Cepivo proti adenovirusu, ki vsebuje skrajšano podenoto S1 beljakovine SARS-CoV-2, vodi do specifičnega imunskega odziva pri miših

Prevajanje...ct:Razvoj učinkovitega in varnega cepiva proti koronavirusni bolezni 2019 (COVID-19) je glede na trenutne razmere ključen pristop za obvladovanje pandemije hude akutne respiratorne bolezni koronavirus 2 (SARS-CoV-2). V tej študiji smo izdelali skrajšan segment optimiziranega gena SARS-CoV-2 spike (2043 bp, imenovan S1), ki je lahko kodiral skrajšani protein S1. Protein so testirali, da bi ugotovili, ali lahko izzove učinkovito imunizacijo pri miših proti SARS-CoV-2. Prisotnost proteina S1 smo potrdili z imunofluorescenco in Western blotom. Cepivo proti adenovirusu, ki je nosilo genski fragment S1 (Ad-S1), so mišim dajali intramuskularno štirikrat v 4 tednih. Humoralna imunost na protein SARS-CoV-2 S1 je bila dokazana pri vseh imuniziranih miših. Serum imuniziranih miši je pokazal odlično protiinfekcijsko aktivnost in vitro. Pri miših so po cepljenju z Ad-S1 opazili močan humoralni imunski odziv proti SARS-CoV-2, kar nakazuje, da lahko cepivo proti adenovirusu pomaga pri razvoju cepiv proti SARS-CoV-2 in drugim genetsko ločenim virusi.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Ključne besede: SARS-CoV-2; cepiva; adenovirusni vektor; gen S1; imunost

1. Uvod

Koronavirusna bolezen 2019 (COVID-19) je pogosto povezana z odpovedjo več organov in visoko stopnjo umrljivosti [1] ter predstavlja veliko grožnjo za javno varnost po vsem svetu. Od 15. julija 2022 je pandemija COVID-19 vztrajala po vsem svetu s 557.917.904 potrjenimi primeri, vključno s 6.358.899 smrtnimi primeri, o katerih je poročala Svetovna zdravstvena organizacija (WHO). Poleg tega je bilo do 11. julija 2022 danih skupno 12.130.881.147 odmerkov cepiva. Zato sta načrtovanje in razvoj cepiv proti novemu koronavirusu (nCoV) velikega pomena in ena glavnih svetovnih zdravstvenih prioritet. Protein S je ključni dejavnik pri vstopu SARS-CoV-2 hude akutne respiratorne bolezni koronavirus 2 (SARS-CoV-2) v gostiteljske celice [2,3]. Protein se veže na gostiteljski receptor in omogoči virusu nemoten vstop v gostiteljsko celico [4]. N-povezani glikani štrlijo iz površine trimerja in obsežno okrasijo protein S, kar vpliva na zvijanje proteina S, humoralno imunost in procesiranje proteaze v gostiteljski celici [5]. Protein S SARS-CoV-2 ima nižjo gostoto glikana, povezanega z N, kot drugi proteini S, ki jih povzroči človeški patogeni koronavirus [6]. Zato je protein S lahko zelo imunogen in je glavna tarča nevtralizirajočih protiteles. Protein S ima tri strukturne domene, med katerimi je domena S1 najpomembnejši površinski antigen proteina S [4]. Zaradi težav s proizvodnjo velikih rekombinantnih proteinov (zunajcelična domena proteina S je približno 1300 aminokislin) in tveganja protitelesno odvisnega povečanja (ADE) okužbe, S1 (približno 700 aminokislin) in njegova receptorsko vezavna domena (RBD, približno 200 aminokislin) na splošno veljajo za najbolj privlačne potencialne tarče za cepivo proti koronavirusu [7,8]. Človeški adenovirus serotipa 5 (HAdV-C5) se pogosto uporablja v osnovni virologiji kot vektor za gensko terapijo in dostavo cepiva [9]. HAdV-C5 ima naravno raznolikost in lahko parazitira na večini gostiteljev, kar je podlaga za razvoj poskusov na živalih. Rekombinantni adenovirusni vektorji z napakami v replikaciji in replikaciji, zgrajeni iz HAdV-C5, so bili pogosto uporabljeni pri dajanju cepiv in genski terapiji [9,10]. Trenutno so adenovirusi odobreni kot cepiva proti akutnim okužbam dihal in opravljenih je bilo veliko preskušanj takšnih cepiv, na primer proti malariji in HIV-1 [9]. V tem prispevku opisujemo vektorsko cepivo proti adenovirusu SARS-CoV-2 s pomanjkljivo replikacijo človeka ter njegovo pripravo in uporabo. V tej študiji je bilo cepivo proti adenovirusu izdelano na naslednji način: vektor je bil adenovirus HAdV-C5 s pomanjkljivo replikacijo človeka z delecijo E1 in E3, skeletni plazmid je bil rekombinantni adenovirus s pBHGlox∆E1,3Cre, pakirna celična linija so bile celice HEK293, in ciljni gen je bil skrajšani gen proteina S1 SARS-CoV-2. Ekspresija proteina S1 v cepivu je bila identificirana z Western blot in imunofluorescenčnimi testi. Za določitev kakovosti imunskih odzivov, ki jih sprožijo kandidati za cepivo na osnovi konic, je bil podrobno preučen odziv protiteles po cepljenju. Imunska korist cepiva je bila ovrednotena s testom vezave protiteles (encimski imunosorbentni test [ELISA]) in testom nevtralizacijskih protiteles. Naše ugotovitve zagotavljajo osnovo za razvoj in oceno cepiv proti COVID-19 in zdravljenja, ki temeljijo na beljakovini S1.

