Akutni od odmerka odvisni nevroprotektivni učinki poli(pro-17 estradiola) pri mišjem modelu poškodbe hrbtenice

Povzetek

17 -Estradiol (E2) zagotavlja nevroprotekcijo v predkliničnih modelih poškodbe hrbtenjače, če se daje sistemsko. Cilj te študije je bil lokalno nanesti E2 na poškodovano hrbtenjačo za dolgo časa z uporabo poli(pro-E2) filmskih biomaterialov.

Ko ljudje izvemo več o poškodbah hrbtenjače, se začenjamo zavedati vpliva, ki ga imajo na fizično in duševno zdravje ljudi. Čeprav lahko poškodbe hrbtenjače povzročijo številne škodljive učinke, je njihov vpliv na spomin na srečo mogoče nadzorovati.

Najprej moramo razjasniti, kaj je poškodba hrbtenjače. Hrbtenjača je živec, zaščiten v hrbtenici, ki je odgovoren za prenos navodil iz možganov v različne dele telesa. Če je hrbtenjača poškodovana, bodo nekateri deli telesa izgubili dobro povezavo z možgani, kar ima za posledico prizadeto gibanje okončin, občutke in avtonomni nadzor.

Poškodbe hrbtenjače imajo lahko določen vpliv na spomin ljudi, zlasti v zgodnjih fazah rehabilitacije bolnikov s poškodbo hrbtenjače. Poškodbe hrbtenjače lahko povzročijo poslabšanje pozornosti, delovnega spomina in zmožnosti čustvenega procesiranja, kar bo vplivalo na sposobnost pomnjenja osebe.

Vendar pa se bodo ti negativni učinki postopoma zmanjšali, ko bodo bolniki deležni rehabilitacijskega zdravljenja. Pacienti lahko izboljšajo svoj spomin s sodelovanjem v spominskih igrah in drugem kognitivnem treningu. Obenem fizična rehabilitacija prispeva tudi k ponovni vzpostavitvi motoričnih in senzoričnih funkcij telesa ter s tem izboljšanju čustvenih in kognitivnih funkcij.

Bolnike s poškodbo hrbtenjače moramo spodbujati, da aktivno sodelujejo pri rehabilitacijskem zdravljenju in vztrajajo pri rehabilitacijskem usposabljanju za izboljšanje telesnega in duševnega zdravja. Verjemite, da lahko bolniki s pomočjo pravilne kognicije in pooperativnega zdravljenja premagajo vpliv poškodbe hrbtenjače na spomin in nadaljujejo aktivno življenje. Vidi se, da moramo izboljšati spomin in Cistanche lahko bistveno izboljša spomin, saj lahko Cistanche uravnava tudi ravnovesje nevrotransmiterjev, kot je povečanje ravni acetilholina in rastnih faktorjev, ki so zelo pomembni za spomin in učenje. Poleg tega lahko Cistanche izboljša pretok krvi in ​​spodbuja dostavo kisika, kar lahko zagotovi, da možgani dobijo dovolj hranil in energije, s čimer se izboljša vitalnost in vzdržljivost možganov.

Kliknite poznajte dodatke za izboljšanje spomina

Po kontuzivni poškodbi hrbtenjače pri odraslih samcih miši so subduralno implantirali poli(pro-E2) filme in nevroprotekcijo ocenili z imunohistokemijo 7 dni po poškodbi in implantaciji. V teh študijah so poli(pro-E2) filmi skromno izboljšali nevroprotekcijo, ne da bi vplivali na vnetni odziv v primerjavi s poškodovanimi kontrolami.

Za povečanje sproščenega odmerka E2 so poli(pro-E2) filme, ki sproščajo bolus, izdelali z vključitvijo nevezanega E2 v poli(proE2) filme.

Vendar pa v primerjavi s kontrolnimi poškodovanci poli(pro-E2) filmi, ki sproščajo bolus, niso bistveno izboljšali nevroprotekcije ali omejili vnetja niti 7 niti 21 dni po poškodbi. Prihodnje delo se bo osredotočilo na razvoj poli(pro-E2) biomaterialov, ki so sposobni natančneje sproščanje terapevtskih odmerkov E2.

