Acilirani feniletanoidni oligoglikozidi s hepatoprotektivnim delovanjem iz puščavske rastline Cistanche Tubulosa
Mar 15, 2022
za več informacij:Ali.ma@wecistanche.com
Toshio Morikawa idr
Povzetek
Metanolni izvleček iz svežih stebelCistanche tubulosa(Orobanchaceae) je pokazalo hepatoprotektivne učinke proti poškodbi jeter, ki jo povzroča D-galaktozamin (D-GalN)/lipopolisaharid (LPS) pri miših. Iz izpisa tri novefeniletanoidoligoglikozide, kankanozide H1 (1), H2 (2) in I(3), smo izolirali skupaj s 16feniletanoidni glikozidi(4–19) in dva acilirana oligosladkorja (20,21). Strukture 1–3 so bile določene na podlagi spektroskopskih lastnosti in kemijskih dokazov. Med izolati ehinakozid (4, IC50=10,2 lM), akteozid (5, 4,6 lM), izoakteozid (6,5,3 lM), 20-acetilakteozid (8, 4,8 lM) in tubulozid A (10, 8,6 lM) je zaviral z D-GalN inducirano smrt hepatocitov. Teh pet izolatov, 4 (31,1 lM), 5 (17,8 lM), 6 (22,7 lM), 8 (25,7 lM) in 10 (23,2 lM), ter cistantubulozid B1 (11, 21,4 lM) so tudi zmanjšali TNF-a- inducirano citotoksičnost v celicah L929. Poleg tega so glavne sestavine (4–6) pokazale in vivo hepatoprotektivne učinke pri odmerkih 25–100 mg/kg, PO.
Kliknite za stranske učinke cistanche in izdelke Cistanche
1. Uvod
Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) je večletna parazitska rastlina, ki raste na koreninah vrste Salvadora ali Calotropis in je razširjena v Severni Afriki, Arabiji in azijskih državah.2 SteblaCistanche tubulosakot tudi pomožna salsa in Cistanche deserticola sta se tradicionalno uporabljali za zdravljenje impotence, neplodnosti, lumbaga in telesne oslabelosti ter kot sredstvo za pospeševanje krvnega obtoka.2,3 Pred tem je večfeniletanoids, iridoidi, monoterpeni in lignani so bili izolirani iz Kitajske in PakistanaCistanche tubulosa.2,4–9 Med našimi karakterizacijskimi študijami o bioaktivnih sestavinah v tem naravnem zdravilu smo že poročali, da pet iridoidov, kankanozidov A–D in kankanol, monoterpeneglikozid, kankanozid E, dvafeniletanoidoligoglikozide, kankanozide F in G (23) in acilirani oligosladkor, kankanozo (21), smo izolirali iz metanolnega ekstrakta posušenih stebelCistanche tubulosa.10,11 Poleg tega je bilo ugotovljeno, da metanolni ekstrakt in številni izolati, kot so ehinakozid (4), akteozid (5), cistanozid F (20), 21 in kankanozid F, kažejo vazorelaksantne učinke, to je zaviralne učinke proti povzročenim kontrakcijam. z noradrenalinom v izolirani torakalni aorti podgan.11 V naših stalnih študijah o sestavinah v rastlini je metanolni izvleček svežih stebelCistanche tubules wasUgotovljeno je bilo, da kaže zaščitni učinek na poškodbe jeter, ki jih povzroča D-galaktozamin (D-GalN)/lipopolisaharid (LPS) pri miših. Iz metanolnega ekstrakta smo izolirali tri novefeniletanoidoligoglikozidi, imenovani kankanozidi H1 (1), H2 (2) in I (3), skupaj s 16 feniletanoidnimi glikozidi (4–19) in dvema aciliranima oligosugarjema (20, 21). Ta članek se ukvarja z izolacijo in strukturno pojasnitvijo teh novihfeniletanoidoliglikozidi (1–3). Obravnavane so tudi strukturne zahteve feniletanoidnih glikozidov za hepatoprotektivno delovanje (slika 1)
2. Rezultati in razprava
2.1. Zaščitni učinek metanolnega izvlečka iz stebelCistanche tubulosao poškodbi jeter, ki jo povzroča D-GalN/LPS pri miših
Sveža steblaCistanche tubulosa(gojijo v Urumqiju, provinca Xinjiang, Kitajska) ekstrahirali z metanolom pod refluksom, da so dobili metanolni ekstrakt (8,36 odstotka iz svežih stebel). Kot je prikazano v tabeli 1, so metanolni ekstrakti pri odmerkih 250–500 mg/kg, PO, pokazali zaviralni učinek na zvišanje serumske aspartat aminotransaminaze (sAST) in alanin aminotransaminaze (sALT), označevalcev poškodbe jeter, ki jih povzroča D- GalN/LPS pri miših.