2. Materiali in metode

2.1. Celice in živali

V tej študiji sta bili uporabljeni celični liniji opičjih ledvic HEK293 in Vero E6. Obe celični liniji sta gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM), dopolnjenem z 2 % fetalnega govejega seruma (FBS) ter 1 % penicilina in streptomicina pri 37 ◦C s 5 % CO2 in nasičeno vlago. Dvajset samic miši C57BL/6 (6–8 tednov) je bilo kupljenih v Zhejiang Animal Experimental Center v provinci Zhejiang. Miši so bile naključno razdeljene v dve skupini z 1 0 mišmi v vsaki skupini. Ena skupina je bila imunizirana (100 µL intraperitonealna injekcija) z vektorjem Ad5, ki izraža SARS-CoV-2 spike protein (Ad5-S), druga pa s PBS (100 µL intraperitonealna injekcija) kot kontrolo. Skupna količina virusa je bila 5 × 109 VP. Vse miši so bile imunizirane z D0/D14 intramuskularno injekcijo [11,12]. Pri D14 smo vzeli 100 µL periferne krvi, ločili serum in dve uri po odvzemu krvi dali drugo injekcijo. Pri D28 je bila kri zbrana z retro-orbitalno punkcijo in serum je bil ločen. Vezavna protitelesa so bila odkrita 3 dni po vsakem odvzemu krvi, nevtralizirajoča protitelesa so bila odkrita 7 dni po vsakem odvzemu krvi, citokini pa 7 dni po drugem odvzemu krvi. Vse miši so bile evtanazirane; vsi testi so bili izvedeni v strogem skladu s "Smernicami za nego in uporabo poskusnih živali Ljudske republike Kitajske" in odobreni s strani Etičnega sveta univerze Zhejiang Shuren.

2.2. Cepiva

Vsi sevi SARS-CoV-2, uporabljeni v tej študiji, so bili zbrani pri bolnikih s COVID-19 s soglasjem. Državni ključni laboratorij za diagnostiko in zdravljenje nalezljivih bolezni je razvil cepivo proti adenovirusu (celica Vero, sev WuHan, številka GISAID: EPI_ISL_415711) proti SARS-CoV-2 in nato cepivo je bilo izdelano v okolju, skladnem s stopnjo biološke varnosti (BSL). Specifikacija cepiva je 0,5 ml/odmerek in vsebuje Tris, NaCl, trsni sladkor, MgCl2,6H2O, C6H9N3O2, absolutni etanol in protein SARS-CoV-2 S1.