UVOD

Travmatska poškodba hrbtenjače (SCI) je izčrpavajoče stanje, ki vsako leto prizadene več kot 18000 ljudi v Združenih državah Amerike1, medtem ko je globalna razširjenost SCI ocenjena na med 236 in 1009 na milijon.2

Bolniki, ki jih prizadene SCI, imajo hude nevrološke pomanjkljivosti, vključno z izgubo občutka, oslabljenim delovanjem črevesja/mehurja in paralizo.3,4 Primarni vpliv na hrbtenjačo povzroči smrt nevronov na mestu poškodbe, ki jo dodatno poslabša več kaskad sekundarnih poškodb, ki vključujejo astrocite in makrofage .

Sčasoma ti astrociti tvorijo glialno brazgotino, ki preprečuje razširitev aksonov preko roba lezije.5 Do danes ni nevroprotektivnih zdravil, ki bi jih odobrila FDA, za zdravljenje SCI.

Raziskave, ki trajajo več desetletij, so se osredotočile na sistemsko dajanje biomolekul za preprečevanje izgube nevronov zaradi sekundarne poškodbe in/ali za spodbujanje regeneracije aksonov, kar na koncu vodi do ponovne vzpostavitve izgubljene funkcije.6 Ena biomolekula, ki je pokazala veliko obetavnost v predkliničnih modelih SCI, je ženska spolni hormon, 17 -estradiol(E2).

Dajanje E2 je na splošno koristno za centralni živčni sistem z zmanjšanjem vnetja, 7–9 lajšanjem reaktivnosti glialnih celic, 10 omejevanjem oksidativnega stresa 11–14 in blaženjem ekscitotoksične nevronske smrti, ki jo povzroča glutamat.15 E2 izboljša funkcionalno okrevanje pri različnih modelih SCI pri glodavcih. 16,17 Zanimivo je, da sistemsko dajanje večkratnih odmerkov E2 hitreje povzroči funkcionalno okrevanje 18,19 v primerjavi z živalmi, ki so prejele le en odmerek.17

Ker E2 učinkoviteje spodbuja funkcionalno okrevanje s shemami večkratnih odmerkov, je bil naš cilj stabilno sproščanje E2 lokalno na mestu poškodbe (da preprečimo kakršne koli neciljne učinke), da bi se izognili težavam, ki izhajajo iz večkratnih odmerkov/sistemskih injekcij E2.

V ta namen smo uporabili strategijo poli(predzdravila) biomateriala, v kateri je bilo nativno zdravilo (E2) najprej funkcionalizirano z reaktivnimi alilnimi skupinami in nato polimerizirano preko fotoiniciirane tiol-enske radikalne adicije s fleksibilnim oligo-(etilenglikol) ditiolom, kot je opisano prej .20 Dobili smo polimerne verige z visoko molekulsko maso, ki so sestavljene iz predzdravila E2 kot ponavljajoče se enote v polimeru.

Po hidrolitični razgradnji polimer postopoma sprošča E2 v okoliški medij. Edina druga stranska produkta sproščanja sta ogljikov dioksid in oligo(etilenglikol) (oEG) (slika 1). Poli(pro-E2) verige, izdelane v filme ali mikrovlakna, lahko sproščajo E2 v nanomolarnih koncentracijah in vitro v časovnem obsegu od mesecev do let. .20

E2, ki se sprosti iz teh poli(pro-E2) ogrodij, je bioaktiven in ta ogrodja spodbujajo nevrotrofizem in nevroprotekcijo in vitro z zaščito nevronov pred oksidativnim stresom, ki ga povzroči vodikov peroksid. Tu smo uporabili poli(pro-E2) filme v mišjem modelu kontuzijskega SCI, takoj po poškodbi, in ocenili njihovo nevroprotektivno sposobnost in vivo.

Naša začetna zasnova poli(pro-E2) filma je akutno povečala nevroprotekcijo (7 dni po poškodbi) na mestu poškodbe, ne da bi vplivala na vnetni odziv. Ker poli(pro-E2) filmi sproščajo nanograme E2 na dan, smo razvili drugo strategijo sproščanja, kjer je bil nevezani E2 vključen v poli(pro-E2) matriko. Domnevali smo, da lahko bolusno sproščanje nevezanega E2 zagotovi dodatne nevroprotektivne koristi.