2.2. Kemične sestavine iz stebelCistanche tubulosa
Metanolni izvleček iz svežih stebelCistanche tubulosasmo podvrgli Diaion HP-20 kolonski kromatografiji (H2O?MeOH), da smo dobili frakcije, eluirane z H2O in MeOH (5,63 odstotka oziroma 2,73 odstotka). Z MeOH eluirano frakcijo smo izpostavili SiO2 in ODS kolonski kromatografiji in končno HPLC, da smo dobili tri novefeniletanoidoliglikozidi, kankanozidi H1 (1, 0.0008 odstotkov), H2(2, 0,0001 odstotkov) in I (3, 0,0007 odstotkov) skupaj s 16feniletanoidni glikozidi, ehinakozid2,11 (4, 0.45 odstotkov), akteozid2,11 (5, 0.28 odstotkov), izoakteozid2,11 (6, 0.0 41 odstotkov ), cis-akteozid12,13 (7, 0.0007 odstotkov ), 20-acetilakteozid2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}}38 odstotkov ), dekafeoilakteozid14 (9, 0.0002 odstotka ), tubulna stran A2,11 (10, 0.013 odstotkov), cistantubulozide B19 (11, 0,0020 odstotkov), B29 (12,0,0003 odstotkov), arenarioside15 (13, 0,0006 odstotkov), wiedemanninoside C16 (14,0,0008 odstotkov), cistantubulozid A9 (15, 0,0009 odstotkov), siringalid A 30-OaL ramnopiranozid4 (16, 0,0017 odstotkov), kampneozidi I17,18 (17,0,015 odstotkov) in II17,18 (18 , 0,0005 odstotka ) in salidrozid11 (19, 0,0027 odstotka ) ter dva acilirana oligosugarja, cistanozid F11 (20, 0,0004 odstotka ) in kankanoza11 (21, 0,0004 odstotka ).
2.3. Strukture kankanozidov H1 (1), H2 (2) in I (3)
Kankanozid H1 (1) smo dobili kot bel prah z negativno optično rotacijo (½a-24D-45.3 v MeOH). Njegov IR spekter je pokazal absorpcijske pasove pri 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1{{107}}70 in 1040 cm 1 , ki jih je mogoče pripisati hidroksilom, estrskim karbonilom, etrskim funkcijam, in aromatičnih obročkov. FABMS spektra pozitivnih in negativnih ionov 1 sta pokazala vrhove kvazimolekularnih ionov pri m/z 835 (M plus Na) plus oziroma m/z 811 (MH), molekulska formula pa je bila določena kot C37H48O20 z visokoločljivim pozitivnim ionsko merjenje FABMS. 1H in 13C NMR spektri 1 (CD3OD, tabeli 2 in 3), ki so bili dodeljeni z različnimi NMR eksperimenti,19 so pokazali signale, ki jih je mogoče pripisati dvema metilenoma [d 2,70(2H, m, H2-7), 3,66 , 4,07 (1H vsak, oba m, H2-8)], orto- in meta sklopljeni aromatski protoni tipa ABC [d 6,52 (1H, dd, J=1).8,7,8 Hz, H{ {50}}), 6,65 (1H, d, J=1,8 Hz, H-2), 6,67 (1H, d, J=7,8 Hz, H{{62 }})], dva bD-glukopiranozilna dela [d 4,29 (1H, d, J=7.8 Hz, terminal-Glc-H-1), 4,54 (1H, d, J {{76 }}.2 Hz, notranji-Glc-H-1)] in aa-L-ramnopiranozilni del [d 1,06 (3H, d, J=6.0 Hz, Rha-H{{89 }}),4,80 (1H, br s, Rha-H-1)] skupaj z acetilno skupino [d 1,98(3H, s)] in trans-p-kumaroilno skupino {trans-olefin [d 6,34,7,67 (1H vsak, oba d, J=16.0 Hz, H-8 in 7)] in orto-sklopljeni aromatski protoni tipa A2B2- [d 6,80, 7,46 (2H vsak , oba d,J=8.7 Hz, H-3,5 in 2,6)]}. Povezave med oliglikozidnimi in acilnimi deli v 1 so bile označene s poskusom HMBC, ki je pokazal dolgoročne korelacije med naslednjimi protonskimi in ogljikovimi pari: notranji-Glc-H-1 in C-8 (dC71.9 ); notranji-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, dd-podoben)] in acetil karbonilkarbon (dC 171,4); notranji-Glc-H-4 [d 5,08 (1H, dd, J=9.6, 9,6 Hz)] in p-kumaroil karbonilni ogljik (dC 168,2); Rha-H-1 in notranji-Glc-C-3 (dC 80,5); in terminal-Glc-H-1 in notranji-Glc-C-6 (dC69.3) (slika 2). Končno je alkalna hidroliza 1 s 5 odstotki kalijevega hidroksida (KOH) sprostila trans-p-kumarinsko kislino, ki je bila identificirana z analizo HPLC, skupaj z deaciliranim produktom. Deacilirani produkt smo zaporedoma obdelali z 1,0 M klorovodikovo kislino (HCl), da smo sprostili L-ramnozo in D-glukozo, ki smo ju identificirali s HPLC analizo z uporabo optičnega rotacijskega detektorja. 10, 11 Tako je bila razjasnjena struktura kankanozida H1 {{181 }}(3,4-dihidroksi fenil)etil OaL-ramnopiranozil-(1- 3)-[bD-glukopiranozil-(1-6)]-2-O-acetil{{196 }}O-trans-p-kumaroil-bD-glukopiranozid (1).
