonijevem bromidu/PBS (pH 7,4) 10 minut pri 25 stopinjah. Po inkubaciji je bila fluorescenca izmerjena s spektrofotometrom (JASCO Corporation) z vzbujanjem pri 457 nm, emisija pri 490–535 nm.

2.6. DPPH radikalni testi

DPPH (250 μM) v etanolu smo zmešali z enako količino MES pufra (50 mM, pH 7,4). K tej raztopini DPPH je bil dodan HSA, obdelan z Na2Sn (40 μM), ki je bil nato inkubiran 30 minut pri 25 stopinjah in absorbanca radikalov DPPH je bila izmerjena pri 540 nm. Stopnje počiščenih radikalov so bile pretvorjene z naslednjo formulo;

Prečiščeni radikal (odstotki)=(Abssample-Abspbs)/ Abspbs × 100

2.7. Analiza NO in SNO

HSA, obdelan z Na2Sn (50 μM), smo 30 minut inkubirali z darovalcem NO, NOC7 (200 μM), 30 minut pri 25 stopinjah. Po reakciji smo koncentracijo NO in SNO izmerili z Griessovim testom z manjšimi modifikacijami [25]. Raztopino Griessovega reagenta smo pripravili z mešanjem 0,1 odstotka N-1- naftiletilen-diamid dihidroklorida in 1 odstotka sulfanilamida v 2 odstotkih fosforne kisline. Reakcijski pufer je bil sestavljen iz 0,1 M NaCl, 0,5 mM DTPA in 10 mM AcONa・AcOH (pH 5,5). Vzorce (20 μM) smo reagirali z raztopino Griessovega reagenta (60 μL) v reakcijskem pufru (110 μL) s 3 mM HgCl2 v 10 mM Na acetatu (pH 5,5). Po 15-minutni inkubaciji smo z bralnikom mikroplošč izmerili absorbanco 540 nm. Preostalo razmerje NO/SNO (v odstotkih) je bilo izračunano in primerjano z vrednostmi PBS za vzorce.

2.8. Kultura celic

Celice melanoma B16 je zagotovila japonska banka za raziskave raka (JCRB, Tokio, Japonska) in so bile gojene v DMEM, ki je vseboval 10-odstotni fetalni goveji serum in raztopino antibiotikov. Celice smo gojili pri 37 stopinjah v vlažnem zraku, ki je vseboval 5 odstotkov CO2 v inkubatorju (št. prehoda 10–20).

2.9. Proizvodnja melanina

Celice melanoma B16 so bile posejane v plošče s 24 vdolbinicami pri koncentraciji 2,5×104 celic/vdolbinico in 24 ur gojene pod 5 odstotki CO2 pri 37 stopinjah. Vzorci so bili obdelani z 0,4 mM tirozina in 10 mM NH4Cl v DMEM, ki je vseboval 10 odstotkov FBS in nato inkubirani pod 5 odstotki CO2 pri 37 stopinjah 72 ur. Po inkubaciji smo celice dvakrat sprali s PBS in raztopili v 1 N NaOH (200 μL). Po 2 urah inkubacije pri 60 stopinjah smo izmerili absorpcijo (405 nm) s pomočjo čitalca mikroplošč.

Cistanche zavira nastajanje melanina.

2.10. UV sevanja

Za obsevanje vzorcev na razdalji 5 cm od plošče z vdolbinicami smo uporabili ročno UV žarnico. Ta UV-žarnica zagotavlja UV-intenzivnost 614 oziroma 743 μW/cm2 s sevanjem 254 nm oziroma 365 nm z razdalje 5 cm.

2.11. Lovilna aktivnost HSA, obdelanega z Na2S4-, proti intracelularnim ROS, NO, RSS

ROS in NO v celicah melanoma B16 smo izmerili z vsako od fluorescenčnih sond, CM-H2DCF-DA oziroma DAF-FM-DA. Celice melanoma B16 smo zasejali v 96-plošče z vdolbinicami pri koncentraciji 1 × 104 celic/vdolbinico in gojili pri 37 stopinjah, 5 odstotkih CO2 24 ur. Po kultivaciji smo medij odstranili in nadomestili s CM-H2DCF-DA (5 μM) ali DAF-FM-DA (10 μM) v PBS. Sonde so prevzele celice z inkubacijo pri 37 stopinjah 30 minut. Po reakciji smo odstranili supernatante, vzorce razredčili v PBS in takoj izmerili fluorescenco. Celice smo obsevali z UV žarnico 15 minut. Po obsevanju smo izmerili intenzivnost fluorescence (npr. 485 nm, em. 535 nm) s bralnikom fluorescenčnih mikroplošč.