Poli(pro-E2) filmi so sproščali E2 na način eksplozije, čemur je sledilo podaljšano sproščanje E2 iz polimera pri nižjih koncentracijah. Imunohistološko obarvanje je ocenilo nevrone, astrocite in makrofage/mikroglijo, prisotne na mestu poškodbe akutno (7 dni po poškodbi) in kronično (21 dni po poškodbi) po SCI v prisotnosti teh poli(pro-E2) filmov, ki sproščajo bolus.

REZULTATI IN RAZPRAVA

Poli(pro-E2) filmi sproščajo E2 v nanomolarnih koncentracijah, spodbujajo nevronsko rast iz dorzalnega koreninskega ganglija in ščitijo nevrone pred oksidativnim stresom, povzročenim z vodikovim peroksidom in vitro.20 Tukaj predstavljena študija želi ugotoviti sposobnost poli(pro-E2) filme za zagotavljanje nevroprotekcije in vivo z uporabo mišjega modela kontuzije SCI.

Zmerno kontuzijsko SCI je bilo povzročeno pri odraslih samcih miši in takoj po poškodbi so bili poli (pro-E2) filmi nameščeni neposredno nad poškodbo (slika 2A). Da bi zagotovili, da so poli(pro-E2) filmi ostali na mestu po implantaciji, so bili poli(pro-E2) filmi, napolnjeni z rodaminom B, implantirani v hrbtenjače poškodovanih živali. Sedem dni po implantaciji so bile hrbtenjače zbrane in posnete s svetlobnim mikroskopom (slika 2B). Pri vseh živalih so implantirani poli(pro-E2) filmi, napolnjeni z rodaminom B, ostali na mestu, kar je potrdilo implantacijski protokol.

Da bi preizkusili sposobnost poli(pro-E2) filmov, da zagotovijo nevroprotekcijo in ublažijo vnetje, so bili poli(pro-E2) filmi (brez rodamina B) implantirani po poškodbi hrbtenice, hrbtenjače pa so bile zbrane 7 dni po poškodbi in implantaciji. Vzdolžni rezi (debeline 10 μm) so bili odrezani, centrirani okoli epicentra poškodbe in imunsko označeni za vizualizacijo nevronov in makrofagov v hrbtenjači (slika 3).

Odseki so bili označeni za NeuN, da bi ocenili prisotnost nevronov, in kvantitativna analiza obarvanja je pokazala, da so poli(pro-E2) filmi znatno povečali pozitivno območje NeuN okoli epicentra poškodbe v primerjavi s poškodovanimi kontrolnimi osebami, ki niso prejele filmskih vsadkov (slika 3A; p=0.0002). Dodatno obarvanje aksonov z uporabo NFH (težka veriga nevrofilamentov) je razkrilo tudi akutni nevroprotektivni učinek implantiranih poli(pro-E2) filmov (slika 3B; p=0.0017).

Opazili smo, da ta sprememba nevroprotekcije ni posledica spremembe apoptoze (kaspaza 3) na mestu poškodbe (podporna slika S1; p=0.9966). Barvanje za aktivirane makrofage (CD68) tudi ni razkrilo pomembne razlike med živalmi, zdravljenimi s poli(pro-E2) filmom, in nezdravljenimi živalmi (slika 3C; p= 0.7207).

Skupaj filmi poli(pro-E2) zmerno akutno povečajo nevroprotekcijo, ne da bi spremenili vnetni odziv. Filmi poli(pro-E2) so akutno povečali gostoto nevronov za skoraj 20 %, vendar filmi niso imeli očitnih protivnetnih učinkov (na podlagi kvantifikacije območje, ki ga zasedajo aktivirani makrofagi) (slika 3).

To pomanjkanje zmanjšanja vnetja lahko kaže na to, da so protivnetni in nevroprotektivni odmerki E2 različni in da oboje ni bilo doseženo s trenutno filmsko formulacijo.20 Domnevali smo, da lahko povečanje sproščanja E2 iz poli(pro-E2) filmov akutno zmanjša vnetje in omogoči močnejši nevroprotektivni odziv.