Kankanozid H2 (2) smo izolirali kot bel prah z negativno optično rotacijo (½a 25 D 52,4 v MeOH). Njegova molekulska formula C37H48O20 je bila enaka molekulski formuli 1 z visokoločljivim merjenjem FABMS s pozitivnimi ioni. Spektroskopske lastnosti 2 so bile zelo podobne tistim iz 1, razen signalov zaradi cis-p-kumaroilne skupine [d 5,79, 6,95 (1H vsak, oba d, J=12.8 Hz, H{{ 22}} in 7), 6,76, 7,73 (po 2H, oba d, J=8.7 Hz, H-3, 5 in 2,6)]. Poleg tega je poskus HMBC na 2 prav tako razkril podobne načine korelacije dolgega dosega, kot so bili odkriti za 1 med naslednjima protonskima in ogljikovima paroma: notranji-Glc-H-1 [d 4,51 (1H, d, J {{44) }}.8 Hz)] in C-8 (dC 72,0); notranji-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, m)] in acetil karbonilni ogljik (dC 171,4); notranji-Glc-H-4 [d 4,98 (1H, dd, J=9.6, 9,7 Hz)] in p-kumaroil karbonilni ogljik (dC 166,7); Rha-H-1 [d 4,77 (1H, d, J=1.4 Hz, Rha-H-1)] in notranji-Glc-C-3 (dC 80,7 ); in končni-Glc-H-1 [d 4,28 (1H, d, J=7,8 Hz)] in notranji-Glc-C-6 (dC 69,4) (slika 2) . S študijo razgradnje je 2 dal cis-p-kumarinsko kislino in dva enaka sladkorja, kot sta bila pridobljena v primeru 1. Posledično je bilo ugotovljeno, da je struktura kankanozida H2 2-(3,4- dihidroksi fenil)etil OaL-ramnopiranozil-(1-3)- [bD-glukopiranozil-(1-6)]-2-O-acetil-4-O-cis-p-kumaroil- bD-glukopiranozid (2).
Izolirali smo tudi kankanozid I (3) kot bel prah z negativno optično rotacijo (½a- 25D-62.2 v MeOH). Njegovo molekulsko formulo, C35H46O18, so določili s pozitivnimi in negativnimi meritvami FABMS in HRFABMS. Spektroskopske lastnosti 3(CD3OD, tabeli 2 in 3) so bile primerljive z lastnostmi ehinakozida (4), razen signalov zaradi aglikonskega dela {{dva metilena {d 2,95 (2H, dd, J=7). 3, 7,8 Hz, H2-7), [3,79 (1H, m), 4,10 (1H,dt, J=16,9, 7,3 Hz), H{{32} }]}, monosubstituirani aromatski protoni [d7,18 (1H, m, H-4), 7,26–7,28 (4H, m, H-2,6, 3,5)]}}. Alkalna hidroliza 3 s 5 odstotki KOH je sprostila trans-kafeinsko kislino in deacilirani produkt smo zaporedoma obdelali z 1,0 M HCl, da smo sprostili L-ramnozo in D-glukozo. Končno so bile povezave acilne skupine in sladkornih delov v 3 razjasnjene s poskusom HMBC, kot je prikazano na sliki 2. Na podlagi zgoraj omenjenih dokazov je bila struktura kankanozida I pojasnjena kot 2-feniletil OaL- ramnopiranozil-(1-3)-[bD-glukopirano-sil-(1-6)]-4-O-trans-kafeoil-bD-glukopiranozid (3)
2.4. Učinki kemičnih sestavin iz stebel Cistanche tubulosa na citotoksičnost, ki jo povzroča D-GalN, v primarno gojenih mišjih hepatocitih
Znano je, da se z D-GalN/LPS povzročena poškodba jeter razvije prek imunoloških odzivov.19 Poročajo, da se ta vrsta poškodbe jeter pojavlja v dveh oblikah. Prvič, D-GalN poveča občutljivost na TNF-a z izčrpanostjo uridin trifosfata v hepatocitih. Drugič, vnetni mediatorji, kot sta NO in TNF-a, se sproščajo iz LPS-aktiviranih makrofagov (Kupfferjeve celice). Poročajo, da ima apoptoza hepatocitov s TNF-a pomembno vlogo pri poškodbi jeter, ki jo povzroči D-GalN/LPS.20
V naših prejšnjih študijah hepatoprotektivnih spojin iz naravnih zdravil smo poročali, da je več sestavin iz Hovenia Dulcis,21 Bupleurum scorzonerifolium,22,23 Curcuma zedoaria,24–26Angelica furcijuga,27,28 Betula sativum,30 Salacia reticulata,31 Tilia argentea,32 Anastatica hierochuntica, 33 Panax notoginseng, 34 Cyperus longus, 35 Erycibe expansa, 36 Camellia sinensis, 37 Sedum sarmentosum, 38, 39 Sinocrassula indica, 40 Hedychium coronarium, 41 in Piper chaba 42, 43 so pokazali hepatoprotektivne učinke na poškodbo jeter, povzročeno z D-GalN/LPS pri miših in/ali platyphylla var. japonica,29 Inhibicijski učinek Pisum na citotoksičnost, ki jo povzroča D-GalN, v primarnih kulturah hepatocitov. Ker metanolni izvleček iz stebelCistanche tubulosapokazala hepatoprotektivne učinke na z D-GalN/LPS povzročeno poškodbo jeter pri miših (vide ante), zaviralni učinek sestavin na citotoksičnost, povzročeno z D-GalN, v primarno gojenih mišjih hepatocitih je bil raziskan z uporabo 3-(4,{ {6}}dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid (MTT) test. Kot je prikazano v tabeli 4, so ehinakozid (4, IC50=10.2 lM), akteozid (5, 4,6 lM), izoaceteozid (6, 5,3 lM), 20-acetilakteozid (8, 4,8 lM), tubulozida A (10,8,6 lM) in B11 (22, 14,6 lM) ter kankanozida G11 (23, 14,8 lM) so pokazali močno aktivnost. Njihove aktivnosti so bile večje od aktivnosti komercialnega silibina (38,8 lM),33–43 kot pozitivne kontrole.44,45 Strukturne zahtevefeniletanoidni glikozidi for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 lM)]; (2) aglikon s 3,4-dihidroksi skupino je pokazal močnejšo aktivnost kot tisti s 4-hidroksi skupino (6 > 23); (3) 60-ObD-glukopiranozilni del je zmanjšal aktivnost (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" 8-obd-glukopiranozilni="" del="" s="" 40-o-kafeoilno="" skupino="" je="" pokazal="" močnejšo="" aktivnost="" kot="" tisti="" z="" 60-o-kafeoilno="" skupino="" (5="6," 8=""> 22 ); in (5) uvedba 20-O-acetilnega dela je zmanjšala aktivnost (8 5 5, 22 <>
Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 lM, podatki niso prikazani). Tako je bilo ugotovljeno, da te spojine ne vplivajo na prekomerno proizvodnjo NO in TNF-a iz LPS-aktiviranih makrofagov.