2.3. Konstrukcija rekombinantnega adenovirusa

Proteinsko zaporedje SARS-CoV-2 S1 (št. QRU91950.1) je bilo pridobljeno pri PubMed. Glede na degeneracijo gena je bilo optimizirano nukleotidno zaporedje kodona, primerno za izražanje celic sesalcev, zasnovano na predpostavki, da je aminokislinsko zaporedje proteina produkta, ki ga kodira protein SARS-CoV-2 S1, ostalo nespremenjeno. Skupna dolžina je bila 2043 bp. Zaporedje prekurzorja 50 je bilo sintetizirano s tkivnim aktivatorjem plazminogena (tPA), zaporedje, ki kodira SARS-CoV-2 S1 aminokislino 2–688, in zaporedje prekurzorja tPA pa sta bili povezani. Kozakovo zaporedje in restrikcijsko mesto SpeI smo dodali pred začetni kodon in restrikcijsko mesto XbaI smo dodali za terminacijskim kodonom. Nukleotidne sekvence zgornjih genov je Sangon Biotech sintetiziral in kloniral v pUC18, da bi pridobil klonirani plazmid sintetičnega gena. Sintetizirano zaporedje gena S1 in vektor pDC316 smo razgradili z restrikcijskima endonukleazama SpeI in XbaI. Ciljni fragment in vektor sta bila pridobljena iz gela in povezana, da sta tvorila shuttle plazmid. Plazmid SARS-CoV-2 shuttle je bil zapakiran z skeletnim plazmidom adenovirusnega sistema AdMax pBHGloxd∆E1 in 3Cre s sotransfekcijo celic HEK293. Primarno virusno raztopino smo dobili po večkratnem zamrzovanju-odmrzovanju in centrifugiranju, virus pa smo pomnožili in gojili po čiščenju plaka.

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

2.4. Določanje titra adenovirusa

Celice HEK293 v dobrem zdravju so bile izbrane in ponovno suspendirane, da smo pripravili 5.0 × 105 celic/mL celične suspenzije, ki smo jo zasejali v 24-ploščo z jamicami (1 ml/jamico ) in gojeni pri 37 ◦C v okolju s 5% CO2. Vzorec je bil serijsko desetkrat razredčen in razredčen vzorec (0,1 ml) 10−5 do 10−8 celic je bil nacepljen na 24-ploščo z jamicami . Nato smo plošče za 48 ur izpostavili okužbi pri 37 ◦C s 5% CO2. Nato smo gojišče odstranili, dodali predhodno ohlajen metanol (0,5 ml) in vzorce fiksirali pri -20 °C 20 minut. Po fiksaciji smo vzorce sprali s fosfatnim pufrom (PBS) in blokirali z 1% govejim serumskim albuminom (BSA, 0,2 ml) pri 37 °C 1 uro. Nato smo dodali primarna (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) in sekundarna (Goat pAb proti MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) protitelesa in jih inkubirali 1 uro, med tem PBS je bil uporabljen za pranje. Po inkubaciji dodamo na novo pripravljeno delovno raztopino (0,2 ml) in inkubiramo 5–10 minut pri sobni temperaturi. Nato smo delovno raztopino zavrgli, vzorce sprali s PBS in ponovno dodali PBS (1 ml). Izračunano je bilo povprečno število pozitivnih celic v mikroskopskem polju (kat. CKX53, raziskovalni invertni sistemski mikroskop OLYMPUS), kjer je bil izbran gradient s 5–50 pozitivnimi celicami v vidnem polju in naključno izbranih vsaj pet področij za štetje. . Izračunano je bilo število vidnih polj v vsaki vdolbinici 24-plošče z vdolbinicami. Nato smo izračunali titer virusa po naslednji formuli (1):

2.5. PCR v realnem času

Za odkrivanje ekspresije celične mRNA HEK293 po virusni okužbi smo ekstrahirali vmesno RNA v skladu z navodili za uporabo TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, ZDA). Celotna RNA je bila ekstrahirana z uporabo TRIzola in obdelana z RQ1 RNazo brez DNaze I (Promega, Madison, WI, ZDA), da se odstrani preostala DNA. Komplementarna DNA (cDNA) je bila pridobljena z reverzno transkripcijo ekstrahirane RNA z uporabo reagentnega kompleta PrimerScript™ RT s kompletom gDNA Eraser Kit (Takara, Kusatsu, Japonska). Fragmenti DNA so bili ustvarjeni s specifičnimi primerji P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30 ) in P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30 ) ciljnega gena (S1). Gen je bil pomnožen s primerji P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30 ) in P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30) kot notranji nadzor (GAPHD).

2.6. Western Blot

Celični lizat in supernatant smo ločili z elektroforezo v natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) in nato prenesli na membrane iz poliviniliden fluorida (PVDF). Blote smo vizualizirali z opremo za slikanje Western blot (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA). Na kratko, membrane smo prenesli v TBST (50 mL Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0,5 mL], 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween -20) s 5 % nemastnim suhim mlekom v prahu in stresajte na stresalniku za razbarvanje pri sobni temperaturi 1 uro. Membrane poskusne in kontrolne skupine so bile odstranjene iz raztopine za tesnjenje in inkubirane s primarnim protitelesom: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, kat. #40591- T62, Sino Biological, Peking, Kitajska)] pri sobni temperaturi. Primarna protitelesa smo stresali in inkubirali čez noč na stresalniku za razbarvanje pri 4 ◦C. Blot smo sprali z raztopino TBST in 2 uri inkubirali s sekundarnim protitelesom [kozji anti-kunčji imunoglobulin G (IgG) H&L (HRP) (1:10.000, kat. #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Po izpiranju so madeže inkubirali 1 minuto s kompletom LumiBest ECL Substrate Solution (kat. št. 4AW011-100, 4A Biotech) in nato opazovali v napravi za slikanje.