Za povečanje akutno sproščenega odmerka E2 so bili poli(pro-E2) filmi spremenjeni tako, da bi do bolusnega sproščanja E2 prišlo takoj po implantaciji. Po bolusnem sproščanju E2 bi sledila razgradnja polimera do sproščanja E2 pri enaki koncentraciji kot prej. Zgoraj opisan poskus je bil ponovljen z uporabo teh poli(pro-E2) filmov, ki sproščajo bolus, nevroprotekcija in vnetje pa sta bila ocenjena 7 dni po poškodbi (dpi).

Vendar namesto dodatne koristi poli(pro-E2) filmi, ki sproščajo bolus, niso bistveno povečali pozitivnega območja NeuN v primerjavi s poškodovanimi, nezdravljenimi kontrolami (slika 4A; p=0.6770). Poli(proE2) filmi, ki sproščajo bolus, so povečali izražanje CD68, vendar povečanje ni bilo statistično drugačno (p= 0.1780).

Naraščajoče trende glialne reaktivnosti in mikroglijskega vnetja so opazili tudi v prisotnosti poli(pro-E2) filmov, ki sproščajo bolus, zaradi povečanja ekspresije GFAP (astrociti) in Iba1 (mikroglija); vendar ta povečanja niso bila statistično večja od tistega, kar so opazili pri poškodovanih, nezdravljenih kontrolnih skupinah (p=0.3233 oziroma p=0.3053). Skupaj poli(pro-E2) filmi, ki sproščajo bolus, niso okrepili nevroprotekcije, reaktivnost astrocitov in prisotnost makrofagov/mikroglije pa nista bili zmanjšani, kot je bilo sprva domnevano.

Ker razlik med poškodovanimi, nezdravljenimi živalmi in poškodovanimi živalmi, zdravljenimi s filmom poli(proE2), ki sproščajo bolus, niso opazili pri akutni časovni točki 7 dpi, je bila za nadaljnjo preiskavo izbrana kronična časovna točka, saj filmi poli(pro-E2) lahko dolgoročno sprošča E2.20 Zgoraj opisan poskus je bil ponovljen s poli(pro-E2) filmi, ki sproščajo bolus, vendar so bile živali kronično ocenjene pri 21 dpi (slika 5).

Hrbtenjača je bila označena za iste vrste celic, ki so bile navedene prej. Po analizi je prišlo do povečanja površinskega deleža NeuN pri živalih z vsajenim poli(pro-E2)filmom, ki sprošča bolus, v primerjavi s poškodovanimi, nezdravljenimi živalmi (slika 5A; p=0.0897) Poleg tega so opazili trende, ko so poli(pro-E2) filmi, ki sproščajo bolus, zmanjšali površinski delež ekspresije CD68 in GFAP v primerjavi s podatki iz kontrolnih nezdravljenih poškodovanih živali (slika 5B, C; p=0.0859 in p=0.2780).

Vendar nobeden od trendov ni bil statistično drugačen. Po drugi strani so Iba1 označeni odseki tkiva živali, zdravljenih s poli(pro-E2), ki sproščajo bolus, pokazali povečano izražanje v primerjavi s podatki iz nezdravljenih, poškodovanih kontrol (p < 0.0001). Naše prejšnje delo kaže, da je poli(pro -E2) filmi, odliti na 15 mm × 15 mm pokrovna stekelca, sprostijo približno 266 ng E2 na dan,20 kar pomeni približno 2 ng E2 na dan iz filmov (1 mm × 1,8 mm), ki se uporabljajo tukaj. Poli(pro-E2) filmi, ki sproščajo bolus, sprostijo dodatnih 40 ug nevezanega E2 takoj po implantaciji.

Raziskave, ki se osredotočajo na uporabo E2 v modelih SCI pri glodalcih, kažejo, da nizki odmerki estrogena (10 ug/kg), aplicirani intravensko, oslabijo reaktivno gliozo in zagotavljajo nevroprotekcijo, medtem ko oslabijo vnetne dogodke, zavirajo apoptozo in povečajo angiogenezo.21 Nasprotno pa imajo visoki, sistemski odmerki estrogena neželeni učinki, ki vključujejo povečano stopnjo globoke venske tromboze in raka 22, 23 ter razvoj ženskih telesnih lastnosti pri moških. To je omembe vredno, saj se je večina raziskav o E2 osredotočila na sistemsko dajanje E2 bodisi intravenozno bodisi intraperitonealno.