2.5. Učinki kemičnih sestavin na citotoksičnost, ki jo povzroči TNF-a, v celicah L929
Da bi razjasnili učinke sestavin na občutljivost hepatocitov na TNF-a, s TNF-a povzročeno zmanjšanje viabilnosti celic L929, smo s testom MTT pregledali celično linijo, občutljivo na TNF-a,48. Brez testnih vzorcev je bila viabilnost celic zmanjšana na pribl. 60 odstotkov po 44-urni inkubaciji celic z 20 ng/mL TNF-a v primerjavi s primerom brez TNF-a. Kot je prikazano v tabeli 5, so ehinakozid (4, IC50=31.1 lM), akteozid (5, 17,8 lM), izoaceteozid (6, 22,7 lM), 20-acetilakteozid (8, 25,7 lM), tubulozid A (10,23,2 lM) in cistantubulozid B1 (11, 21,4 lM) sta zavrla zmanjšanje viabilnosti celic in ugotovili so, da sta njuni aktivnosti večji od aktivnosti piperina42,43 in silibina. Strukturne zahteve zafeniletanoidni glikozidi for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM)]; in (5) uvedba 20-O-acetilnega dela je zmanjšala aktivnost (8 < 5,="" 22="">< 6).="" ugotovljeno="" je="" bilo,="" da="" so="" te="" zahteve="" podobne="" tistim,="" opaženim="" v="" prejšnjem="" poglavju="" v="" zvezi="" z="" zaviralnimi="" učinki="" na="" citotoksičnost,="" ki="" jo="" povzroča="" d-galn,="" v="" primarno="" kultiviranih="" mišjih="">
Te in vitro ugotovitve kažejo na naslednje možne mehanizme delovanja za hepatoprotektivni učinek sestavin stebelCistanche tubulosa: (i) zmanjšanje citotoksičnosti, ki jo povzroča D-GalN (4–6, 8, 10, 22 in 23), in (ii) zmanjšanje citotoksičnosti, ki jo povzroča TNF-a (4–6, 8, 10 in 11) .
2.6. Zaščitni učinki ehinakozida (4), akteozida (5) in izoakteozida (6) proti poškodbi jeter, ki jo povzroča D-GalN/LPS pri miših, in njihov način delovanja
Nazadnje smo preučili učinek glavnicefeniletanoidni glikozidi, ehinakozid (4), akteozid (5) in izoakteozid (6) na poškodbo jeter, ki jo povzroča D-GalN/LPS pri miših. Kot je prikazano v tabelah 6 in 4–6, je znatno zaviral zvišanje sAST in sALT, inducirano z D-GalN/LPS pri miših pri odmerkih 25–100 mg/kg, PO. Po drugi strani pa 4–6 ni vplival na prekomerno proizvodnjo TNF-a iz makrofagov, aktiviranih z LPS. Poleg tega je 4–6 znatno zaviral smrt celic L929, ki jo povzroča TNF-a, kar kaže na zmanjšanje občutljivosti celic L929 na TNF-a (vide ante). Te ugotovitve kažejo, da 4–6 zmanjša občutljivost teh celic na citotoksičnost, ki jo povzroči TNF-a. Poročali so o številnih spojinah, ki zavirajo celično smrt, ki jo povzroča D-GalN, in proizvodnjo TNF-a, 24, 26, 32, vendar so poročali o nekaj spojinah, ki selektivno zmanjšajo občutljivost hepatocitov na TNF-a.42, 43, 49, 50
Za zaključek iz svežih stebelCistanche tubulosa, tri novefeniletanoidni glikozidi, kankanozidi H1 (1), H2 (2) in I (3) skupaj s 16 znanimifeniletanoidni glikozidi(4–19) in dva acilirana oligosladkorja (20, 21). Strukturne zahteve za njihove zaščitne učinke na poškodbe hepatocitov, ki jih povzroča D-GalN, in citoprotektivne učinke na celice L929, ki jih povzroča TNF-a, so bile naslednje; (1) aglikonski del je bil bistven za aktivnost; (2) aglikon, ki ima 3,4-dihidroksilne skupine, je pokazal močnejšo aktivnost kot tisti, ki ima 4-hidroksi skupino; (3) 60-ObD-glukopiranozilni del je zmanjšal aktivnost; (4) 8-ObD-glukopiranozilni del, ki ima 40-O-kafeoilne skupine, je pokazal močnejšo aktivnost kot tisti, ki ima 60-O-kafeoilno skupino; in (5) uvedba {{27 }}O-acetilni del je zmanjšal aktivnost. Poleg tega glavnifeniletanoidni glikozidi, ehinakozid (4), akteozid (5) in izoakteozid (6) so zavirali povečanje insAST in sALT pri odmerkih 25–100 mg/kg PO pri miših, zdravljenih z D-GalN/LPS, in ti zaviralni učinki naj bi bili odvisno od zmanjšane občutljivosti hepatocitov na TNF-a. Podrobni mehanizmi delovanjafeniletanoidni glikozidibi bilo treba dodatno preučiti.