2.7. Imunofluorescenčni test

Celice HEK293 (3 × 106/jamico) smo zasejali v 12-plošče z jamicami. Po 48 urah smo celice okužili z adenovirusom, ki vsebuje gen S1 (Ad-S1). Po 48 urah smo medij aspirirali in celice enkrat sprali s PBS, ki je vseboval 2% BSA, in fiksirali 15 minut z metanolom, ki je bil predhodno ohlajen 15 minut pri -20 °C. Po treh izpiranjih z 2% BSA v PBS smo celice permeabilizirali z 0,5% Triton X-100 10 minut. Nato smo celice blokirali 1 uro z 2 ml 2% BSA, raztopino za blokiranje smo zavrgli in celice trikrat sprali s PBS. Nato smo v vsako vdolbino dodali 2 ml primarnega protitelesa [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, kitajsko biološko)] in inkubiramo pri sobni temperaturi 1 uro ali 4 ◦C čez noč. Nato smo vzorec trikrat izpirali z 2% BSA 5 minut na izpiranje. Nato smo v vsako vdolbinico dodali 2 mL sekundarnega protitelesa [kozji anti-kunčji IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, kat. #550037, ZenBio)] in 1 uro inkubirali pri sobni temperaturi. Nato smo vzorce trikrat izpirali z 2% BSA 5 minut na izpiranje. V vsako vdolbinico smo dodali raztopino 40,6-diamidino-2-fenilindola (DAPI) (2 mL, 1 mg/mL) (1:400, kat. #S0001, Bioss, Woburn, MA, ZDA). in reagiral 10 minut v temi. Analizo so opazovali s slikovnim sistemom EVOS™ M7000 (kat. št. AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

Protein SARS-CoV-2 S (1 µg/mL) je bil čez noč prevlečen v 96-ploščah z vdolbinicami (100 µL/vdolbinico) z 0. 05 M bikarbonatni pufer. Po izpiranju s PBST (0.2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween-20, dodajte vodo do 1000 mL) pet krat dodali raztopino za blokiranje in inkubirali pri 37 ◦C 1 uro. Vzorec seruma smo razredčili in dodali v vsako vdolbinico (100 µL/vdolbinico). Po 1 h inkubacije pri 37 ◦C smo vzorce petkrat sprali s PBST. Dodali smo primarno protitelo [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, kitajsko biološko)] in ga inkubirali 1 uro, nato vzorce smo petkrat sprali s PBST, čemur je sledila 1-urna inkubacija pri 37 ◦C s sekundarnim protitelesom, konjugiranim s hrenovo peroksidazo [kozji anti-kunčji IgG H&L (HRP) (1:10.000, kat. #ab6721, abcam)] in pet opere s PBST. Po dodajanju 3, 30, 5 in 50-tetrametil bifenil anhidrida 5 minut smo reakcijo zaustavili z 2 M žveplovo kislino. Optična gostota je bila izmerjena pri 450 nm in 630 nm z instrumentom za označevanje encimov (Molecular Devices, SpectraMax 190) in nato prilagojena standardni krivulji.

Prednosti cistanche tubulosa- okrepiti imunski sistem

2.9. Določanje citokinov 

Ploščo (kat. #T-k15048D-1, MSD) smo trikrat sprali s 150 µL/vdolbino izpiralnim pufrom in v vsako vdolbinico dodali 50 µL pripravljenega vzorca. Nato smo ploščo zaprli z lepilnim pokrovom in inkubirali pri sobni temperaturi s stresanjem 2 uri. Nato smo ploščo trikrat sprali s 150 µL/vdolbino pralnega pufra in v vsako vdolbinico dodali 25 µL detekcijske raztopine protiteles. Ploščo ponovno zapremo in inkubiramo pri sobni temperaturi s stresanjem 2 uri. Nato smo ploščo trikrat sprali z vsaj 150 µL/vdolbino izpiralnim pufrom; V vsako vdolbinico smo dodali 150 µL 2× Read Buffer T (MSD) in ploščo analizirali na instrumentu MSD.