Glede na pomisleke glede varnosti pri sistemski uporabi velikih odmerkov E2 je pomembno optimizirati koncentracijo E2 za lokalno dostavo v poškodovano hrbtenjačo, da preprečimo stranske učinke. Do danes je le ena študija dostavila E2 iz biomateriala z uporabo nanodelcev za fokalno dostavo E2 (2,5 ug ali 25 ug). Sprostitev iz nanodelcev je hitro zmanjšala akutno vnetje pri podganjem modelu kontuzije SCI.9 Pomanjkanje statistično pomembnega odziva v naših podatkih (sliki 4 in 5) je lahko posledica neravnovesja v količini E2, ki ga lokalno dovajamo v hrbtenjačo z preveč E2 (40 ug) se sprošča akutno, medtem ko se zelo malo (2 ng) sprošča kronično.

Čeprav iz teh podatkov opažamo skromne trende, ta študija poudarja pomen odmerjanja E2 za spodbujanje nevroprotekcije in vivo. Zmanjšanje začetnega odmerka E2 in prilagajanje kinetike razgradnje poli(pro-E2) biomateriala bi lahko pomagalo ublažiti to težavo in potencialno zagotoviti boljše nevroprotektivne rezultate.

Čeprav je bila ta študija izvedena samo pri moških, je ključnega pomena oceniti učinek teh poli(pro-E2) filmov pri obeh spolih, da se ugotovi veljaven translacijski potencial za ta biomaterial. Raziskave so pokazale, da so po SCI povečane ravni estrogena pri ženskah lahko delno odgovorne za njihove izboljšane funkcionalne rezultate v primerjavi z moškimi.24 Ker je pri ženskah povečana prisotnost estrogena, mora vsaka strategija biomateriala, ki uporablja estrogen, upoštevati to povečano raven in spremeniti material. kinetiko sproščanja, da zagotovite, da dostavljeni odmerek ostane enak za samce in samice.

METODE

Izdelava poli(pro-E2) filmov.

Poli(pro-E2) polimer P1 je bil sintetiziran in karakteriziran, kot je podrobno opisano prej.20 Polimer ima povprečno masno molekulsko maso MW ~ 80 kDa in disperzijo Đ ~ 3, glede na gelsko permeacijsko kromatografijo (GPC). Poli(pro-E2) filme smo izdelali tako, da smo polimer raztopili v kloroformu (5 mas. %/masa; polimer/kloroform), raztopino kapljali na steklena pokrovna stekelca 15 mm × 15 mm (100 μL raztopine na pokrovno stekece) in jih pustili sušiti čez noč v vakuumu (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Za ustvarjanje poli(pro-E2) filmov z nevezanim E2 so bili filmi izdelani z dodajanjem nevezanega E2 (Abcam, Cambridge, MA) raztopini polimera (0.0625 mas. %/masa; E2/kloroform) pred ulivanjem po kapljicah raztopino na pokrovna stekelca. Pred implantacijo so bila pokrovna stekelca s filmi sterilizirana z ultravijoličnim (UV) sevanjem 30 minut in filmi so bili olupljeni s pokrovnih stekelcev v sterilni biološko varnostni omari. Poli (pro-E2) filme smo nato razrezali na kose velikosti 1 mm × 1, 8 mm, primerne za implantacijo v odraslo miško, kot je opisano spodaj.

Kontuzija poškodbe hrbtenjače in implantacija poli(pro-E2) filmov.

Vse kirurške in pooperativne postopke oskrbe sta odobrila Politehnični inštitut Rensselaer in Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Državne univerze Ohio (IACUC). Da bi povzročili kontuzijo SCI, smo odrasle samce miši C57BL/6 (stare od 10- do 12- tednov), kupljene pri Jackson Laboratory (št. zaloge 000664; Bar Harbor, ME), anestezirali z intraperitonealno injekcijo ketamina (80 mg/kg) in ksilazina (10 mg/kg). Hrbet živali smo obrili in aseptično pripravili z uporabo 70 % etanola in betadina.

Po namestitvi živali na grelno blazino, ki je bila vzdrževana pri 37 stopinjah, so kožo in mišice odprli, da so izpostavili hrbtenjačo, in dorzalno laminektomijo izvedli na torakalnem devetem vretencu (T9), da so izpostavili hrbtenjačo. Zmerna (75 kdyn) zmečkanina SCI je bila na tej ravni povzročena z udarno glavo Infinite Horizons (Precision Systems andInstrumentation, Lexington, KY).