3. Eksperimentalno
3.1. Splošno
Za pridobitev spektralnih in fizikalnih podatkov so bili uporabljeni naslednji instrumenti: specifične rotacije, digitalni polarimeter Horiba SEPA-300 (l=5 cm); UV spektri, Shimadzu UV-1600 spektrometer; IR spektri, spektrometer Shimadzu FTIR-8100; 1H in 13C NMR spektri, spektrometri JEOLJNM-ECA600 (600 in 150 MHz) in JEOL JNM-ECS400 (400 in 100 HMz) s tetrametilsilanom kot internim standardom; FABMS in FABMS visoke ločljivosti, masni spektrometer JEOL JMS-SX 102A; Detektor HPLC, lomni količnik Shimadzu RID-10A, Shimadzu SPD-10A UV-vis in detektorji optične rotacije Shodex OR-2. HPLC kolona, Cosmosil 5C18-MS-II in pNAP (Nacalai TesqueInc., 250 4,6 mm id) oziroma (250 - 20 mm id) kolone so bile uporabljene za analitične in preparativne namene.
Za kromatografijo so bili uporabljeni naslednji eksperimentalni pogoji: kolonska kromatografija s silikagelom normalne faze (CC), silikagel 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63–210 mesh, sferičen, nevtralen ); silikagel CC z reverzno fazo, Diaion HP-20 (NipponRensui) in Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100–200 mesh); normalna faza TLC, predhodno prevlečene TLC plošče s silikagelom 60F254 (Merck, 0,25 mm); TLC z reverzno fazo, predhodno prevlečene TLC plošče s silikagelom RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC z reverzno fazo, plošče TLC, predhodno prevlečene s silikagelom RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm), detekcija je bila dosežena z razprševanjem z 1 odstotkom Ce(SO4)2–10 odstotki vodne raztopine H2SO4, čemur je sledilo segrevanje .
3.2. Rastlinski material
Sveža steblaCistanche tubulosagojene v Urumqiju, provinca Xinjiang, Kitajska, so bile zbrane septembra 2007. Rastlinski material je identificiral eden od avtorjev (MY). Vavčer za rastlinski material je shranjen v našem laboratoriju.
3.3. Ekstrakcija in izolacija
Sveža steblaCistanche tubulosa(2,98 kg) smo fino narezali in trikrat ekstrahirali z metanolom pod refluksom 3 ure. Uparitev topila pod znižanim tlakom je dala metanolni ekstrakt (249,1 g, 8,36 odstotka). Metanolni ekstrakt smo izpostavili Diaionu HP 20 CC (5.0 kg, H2O?MeOH), da smo dobili frakcije, eluirane z H2O in MeOH (167,84 g, 5,63 odstotka in 81,21 g, 2,73 odstotka). , oziroma). Frakcijo, eluirano z MeOH (61.00 g), smo izpostavili normalni fazi silikagela CC[1,8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15:3:0).4?1{{48} }:3:0.5?6:4:1, v/v/v)?MeOH], da dobimo sedem frakcij [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4(10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) in 7 (4,6 0 g)]. Frakcijo 2 (9,56 g) smo ločili z reverznofaznim silikagelom CC [400 g, MeOH–H2O (1{{201}}:90, v /v)?MeOH?aceton], da dobimo pet frakcij [Fr. 2–1 (55,9 mg), 2–2 (4,48 g), 2–3 (3,42 g), 2–4 (1,16 g) in 2–5 (31,9 mg)]. Frakcijo 2–3 (1.00 g) smo izpostavili HPLC [Cosmo sil 5C18-MS-II, CH3CN–1 odstotek vodne AcOH (7:93, v/ v)] dati sedem ulomkov [Fr. 2–3–1 (66,5 mg), 2–3–2 (20,4 mg), 2–3–3 (26.0 mg), 2–3–4 (136,6 mg), 2–3–5 (38{{300}}.6 mg), 2–3–7 (84,9 mg)]. Frakcijo 2–3–4 (106,6 mg) smo nadalje očistili s HPLC [Cosmosil pNAP,CH3CN–1 odstotna vodna raztopina AcOH (5:95, v/v)], da smo dobili salidrozid (19,13,7 mg, {{340}}.0{{409}}27 odstotkov ). Frakcijo 4 (10.69 g) smo ločili z reverzno faznim silikagelom CC [500 g, MeOH–H2O (30:7 0,v/v)?MeOH?aceton], da dobimo štiri frakcije [Fr. 4–1 (878,2 mg), 4–2 (7.06 g), 4–3 (1,57 g) in 4–4 (792,8 mg)]. Frakcijo 4–2(1,5{{560}} g) smo izpostavili HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 % vodni AcOH (2{{57{{586} }}}:80, v/v)], da dobimo pet ulomkov {Fr. 4–2–1 (42,9 mg), 4–2–2 [= kampneozid I (17, 67.0 mg, 0.014 odstotkov )], 4–2– 3 [= akteozid (5, 1,21 g, 0,26 odstotka)], 4–2–4 (41,6 mg) in 4–2–5 (181,3 mg)}. Frakcijo 4–2–4 (41,6 mg) smo nadalje očistili s HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 odstotek vodne raztopine AcOH (18:82, v/v)], da smo dobili izoakteozid (6, 19,1 mg, 