2.10. Nevtralizirajoče protitelo

2.10.1. Test nevtralizacije psevdovirusa

Aktivnost nevtralizacije mišjega seruma je bila testirana z uporabo psevdovirusnega sistema virusa vezikularnega stomatitisa (VSV). Serum smo inaktivirali v vodni kopeli {{0}}.5 h pri 56 ◦C in nato serijsko razredčili do zahtevanega območja. Celice HEK293 smo nasadili na 96-ploščo z jamicami. Razredčen serum smo zmešali z 200 CCID50 (odmerek virusa, ki lahko okuži 50 % celične kulture)/100 µL suspenzije virusa v razmerju 1:1 in ga dali v CO2 inkubator (37 ± 1 ◦C) za 2 uri Nato smo v vsako vdolbino dodali 100 µL raztopine za vzdrževanje virusa, ki je vsebovala 0,5 % dvojnega protitelesa penicilin-streptomicin, in nevtralizirano zmes inokulirali v 96-ploščo z vdolbinicami, ki je vsebovala celice po 100 µL na vdolbinico, z dvema ponovnima vdolbinicama za vsako redčenje. Istočasno smo nastavili normalno celično kontrolo in celice inkubirali v CO2 inkubatorju (37 ± 1 ◦C) 96 ur. Nato je bilo 200 CCID50/100 µL raztopine virusa razredčeno na 10-1~10-3. Gojišče celične kulture v 96-plošči z vdolbinicami smo zavrgli, v vsako vdolbinico smo dodali 150 µL raztopine za vzdrževanje virusa in razredčeno raztopino virusa inokulirali pri koncentraciji 10-1~{{33} } v vdolbinice 96-plošče z vdolbinicami (50 µL na vdolbinico). Vsako razredčitev smo ponovili v 8 vdolbinicah; istočasno je bila nastavljena normalna celična kontrola, ki ji je sledila kultura 96 ​​ur. Spremembe celičnega CPE so opazovali pod invertnim mikroskopom. Normalna celična kontrola ne sme imeti citopatskih sprememb, pozitivna kontrola pa mora imeti spremembe CPE. Končne točke nevtralizacije (razredčitve seruma, pretvorjene v logaritme) so bile izračunane z opazovanjem CPE. Seronegativno/pozitivno merilo je bilo 1:12 kot pozitivno/negativno merilo,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Test nevtralizacije v živo

Aktivnost nevtralizacije mišjega seruma je bila ocenjena z nevtralizacijskim testom v živo. Razredčen serum smo zmešali s SARS-CoV-2 in 1 uro inkubirali pri 37 ◦C. Mešanico smo dodali v 96-ploščo z jamicami za okužbo celic Vero E6. Po 72- h inkubacije pri 37 ◦C smo opazili citopatski učinek virusa (CPE) pod × 40-kratno povečavo in izračunali nevtralizacijski titer (recipročno 50-odstotno razredčitev seruma, potrebno za nevtralizacijo okužbe z virusom). Vsi zgornji postopki so bili izvedeni v okolju 3. stopnje biološke varnosti.

2.11. Statistična analiza

Statistične analize so bile izvedene s t-testom dveh vzorcev z uporabo SPSS 26. P-vrednosti Manjše ali enake 0.05 so veljale za pomembne. Centralno težnjo smo izmerili z geometrijsko sredino titra (GMT).

3. Rezultati

3.1. Konstrukcija rekombinantnega adenovirusa

Dobili smo rekombinantni adenovirusni shuttle plazmid pAdeno-CMV-S1 s pravilno vstavitvijo; njegov strukturni diagram je prikazan na sliki 1. Rekombinantni adenovirus je vseboval genom HAdV-C5 brez regije E1/E3. Shematski diagram rekombinantnega adenovirusnega vektorja, pridobljenega s transfekcijo plazmida shuttle in citoskeletnega plazmida v celicah HEK293, je prikazan na sliki 1.