2.12. Aktivnost gobove tirozinaze in agregacija melanina

Raztopini tirozinaze in L-DOPA smo pripravili v PBS (pH 7,4) neposredno pred testom. Tirozinazo, izolirano iz gob, smo uporabili za preučevanje inhibitorne aktivnosti HSA, obdelanega z Na2Sn. 20 μL delež gobje tirozinaze (537 U/mL) in 100 μL z Na2Sn obdelanega HSA (40 μM) smo dobro premešali s PBS (60 μL) v ploščah s 96 vdolbinicami in dodali 20 μL L-DOPA (5 mM). nato dodal. Po 30 min inkubacije smo analizirali raven sintetiziranega melanina z merjenjem OD 490 nm. Za testiranje agregacije melanina smo mešanico centrifugirali pri 20,000 g, 15 minut 3 ure. Bela puščica prikazuje agregirani material. Neagregiran melanin v supernatantu je bil izmerjen pri OD 490 nm.

2.13. Varnostni testi

Krema za lokalno uporabo, uporabljena v tej študiji, je bila pripravljena z mešanjem vode (30 ml), jojobinega olja (15 ml) in 5 g emulgirajočega voska pri 60 stopinjah. Po ohlajanju smo z Na2S4-obdelano HSA (20 μM) in nastalo suspenzijo dobro premešali. Preskus draženja kože je bil opravljen v skladu s smernicami za testiranje OECD 439 z uporabo LabCyte Epi-Model (3D model gojene človeške kože).

2.14. Statistična analiza

Statistična pomembnost zbranih podatkov je bila ovrednotena z analizo ANOVA, ki ji je sledila Newman-Keulsova metoda za več kot 2 srednji vrednosti. Razlike med skupinama smo ovrednotili s Studentovim t-testom. P < 0.05="" je="" veljalo="" za="" statistično="">

3. Rezultati

3.1. Priprava S-sulfidiranega HSA

HSA, obdelan z Na2Sn, je bil pripravljen iz HSA, ki je bil inkubiran z Na2Sn in podvržen gelski filtraciji po reakciji. Za oceno količine sulfanskega žvepla v vzorcu smo uporabili EMSP, novo kvantitativno metodo, ki smo jo predhodno razvili [24]. Zato je bil HSA, obdelan z Na2S4-, pripravljen iz HSA in Na2Sn tako, da so reagenti pustili reagirati 1 uro pri 37 stopinjah. Pustili smo, da so različne količine natrijevih polisulfidov reagirale s HSA. Nato smo vzorce HSA inkubirali z raztopino EMSP, ki smo jo pripravili ob uporabi, 3 ure pri 37 stopinjah. Na podlagi analiz EMSP se je stopnja S-sulfidracije povečala neodvisno od količine žvepla (slika 1A). Po drugi strani pa je, kot je prikazano na sliki 1B, obdelava z Na2S3- ali Na2S4-izboljšala intenzivnost fluorescence SSP4 (fluorescenčna sonda za sulfansko žveplo) v primerjavi z Na2S- ali Na2S{{24 }}zdravljenja, kar kaže na to, da je SSP4 morda reagiral s polisulfidom proteina na nelinearen način (slika 1B).

3.2. Antioksidativni in NO supresivni učinek HSA, obdelanega z Na2S

Domnevali smo, da bi HSA, obdelan z Na2Sn, zaviral proizvodnjo melanina zaradi svoje antioksidativne aktivnosti. Zato je bil izveden test radikalov DPPH [26, 27] za analizo antioksidativne aktivnosti in vitro. Posledično je imel HSA, obdelan z Na2Sn, znatno višjo koncentracijo dodanega žvepla (slika 2A). Da bi pojasnili učinek NO, smo NOC7 (donor NO) soinkubirali s HSA, obdelanim z Na2S4-, pri 25 stopinjah. Po 30-minutnem obdobju inkubacije je bila koncentracija preostalega NO kvantificirana z Griessovim testom. Kot je razvidno iz zaprtih stolpcev na sliki 2B, je HSA, obdelana z Na2S4-, odstranila znatno več NO v primerjavi s kontrolo in HSA (slika 2B). Znano je, da elementarno živo srebro (Hg) zmanjšuje SNO in sprošča NO2-. Ko smo raztopini HSA, obdelanega z Na2S4-, dodali Hg, se je sprostil NO2-, kar nakazuje, da je bil HSA, obdelan z Na2S4-, počiščen s S-nitrozacijo.