0,0040 odstotka) in cis-akteozid (7,3,4 mg, 0,0007 odstotka). Frakcijo 4–3 (1,57 g) smo očistili s HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 odstotek vodne AcOH (20:80, v/v)], da smo dobili 11 frakcij [Fr. 4–3–1 (30,4 mg), 4–3–2 (55,2 mg), 4–3–3 (= 17, 22,1 mg, 0,0010 odstotka), 4–3–4 (= 5 , 224,6 mg, 0,010 odstotka), 4–3–5 (27,4 mg), 4–3–6 (43,6 mg), 4–3–7 (= 6, 825,0 mg, 0,037 odstotka), 4–3 –8 [= injekcijski lid A 30-OaL-ramnopiranozid (16, 37,6 mg, 0,0017 odstotka )], 4–3–9 (39,8 mg), 4–3–10 [{{310} }acetilakteozid (8, 85,4 mg, 0,0038 odstotka)] in 4–3–11 (64,6 mg)]. Frakcijo 4–3–6 (43,6 mg) smo nadalje očistili s HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 odstotek vodne raztopine AcOH (18:82,v/v)], da smo dobili kankanozide H1 (1, 17,0 mg, 0,0008 odstotka) in H2 (2,3,3 mg, 0,0001 odstotka). Frakcijo 4–3–9 (39,8 mg) smo nadalje očistili s HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 odstotek vodne AcOH (18:82, v/v)], da smo dobili kankanozid I (3, 15,4 mg, 0,0007 odstotka) in 6 ( 3,1 mg, 0,0001 odstotka). Frakcijo 5 (8,84 g) smo ločili z reverzno faznim silikagelomCC [400 g, MeOH–H2O (20:80-30:70, v/v)?MeOH?aceton], da smo dobili sedem ulomkov [Fr. 5–1 (870,2 mg), 5–2 (478,9 mg), 5–3 (3,72 g), 5–4 (979,9 mg), 5–5 (1,19 g), 5–6 (1,27 g) in 5 –7 (130,1 mg)]. Frakcijo 5–1 (870,2 mg) smo očistili s HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN–1 odstotna vodna raztopina AcOH (5:95, v/v)], da smo dobili dekafejev lakteozid (9, 5,1 mg, 0,0002 odstotka) in cistanozid F ( 20, 8,1 mg, 0,0004 odstotka). Frakcijo 5–3 (3,72 g) smo očistili s HPLC [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN–1 odstotek vodne AcOH (15:85, v/v)], da smo dobili šest frakcij [Fr. 5–3–1 (128,6 mg), 5–3–2 [= kankanoza (21, 9,4 mg, 0,0004 odstotka )], 5–3–3 (64,6 mg), 5–3–4 (72,3 mg), 5–3–5 [= stran ehinaka (4, 2,54 g, 0,11 odstotka) in 5–3–6 (318,5 mg)]. Frakcijo 5–3–4 (72,3 mg) smo nadalje očistili s HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 odstotek vodne AcOH (10:90, v/v)], da smo dobili kampneozid II (18,10,6 mg, 0,0005 odstotka). Frakcijo 5–4 (979,9 mg) smo očistili s HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 odstotek vodne AcOH (15:85, v/v)] do danih frakcij [Fr. 5–4–1 (28,6 mg), 5–4–2 (90,5 mg), 5–4–3 (99,7 mg), 5–4–4 (= 4, 25,7 mg, 0,0012 odstotka), 5 –4–5 (16,4 mg), 5–4–6 (318,5 mg), 5–4–7 (21,6 mg), 5–4–8 (= 5, 204,4 mg, 0,0091 odstotka) in 5– 4–9 (134,7 mg)]. Frakcijo 5–4–6 (318,5 mg) smo očistili s HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 odstotek vodne raztopine AcOH (15:85, v/v)], da smo dobili cistantubulozide B1 (11, 44,9 mg, 0,0020 odstotka), B2 (12 , 7,6 mg, 0,0003 odstotka ), in A (15, 21,1 mg, 0,0009 odstotka ) in wiedemanninoside C (14, 17,2 mg, 0,0008 odstotka ). Frakcijo 5–5 (1,19 g) smo očistili s HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 odstotna vodna raztopina AcOH (18:82, v/v)], da smo dobili tubulozid A (10, 300,3 mg, 0,013 odstotka ) in arenariozid (13,5,8 mg, 0,0006 odstotka ). Frakcijo 6 (12,52 g) smo ločili s silikagelom z reverzno fazo CC [600 g, MeOH–H2O (20:80–30:70, v/v)–MeOH–aceton], da smo dobili štiri frakcije [Fr. 6–1 (553,8 mg), 6–2 (10,69 g), 6–3 (1,40 g) in 6–4 (17,8 mg)]. Frakcijo 6–2 (500,0 mg) smo očistili s HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 odstotna vodna raztopina AcOH (25:75, v/v)], da smo dobili 4 (353,1 mg, 0,34 odstotka). ).
3.3.1. Kankanoside H1 (1)
Bel prah, ½a- 24D -45.3 (c 1,06, MeOH). FABMS s pozitivnimi ioni visoke ločljivosti: izrač. za C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Najdeno: 835,2633. UV [MeOH, nm (log e)]: 226 (4,33), 293 (sh, 4,36), 317 (4,52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070, 1044 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: podan v tabeli 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: podan v tabeli 3. FABMS s pozitivnimi ioni: m/z 835 (M plus Na) plus . FABMS z negativnimi ioni: m/z 811 (MH)-.