3.2. Karakterizacija rekombinantnega adenovirusa

Rekombinantni plazmid, ki vsebuje ciljni gen, je bil identificiran s PCR (glej sliko 2A za rezultate gelske elektroforeze). To je bil ponovljen poskus. Sekvenci primerjev sta bili MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag in S1-R acaataagtagggactgggtc, sekvenciranje pa je potrdilo, da je zaporedje skladno z zasnovo. Izražanje SARS-CoV-2 S1 v celicah je bilo zaznano z Western blottingom (slika 2B) in indirektno imunofluorescenco (slika 2C). Obarvanost pasu (~ 75 kDa) je bila odkrita z Western blottingom in je bila skladna s pričakovanim položajem pasu. Na transkripcijski ravni je bila ekspresija S1 in vitro odkrita s PT-PCR. Rezultati so pokazali, da je bila ekspresija S1 mRNA v celicah HEK-293 bistveno večja kot v kontrolni skupini.

Slika 1. Izdelava rekombinantnega adenovirusnega cepiva in poskusna strategija. (A) pAdeno-CMV-S1 je rekombinantni adenovirusni shuttle plazmid, ki vsebuje ciljni gen S1. pBHGlox∆E1,3Cre je skeletni plazmid adenovirusa. pBHGlox∆E1,3Cre in pAdeno-CMV-S1 smo ekstrahirali s kompletom za ekstrakcijo plazmidov QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Peking, Kitajska). En dan pred transfekcijo smo celice HEK293 pasirali v 25 cm2 bučko za celično kulturo. Gojišče je bil DMEM, ki je vseboval 5% FBS brez antibiotikov. Drugi dan je bilo izbranih 60–80 % celic in celicam dodana transfekcijska raztopina. Po 7 dneh transfekcije smo celice postrgali, centrifugirali, supernatant zavrgli in celice oživili s PBS. Celice so bile večkrat zamrznjene in odmrznjene pri –80 ◦C in 37 ◦C. Po centrifugiranju je supernatant vseboval primarno raztopino virusa. Rekombinantni sev adenovirusa je bil prečiščen, pomnožen in pridobljen po nadaljnji obdelavi ter označen z Ad-S1. Cepivo so miši injicirali intramuskularno za nadaljnje študije. (B) Prikazana časovna lestvica imunizacije in odvzema krvi.

3.3. Titer adenovirusa

V tem poskusu je bilo izračunano povprečje šestih pozitivnih celic v petih mikroskopskih poljih, virus v vdolbinici pa je bil razredčen 108-krat. Na podlagi formule, opisane v razdelku Materiali in metode, je bil titer adenovirusa 4,74 × 1011 enot, ki tvorijo plak (pfu)/mL (slika 2D).

3.4. Celična imunost po cepljenju

Med preskusnim obdobjem je prišlo do statistično značilnih sprememb serumskih citokinov (p manj kot ali enako 0,05), kar je v glavnem pokazalo, da je bila koncentracija keratinocitnega kemoatraktanta/človeškega rastno reguliranega onkogena (KC/GRO) znižale in koncentracije IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1 , IL-2, IL-4, IL{{10} } in TNF-, medtem ko se koncentracija IL-6 ni bistveno spremenila (slika 3).

Slika 2. Identifikacija rekombinantnega proteina HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 in določitev titra adenovirusa. (A) PCR detekcija rekombinantnega plazmida s ciljnim genom S1. (B) Western blot detekcija SARS-CoV-2. Celice HEK293 z eksponentno rastjo so bile 48 ur okužene s SARS-CoV-2, nato pa je bil celični protein ekstrahiran in ločen s SDS-PAGE. Ekspresija SARS-CoV-2 je bila potrjena z Western blottingom s kozjim protikunčjim IgG. (C) Imunofluorescenčna mikroskopija celic HEK-293, okuženih z Ad-S1 (zeleno). Celice so bile kontrastno obarvane s 40, 6-diamidino- 2-fenilindolom (DAPI), da se obarvajo jedra. Lestvica merila 1000 µm. (D) Za merjenje je bil uporabljen test plakov. Mikrografije, ki prikazujejo razredčenje 10-5, 10-6, 10-7 in 10-8 (od leve proti desni).

Slika 3. Ad-S1 inducira spremenjene plazemske ravni citokinov tipa 1/2, interferonov tipa 1 in drugih citokinov. Rezultate smo odkrili z odvzemom krvi miši 7 dni po prvi imunizaciji. Podatki so predstavljeni kot razpršene ploskve s škatlami in brki. Vsak krog predstavlja enega posameznika. p-vrednosti so bile izračunane s t-testom dveh vzorcev.