3.3. Učinek zaviranja melanina HSA, obdelanega z Na2Sn

Celice melanoma miši B16 smo gojili in sintezo melanina pospešili z dodajanjem tirozina v medij. Kot je prikazano na sliki 3, je HSA, obdelan z Na2Sn, zaviral sintezo melanina, inhibicija pa je bila odvisna od vsebnosti žvepla. Celične slike celic melanoma B16 po nanosu HSA, obdelanega z Na2Sn, so tudi pokazale, da je HSA, obdelan z Na2Sn, zmanjšal razmerje proizvodnje melaninapozitivnih celic (slika 3).

3.4. Antioksidativni učinek HSA, obdelanega z Na2S4- z UV obsevanjem

Da bi preverili, ali je HSA, obdelan z Na2Sn, zaviral tvorbo z UV povzročenimi ROS ali NO, je bil opravljen test oksidativnega stresa z uporabo celic melanoma B16 kot modelov. Proizvodnja ROS s HSA, obdelanim z Na2S4-, v celicah melanoma B16 z obsevanjem z 2 različnima UV napravama 15 minut je bila izmerjena s CMH2-DCF-DA. Ugotovitve kažejo, da je HSA, obdelan z Na2S4-, povzročil znatno zmanjšanje fluorescence CMH2-DCF-DA na PBS in HSA z obsevanjem pri 254 nm in 365 nm (slika 4AB). Nasprotno pa je HSA, obdelan z Na2S4-, prav tako zaviral proizvodnjo NO v celicah melanoma B16 z obsevanjem z 254 nm UV (slika 4CD). Ti rezultati kažejo, da HSA, obdelana z Na2Sn, zavira sintezo melanina z zaviranjem ROS in NO, ki nastajata z UV obsevanjem.

3.5. Neposredno zaviranje agregacije tirozinaze in melanina s HSA, obdelanim z Na2Sn

Znano je, da nekatera komercialna sredstva proti melaninu neposredno zavirajo aktivnost tirozinaze. Tako smo testirali, ali je HSA, obdelan z Na2Sn, spremenil aktivnost tirozinaze. Ugotovitve so pokazale, da je HSA, obdelan z Na2Sn, zaviral gobovo tirozinazo v večji meri kot neobdelan HSA (slika 5A). Ko nastane, se melanin hitro podvrže agregaciji in inducira nastanek medule [28]. Zato smo nato obravnavali vprašanje, ali HSA, obdelan z Na2Sn, zavira agregacijo melanina. Posledično, ko sta bili tirozinaza in L-DOPA inkubirani skupaj 3 ure, so melaninski pigmenti postali agregirani, vendar je HSA, obdelan z Na2Sn, preprečil agregacijo (slika 5B). Po eni strani je bilo tudi ugotovljeno, da HSA zavira agregacijo, kar kaže, da lahko sam HSA prepreči vezavo L-DOPA na tirozinazo.

3.6. Varnostni test HSA, obdelanega z Na2Sn, z uporabo 3D gojene človeške kože

Preskusi draženja kože za HSA, obdelano z Na2S4-, so bili izvedeni z uporabo 3D gojenih človeških kožnih celic v skladu s smernicami OECD. Posledično se število preživelih celic ni zmanjšalo s HSA, obdelanim z Na2S4-, z/brez uporabe lokalne kreme (slika 6A). Uporaba kompleta za odkrivanje citotoksičnosti LDH je tudi pokazala, da HSA, obdelan z Na2S4-, ni poškodoval kožnih celic (slika 6B). Ti podatki so pokazali, da je HSA, obdelan z Na2Sn, zelo varen za uporabo na človeški koži pod koncentracijami, preučenimi v tej študiji.