3.3.2. Kankanozid
H2 (2)A bel prah, ½a- 25D-52.4 (c 0.27, MeOH). FABMS s pozitivnimi ioni visoke ločljivosti: izrač. za C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Najdeno: 835.2644. UV [MeOH, nm (log e)]: 228 (4,26), 290 (sh, 4,22), 316 (4,37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: podan v tabeli 2. 13C NMR (150 MHz, CD3OD) dC: podan v tabeli 3. FABMS s pozitivnimi ioni: m/z 835 (M plus Na) plus FABMS z negativnimi ioni m/z 811 (MH)-.
3.3.3. Kankanosilec I (3)
Bel prah, ½a-25D-62.2 (c 1.00, MeOH). FABMS s pozitivnimi ioni visoke ločljivosti: izrač. za C35H46O18Na (M plus Na) plus: 777,2581. Najdeno: 777,2585. UV [MeOH, nm (log e)]: 246 (3,97), 295 (sh, 4,04), 334 (4,23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070, 1046 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: podan v tabeli 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: podan v tabeli 3. FABMS s pozitivnimi ioni: m/z 777 (M plus Na) plus. FABMS z negativnimi ioni: m/z 753 (MH)-.
3.4. Alkalna in kisla hidroliza 1–3
Raztopine 1, 2 in 3 (vsaka po 1,5 mg) v 5-odstotni vodni raztopini kalijevega hidroksida (KOH, 0.5 ml) smo mešali pri 40 stopinjah 1 uro. Vsako raztopino smo nevtralizirali z Dowex HCR W2 (oblika H plus) in smolo odstranili s filtracijo. Izhlapevanje topila pod znižanim tlakom je dalo ustrezne deacilirane produkte, ki smo jih podvrgli HPLC analizi [stolpec: Cosmosil pNAP, 250 - 4.6 mm id; mobilna faza: CH3CN–1 odstotek vodne AcOH (15:85, v/v); zaznavanje: UV (254 nm); hitrost pretoka: 1.0 ml/min], ki se identificira kot trans-kofeinska kislina (tR 9,9 min od 3), trans-p-kumarinska kislina (tR 17,1 min od 1) in cis-p-kumarinska kislina (tR17,8 min od 2). Nato smo vsakega raztopili v 1.0 MHCl (1.0 mL) in segrevali pri 80 C 3 ure. Po ohladitvi smo reakcijsko zmes nevtralizirali z Amberlite IRA-400 (OH oblika) in smole odstranili s filtracijo. Po odstranitvi topila pod znižanim tlakom smo ostanek ločili s kolono vložka Sep-Pak C18 (H2O=MeOH). Frakcijo, eluirano s H2O, smo podvrgli analizi HPLC pod naslednjimi pogoji: kolona HPLC, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id - 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokio, Japonska); detekcija, optična rotacija [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokio, Japonska); mobilna faza, CH3CN–H2O (85:15, v/v); hitrost pretoka 0,8 ml/min]. Identifikacija L-ramnoze (i) in D-glukoze (ii), sproščenih iz 1, 2 ali 3 v frakciji, eluirani s H2O, je bila izvedena s primerjavo njunih retenzijskih časov in optične rotacije s časi pristnih vzorcev [i,tR 9,9 min (negativno)] in [ii, tR 17,9 min (pozitivno)].
3.5. Biološki test
3.5.1. Reagenti
LPS (iz Salmonella enteritidis), minimalni esencialni medij (MEM) in Williamov E medij so bili kupljeni pri Sigma–Aldrich Chemical (St. Louis, MO, ZDA); fetalni goveji serum (FBS) je bil iz Invitrogena (Carlsbad, CA, ZDA); in druge kemikalije so bile iz Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Osaka, Japonska). 96-Mikroplošče z jamicami so bile kupljene pri Sumitomo Bakelite Co., Ltd (Tokio, Japonska).
3.5.2. Živali
Samci miši ddY so bili kupljeni pri Kiwa Laboratory AnimalCo., Ltd (Wakayama, Japonska). Živali so bile nameščene pri stalni temperaturi 23 ± 2 C in hranjene s standardno laboratorijsko hrano (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokio, Japonska). Vsi poskusi so bili izvedeni z zavestnimi mišmi, razen če ni drugače navedeno. Eksperimentalni protokol je odobril Odbor za eksperimentalne raziskave na živalih Univerze Kinki.
3.5.3. Zaščitni učinki na D-GalN/LPS-inducirano poškodbo jeter pri miših
Metoda, ki so jo opisali Tiegs et al.51, je bila spremenjena in uporabljena za ta poskus. Na kratko, samci miši ddY, ki tehtajo približno 25–30 g, so bili 20 ur pred poskusom posteni. D-GalN (350 mg/kg) in LPS (10 lg/kg), raztopljena v slanici, sta bila injicirana intraperitonealno, da bi povzročila poškodbo jeter. Vsak testni vzorec je bil dan peroralno 1 uro pred injiciranjem D-GalN/LPS. Vzorci krvi so bili zbrani iz infraorbitalnega venskega pleksusa 10 ur po injiciranju D-GalN/LPS. Ravni sAST in sALT so bile določene z metodo Reitman–Frankel (komercialni komplet, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Kot referenčno spojino smo uporabili hidrokortizon. Testne vzorce smo suspendirali s 5-odstotno raztopino arabskega gumija in raztopino dajali peroralno po 10 ml/kg v vsakem poskusu, medtem ko je bil vehikel dajan peroralno po 10 ml/kg v ustrezni kontrolni skupini.