3.5. Odkrivanje protiteles proti SARS-CoV-2 S1 po imunizaciji

ELISA je pokazala, da so bila protitelesa, specifična za SARS-CoV-2-, prisotna v miših, ki so jim vbrizgali prvi in ​​drugi Ad-S1, ne pa tudi v tistih, ki so jim vbrizgali kontrolno adenovirusno kapsido ali raztopino PBS (Ad/PBS) (slika 4A). Titre IgG 1:210 in 1:212 so odkrili pri miših, cepljenih z Ad-S1-, dva tedna po prvi oziroma drugi imunizaciji. Titer razredčitve 28 dni po cepljenju (D28, GMT 2297,4) je bil 61-krat višji od tistega pri D14 (GMT 378,9).

Slika 4. Ad-S1 inducira visoke titre protiteles (A) in nevtralizacijsko aktivnost (B, C) pri miših. (A) ELISA SARS-CoV-2-specifičnega serumskega IgG iz miši, imuniziranih z Ad-S{6}}. (B) Analiza psevdovirusnih aktivnosti seruma miši, imuniziranih z Ad-S1-. (C) Analiza nevtralizirajočih aktivnosti seruma miši, imuniziranih z Ad-S{10}}

3.6. Test nevtralizirajočih protiteles

Izzivanje SARS-CoV-2 celic Vero E6 je omogočilo odkrivanje nevtralizirajoče aktivnosti v serumu imunizirane miši (slika 4B, C). Nevtralizacijska titra D14 in D28 celic Vero E6, imuniziranih z Ad-S1-, proti okužbi z živim virusom SARS-CoV{{10}} in vitro sta bila 1:24,3 oziroma 1:26,3. Test psevdovirusa je dal podobne rezultate kot test živega virusa, z nevtralizacijskimi titri do 1:28,1 in 1:29,6 pri D14 oziroma D28. Nevtralizirajoči titer psevdovirusa D28 (GMT 769,0) je bil 27-krat višji kot pri D14 (GMT 283,7).

4. Razprava

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 do<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

V tej študiji smo izdelali rekombinantno adenovirusno cepivo SARS-CoV-2, ki vsebuje podenoto SARS-CoV-2 S1, in ga označili kot Ad-S1. Tako kot CanSinoBIO, ki je bil odobren za trženje [28], smo v tem cepivu uporabili HAdV-C5. Adenovirus se pogosto uporablja v rekombinantni genski terapiji in kot vektor cepiva. Vendar je seropozitivna stopnja HAdV-C5 pri normalni populaciji kar 75–80 % [29]. To pomeni, da imunost pred shranjevanjem proti vektorjem HAdV-C5 bistveno zmanjša imunost, ki jo povzroči cepivo. ChAdOx1 nCoV-19, razvit na Univerzi v Oxfordu v Združenem kraljestvu, uporablja adenovirusni vektor šimpanzov, ki ima, nasprotno, nižjo stopnjo seropozitivnosti pri ljudeh in, ko je pozitiven, običajno predstavlja nižji titer serumskih protiteles [30]. . Zato je mogoče raziskati adenovirusne vektorje, ki se lahko izognejo že obstoječi imunosti, da bi povečali zaščitno učinkovitost cepiva proti adenovirusu. V tej študiji je bil serumski status miši pred in po imunizaciji določen z ELISA in nevtralizacijskimi testi ter je dal dokaze o humoralni imunosti za kandidate za cepivo. Serum, proizveden po intramuskularnem injiciranju cepiva pri miših, je učinkovito zaščitil celice Vero E6 pred okužbo s SARS-CoV-2 in vitro (slika 4). Zaznali smo tudi močnejši imunski odziv in boljšo zaščito pri miših po drugi imunizaciji (slika 4). Naši eksperimentalni rezultati so podobni običajnim eksperimentalnim rezultatom.