Ko je bila dosežena hemostaza, je bila odprta dura (slika 2) in poli(pro-E2) film ali poli(pro-E2) film (1 mm × 1,8 mm), ki sprošča bolus, nameščen pod trdo možgansko ovojnico in nad hrbtenjačo, ki pokriva mesto poškodbe. Pri kontrolnih živalih je bila dura odprta, vendar poli(pro-E2) filmi niso bili implantirani. Mišične plasti so bile nato zaprte s sterilnimi šivi, koža pa je bila zaprta s sterilnimi kovinskimi sponkami za rane.

Miši so prejele 2 mL sterilne fiziološke raztopine, injicirane subkutano in so bile vrnjene v svoje kletke ter čez noč postavljene na ogrevalno stekelce, nastavljeno na 37 stopinj. Da bi zagotovili ustrezno hidracijo in preprečili okužbe, so miši subkutano injicirali 1–2 ml sterilne fiziološke raztopine in gentocina (1 mg/kg) na dan prvih 5 dni po poškodbi (dpi). Mehurji so bili ročno iztisnjeni dvakrat na dan med trajanjem poskusov. Vse živali so bile nameščene v običajnih pogojih v 12--urnem ciklu svetloba-tema z ad libitum dostopom do hrane in vode.

Odvzem tkiva.

V določenih končnih časovnih točkah 7 ali 21 dpi so miši injicirali smrtonosni odmerek ketamina/ksilazina (1,5 × kirurški odmerek) in transkardialno perfundirali s 0.1 Mfosfatno pufrirano fiziološko raztopino (PBS; pH 7,4) čemur je sledil 4 % paraformaldehid (PFA; pH 7,4). Hrbtenjača je bila odstranjena, naknadno fiksirana za 2 uri v 4 % PFA in nato čez noč prenesena v 0.2M fosfatni pufer (PB; pH 7,4).

Hrbtenjača je bila kriozaščitena v 30% saharozi 48 ur pri 4 stopinjah in nato blokirana v 10 mm segmente, osredotočene okoli mesta poškodbe s hrbtnimi stebri obrnjenimi navzgor. Ti odseki so bili vdelani v medij z optimalno temperaturo rezanja Tissue-Tek (VWR International, Radnor, PA) in hitro zamrznjeni na suhem ledu. Vse hrbtenjače so bile odrezane pri 10 μm na kriostatu Microm HM505E, postavljene na stekelca ColorFrost Plus (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), in nato shranjen pri –20 stopinjah, dokler se ne uporabi za imunsko barvanje.

Imunohistokemija in kvantifikacija.

Predmetna stekelca smo 1 uro odtajali na grelniku za predmetna stekla in nato 3-krat splaknili v 0.1 MPBS. Aktivnost endogene peroksidaze smo ugasnili z inkubacijo stekelcev v 6 % H2O2, razredčenem v metanolu, 15 minut pri sobni temperaturi. Po 3-kratnem izpiranju v 0.1 M PBS so bili rezi inkubirani s 4 % BSA in 0.1 % Triton X-100 v 0.1 M PBS za 1 h, čemur sledi inkubacija primarnih protiteles čez noč pri 4 stopinjah ali sobni temperaturi (tabela 1).

Predmetna stekelca smo 1 uro inkubirali z ustreznimi biotiniliranimi sekundarnimi protitelesi (1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA) pri sobni temperaturi. Za vizualizacijo vezanega protitelesa so bila stekelca 1 uro inkubirana z Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) in 10 minut razvita s substratom ImmPACT3,3′-diaminobenzidina (DAB) ali Vector SG (Vector Laboratories).

Te dele smo dehidrirali z zaporednimi 2 × 2 min inkubacijami v 70 % in 90 % etanolu, 2 × 3 min v 100 % etanolu, čemur je sledilo 3 × 3 min v Histoclearju in na koncu prekrili s Permountom (ThermoFisher Scientific). Za kvantifikacijsko analizo smo uporabili šest odsekov na žival, razmaknjenih 100 μm narazen v poškodovani hrbtenjači.