3.5.4. Zaščitni učinki na citotoksičnost, ki jo povzroča D-GalN v primarno gojenih mišjih hepatocitih
Hepatoprotektivni učinek sestavin je bil določen z {{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijevim bromidom (MTT ) kolorimetrični test z uporabo primarno gojenih mišjih hepatocitov.33–43 Hepatocite smo izolirali iz miši maleddY (30–35 g) s perfuzijsko metodo s kolagenazo. Suspenzijo celic na 4 - 104 celic v 100 l Williamovega medija E, ki je vseboval FBS (10 odstotkov), penicilin G (100 enot/mL) in streptomicin (100 lg/mL), smo nacepili v 96-mikroploščo z vdolbinicami in predhodno gojili 4 ure pri 37 stopinjah v atmosferi s 5 odstotki CO2. Mediju smo dodali 100 l svežega medija, ki je vseboval D-GalN (2 mM) z ali brez testnega vzorca in hepatocite gojili 44 ur. Medij smo zamenjali s 100 l svežega medija in mediju smo dodali 10 l MTT [5 mg/mL v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS)]. Po 4 urah inkubacije smo medij odstranili in nato dodali 100 l izopropanola, ki je vseboval 0,04 M HCl, da smo raztopili formazan, proizveden v celicah. Optično gostoto (OD) raztopine formazana smo izmerili z bralnikom mikroplošč pri 570 nm (referenca: 655 nm). Inhibicijo (v odstotkih) dobimo z naslednjo formulo.
Inhibicija ( odstotki )= [(OD(vzorec) - OD(kontrola))/(OD(normalno)-OD(kontrola))] x 100
3.5.5. Učinki na proizvodnjo NO v mišjih peritonealnih makrofagih, stimuliranih z LPS
Presejalni test za proizvodnjo NO z uporabo mišjih peritonealnih makrofagov, induciranih s TGC, je bil izveden, kot je opisano prej.43,46,
3.5.6. Učinki na proizvodnjo TNF-a v mišjih peritonealnih makrofagih, stimuliranih z LPS
TNF-a, sproščen v mediju, je bil določen, kot je opisano prej28, z rahlo spremembo. Na kratko, mišji peritonealni makrofagi, inducirani s TGC (5 - 105 celic/jamico), so bili zbrani iz peritonealnih votlin samcev miši ddY, suspendirani v 100 lL RPMI 1640, dopolnjenega s 5 odstotki FBS, penicilina (100 enot/ mL) in streptomicina (100 lg/mL) ter predhodno gojili v 96-mikroploščah z vdolbinicami pri 37 stopinjah v 5 odstotkih CO2 na zraku 1 uro. Nesprijete celice smo odstranili z izpiranjem s PBS in dodali 100 lL svežega medija, ki je vseboval različne koncentracije testne spojine. Po 10 minutah smo dodali 100 lL medija, ki je vseboval 10 lg/mL LPS, in inkubirali 4 ure. Proizvodnja TNF-a v vsaki vdolbinici je bila določena z uporabo kompleta ELISA (komplet za mišji TNF-a ELISA, Invitrogen). Vsako preskusno spojino smo raztopili v DMSO in raztopino dodali mediju (končna koncentracija DMSO 0,5 odstotka)
3.5.7. Inhibitorni učinki na TNF-a-inducirano celično smrt v celicah L929
Celice L929 (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japonska) so vzdrževali v Minimum Essential Medium Eagle (MEM, Sigma–Aldrich), ki je vsebovala 10 odstotkov FBS, 1 odstotek neesencialnih aminokislin MEM (Invitrogen), penicilin G (100 enot). /mL) in streptomicin (100 lg/mL) pri 37 °C pod 5-odstotno atmosfero CO2. Celice so bile inokulirane v 96-ploščo s tkivno kulturo [3 -104 celic/vdolbinico v 100 l/vdolbinico v MEM]. Po 44 urah inkubacije v mediju TNF-a (20 ng/mL) z ali brez testnega vzorca smo sposobnost preživetja celic ocenili s kolorimetričnim testom MTT (videante).49,50 Vsako testno spojino smo raztopili v DMSO in raztopino smo dodali mediju (končna koncentracija v DMSO 0,5 odstotka).
3.6. Statistika
Vrednosti so izražene kot srednje vrednosti ± SEM. Za statistično analizo je bila uporabljena enosmerna analiza variance (ANOVA), ki ji je sledil Dunnettov test. Vrednosti verjetnosti (p), manjše od 0,05, so veljale za pomembne.
Zahvala
TM, KN in OM so bili podprti s subvencijo pomoči za znanstvene raziskave iz projekta 'High-tech Research Centre' za zasebne univerze: ustrezna subvencija sklada iz donacije pomoči za znanstvene raziskave Ministrstva za izobraževanje, kulturo , Šport, znanost in tehnologija (MEXT) na Japonskem, 2007–2011 in tudi podprto s štipendijo pomoči za znanstvene raziskave MEXT. MY in HM sta bila podprta s 21. programom COE, projektom Academic Frontier in štipendijo za znanstvene raziskave MEX
Od: ' Aciliranofeniletanoidoliglikozidi s hepatoprotektivnim delovanjem iz puščavske rastlineCistanche tubulosa' odToshio Morikawa idr
---Bioorganska in medicinska kemija 18 (2010) 1882–1890.