4. Razprava

Melanin se sintetizira z oksidacijo tirozina. Tirozin se z delovanjem tirozinaze oksidira v L-DOPA in nato v dopakinon. Dopakinon se spontano oksidira v melanin. Melanin spodbuja nastanek črnih pigmentov in peg, igra pa tudi vlogo pri zaščiti kože pred poškodbami zaradi UV-sevanja. V človeški koži melanociti proizvajajo ROS in NO, ko jih stimulira UV-sevanje [2,29,30]. ROS spodbuja sintezo melanina z aktiviranjem tirozinaze z delovanjem ATP sintaze, fenilalanin hidroksilaze in fosforilacijo MAPK [31, 32]. NO aktivira tirozinazo s povečanjem celične ravni cGMP [6]. Zato se ROS in NO čistilci štejejo za sredstva proti melanogenezi. Tukaj smo raziskali učinek HSA, obdelanega z Na2Sn, proti sintezi melanina. HSA, obdelana z Na2Sn, je močno zavirala celične ravni ROS in NO, ki jih proizvaja UV sevanje (slika 4). Poleg tega je imel HSA, obdelan z Na2Sn, neposreden učinek na zaviranje delovanja tirozinaze (slika 5A) in agregacije melanina (slika 5B). Nismo mogli razjasniti mehanizma, kako se je sulfansko žveplo preneslo iz HSA, obdelanega z Na2Sn, v celico. Zato ostaja narava tega, kako neposredni učinki delovanja HSA, obdelanega z Na2Sn, nejasna. Yamashita idr. je dokazal, da se dopakinon veže na tiolne proteine ​​preko cisteinskih ostankov [33]. Skupaj lahko zaviranje agregacije melanina s HSA in HSA, obdelanim z Na2Sn, vključuje tudi tvorbo disulfidnih vezi z dopakinonom ali melaninom. Po drugi strani pa je bila inhibicija tirozinaze odvisna od vsebnosti dodanega žvepla (slika 5A). Znano je, da GSH veže tirozinazo in zmanjša njeno aktivnost [34]. Ker ima S-sulfhidrirani cistein močnejšo reaktivnost kot običajni cistein [11], lahko glutation persulfid (GSSH) zavira delovanje tirozinaze bolj kot GSH. V prihodnosti so potrebne nadaljnje študije o tem, ali HSA, obdelan z Na2Sn, poveča znotrajcelični GSSH.

ROS nastajajo zaradi UV-obsevanja ali zunanjega stresa, ki povzroča znake staranja, ne samo v obliki sinteze melanina, temveč tudi zaradi pojava gub in povešene kože, ki jih povzroča poškodba DNK in tvorba zamreženega kolagena. Znano je tudi, da so ROS oteževalni dejavnik pri različnih vrstah vnetij, kot so mozolji in psoriaza. Različna sredstva za beljenje kože, kot sta traneksamična kislina [35] in arbutin [36], so bila zasnovana za reševanje teh težav. Vendar te spojine le zavirajo sintezo melanina in ne vplivajo na oksidativni stres. Tako so ostala tveganja za toksičnost, ki jo povzroča ROS. Prednost uporabe HSA, obdelanega z Na2Sn, je, da učinkovito čisti ROS (sliki 2 in 4).

Vodikov sulfid so preučevali kot tretjo bistveno molekulo za dušikovim oksidom in ogljikovim monoksidom. Terapevtski učinki vodikovega sulfida so se izkazali za uporabne pri zdravljenju ishemije/reperfuzije [37], ateroskleroze [38], sepse [39] in toksičnosti, ki jo povzroča prehrana z visoko vsebnostjo maščob [40]. Poleg tega ima hidropersulfid večjo aktivnost kot vodikov sulfid. Na primer, Na2S4 učinkovito razstruplja metilno živo srebro in zavira diferenciacijo celic nevroblastoma, medtem ko Na2S tega ne počne [12,41]. Zato ni možen samo učinek beljenja kože, ampak tudi drugi pozitivni učinki HSA, obdelanega z Na2Sn.

Na koncu smo poročali o razvoju novega sistema za dostavo RSS, ki uporablja serumski albumin kot stabilen nosilec. Reaktivno žveplo je imelo v kombinaciji s HSA močnejši antioksidativni učinek kot HSA in je zaviralo sintezo melanina v celicah melanoma. Mehanizem anti-melanogeneze ne vključuje le odstranjevanja ROS in NO, temveč tudi zatiranje aktivnosti tirozinaze in agregacije melanina. Zato ima HSA, obdelan z Na2Sn, velik potencial za uporabo kot varno sredstvo za beljenje kože.

To je naš izdelek.

Za več informacij kliknite na sliko.