Imunsko označene odseke smo slikali s slikovnim mikroskopom Axioplan 2, opremljenim s kamero AxioCamdigital in programsko opremo AxioVision različice 4.8.2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Nemčija) in objektivom 5×.

Število pozitivnih slikovnih pik v vsakem od odsekov je bilo prešteto z uporabo programske opreme za analizo slike MIPAR (MIPAR, Worthington, OH), da se izračuna odstotek pozitivne frakcije površine na odsek. Povprečni odstotek pozitivne površine šestih rezov na žival je bil izračunan za vsako od madežev in poročan.

Statistična analiza.

Vsi podatki so navedeni kot povprečje ± standardni odklon. Statistična analiza je bila izvedena z uporabo statistične programske opreme GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA). V vseh poskusih je bilo uporabljenih 5–6 živali na skupino, ki izvirajo iz vsaj dveh različnih skupin živali. Za testiranje razlik med kontrolno in poli(pro-E2) filmsko skupino je bil uporabljen Studentov t-test (slike 3, 4 in 5). Pomembnost je bila ugotovljena pri p Manjše ali enako 0,05.

Dodatno gradivo

Glejte spletno različico na PubMed Central za dodatno gradivo.

ZAHVALA

Avtorji se zahvaljujejo Wenmin Lai za njeno pomoč pri operacijah miši.

financiranje

To delo je prejelo podporo štipendije fundacije Craig H. Neilsen (štipendija 468116) in štipendije raziskovalne fundacije paraliziranih veteranov Amerike (štipendija 3171) za MKG ter NIH R01 (štipendija NS092754) in štipendija odbora za institucionalno podporo države New York za podporo poškodbam hrbtenjače C32245GG za RJG Vse delo na živalih je bilo izvedeno s pomočjo kirurškega jedra Oddelka za nevroznanost Državne univerze Ohio, ki ga podpira NINDS Grant P30NS104177.

REFERENCE

(1). Nacionalni statistični center za poškodbe hrbtenjače. (2020) Dejstva in številke o poškodbah hrbtenjače na prvi pogled, Univerza Alabame v Birminghamu, Birmingham, AL.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J in Brown D (2011) Globalni zemljevid za epidemiologijo travmatske poškodbe hrbtenjače: na poti k živemu skladišču podatkov za preprečevanje poškodb. Hrbtenjača. 49, 493–501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Poškodba hrbtenjače – preteklost, sedanjost in prihodnost. Journal of Spinal CordMedicine 30, 85–100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ in Wilson DA (2010) Statewide Investigation of Medically Attended Adverse Health Conditions of Persons with Spinal Cord Injury. J. Spinal Cord Med. 33 (3), 221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J in Miller JH (2004) Regeneracija onkraj glialne brazgotine. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146–156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK in Banik NL (2013) Poškodba hrbtenjače: pregled trenutne terapije, prihodnjih zdravljenj in osnovnih znanstvenih meja. Neurochem. Res. 38, 895–905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M in Beyer C (2018) Estrogen zmanjša ekspresijo in aktivacijo lokalnega vnetja po poškodbi hrbtenjače. Mol. Neurobiol. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG in Yune TY (2018) Estrogen ublaži nevropatsko bolečino, povzročeno po poškodbi hrbtenjače, z zaviranjem mikroglije in aktivacije astrocitov. Biochim. Biophys. Acta, Mol. Osnova Dis. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A in Banik N (2015) Nanodelci estrogena pri poškodbi hrbtenjače pri podganah izzovejo hitre protivnetne učinke v plazmi, cerebrospinalni tekočini in tkivu.J. Nevrotravma 32 (18), 1413–1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK in Banik NL (2010) Zdravljenje kronične poškodbe hrbtenjače z estrogenom po poškodbi izboljša lokomotorno funkcijo pri podganah. J. Neurosci. Res. 88 (8), 1738–1750. [PubMed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H in Akaike A (2001) Negenomska antiapoptotična transdukcija signala z estrogenom v kultiviranih kortikalnih nevronih. J.Neurosci. Res. 64 (5), 466–475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK in Banik NL (2003) Estrogen kot nevroprotektivno sredstvo pri zdravljenju poškodbe hrbtenjače. Ann. NY Acad. Sci. 993,125–133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com