Ker se raziskave SARS-CoV-2 nadaljujejo, je več študij pokazalo, da lahko citokinska nevihta, ki je posledica okužbe s SARS-CoV-2, vpliva na proizvodnjo T-celic, zaradi česar bolniki težko ohranijo dolgoročno imunost na SARS-CoV-2 [31]. Zato je treba ugotoviti, ali lahko Ad-S1 inducira T-celično posredovano imunost pri miših. Naši rezultati so pokazali, da so se koncentracije IFN- in IL-12 povečale, koncentracije IL-4 pa zmanjšale v skupini Ad-S1, kar kaže, da je s cepivom povzročeno preživetje in rast celic Th1 pri miših. Izločanje IL-12, IL-10 in TNF s celicami Th1 se je v poskusni skupini nekoliko povečalo. Ti rezultati so pokazali, da je Ad-S1 pri miših učinkovito induciral Th1-pristranski T-celični odziv [32]. Povečan IL-5 je pokazal, da tudi Th2 celice sodelujejo pri imunskem odzivu in povzročajo določene učinke. Koncentracija KC/GRO v eksperimentalni skupini je bila znatno zmanjšana v primerjavi s koncentracijo v kontrolni skupini s PBS, kar je lahko posledica zmanjšane kemotakse nevtrofilcev, ki je zatrla vnetni odziv in omogočila rahlo kontrolo neželenih učinkov cepiva. To bi bilo bolj koristno za ljudi z oslabljenim imunskim sistemom, kot so starejši ali bolniki na kemoterapiji. Li M., et al. [29] so razvili cepivo proti adenovirusu z uporabo Ad68 kot vektorja. Rezultati so pokazali, da je in vivo nevtralizacijsko aktivnost SARS-CoV-2 mogoče zaznati v dveh tednih po intramuskularni imunizaciji miši BALB/c in nato še naprej naraščati, titer nevtralizacijskih protiteles (PRNT ID50) pa je dosegel 957,3 pri osmih tedne. Medtem je v študiji Liu J. et al. [33] so razvili cepiva, ki kot vektorja uporabljajo AdC6 in AdC68; odziva na vezavna in nevtralizirajoča protitelesa po imunizaciji sta nastala 14 dni po odmerku s titrom IgG 7108 (geometrična sredina titra, GMT; AdC6) in 5489 (GMT, AdC68). Nevtralizacijski titer 50 (NT50) nevtralizacijskega testa psevdovirusa je bil 125 (GMT, AdC6) in 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

V tej študiji so miši, cepljene z Ad-S1, imele titre IgG 1:1010 in 1:122, odkrite z ELISA dva tedna po prvi oziroma drugi imunizaciji. Titer razredčitve ad-s1 je bil 378,9 (GMT) 14 dni po inokulaciji in 2297,4 (GMT) 28 dni po inokulaciji. V testu nevtralizacijskih protiteles so celice Vero E6, imunizirane z Ad-S1, pokazale 1:24,3 in 1:26,3 nevtralizacijo pri D14 oziroma D28 proti izzivu živega virusa SARS-CoV-2 in vitro. Nevtralizacijski titri psevdovirusa pri D14 in D28 so bili 283,7 (GMT) oziroma 769,0 (GMT). Tako je bilo cepivo v tej študiji bolj učinkovito v smislu imunskega odziva v mišjem modelu.

Zaradi omejitev eksperimentalnih pogojev nismo izvedli analize ELISpot (ang. enzyme-linked immunosorbent spot) imunskih celic vranice poskusnih miši. Poleg tega poskusov zaščite pred napadi SARS-CoV-2 na miših ni bilo mogoče izvesti zaradi omejitev laboratorija za fizično zaščito. Vendar smo ugotovili, da je imelo cepivo visoko učinkovitost pri mišjih modelih in bi ga lahko uporabili kot idealen rezervni sev cepiva. Poleg tega je treba imunogenost, varnost in učinkovitost potencialnih kandidatov za cepivo proti SARS-CoV-2 preučiti na dodatnih živalskih modelih (npr. kuncih, primatih, rakunih, psih), saj mišji modeli morda ne bodo v celoti podvajali človeških imunoloških Lastnosti.

rastlina cistanche krepi imunski sistem

5. Sklepi

Podatki, pridobljeni v naših predkliničnih študijah cepiva proti adenovirusu, so pokazali, da je cepivo dovolj varno in učinkovito. Zato je lahko obetavno in izvedljivo profilaktično cepivo proti okužbi s SARS-CoV-2.

Reference

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; Dimopoulos, MA Vpogled v življenjski cikel SARS-CoV-2, patofiziologijo in racionalizirana zdravljenja, ki ciljajo na klinične zaplete COVID-19. J. Biomed. Sci. 2021, 28, 9. [CrossRef]

2. Pillay, TS Gen meseca: 2019-nCoV/SARS-CoV-2 nov koronavirusni konični protein. J. Clin. Pathol. 2020, 73, 366–369. [CrossRef]

3. Šejnin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. Regresija pljučnega raka pri miših z intranazalnim dajanjem SARS-CoV-2 Spike S1. Raki 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, pandemični koronavirus: Molekularni in strukturni vpogled. J. Basic Microbiol. 2021, 61, 180–202. [CrossRef]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Strukturne značilnosti spike proteina koronavirusa SARS-CoV-2: Tarče za cepljenje. Life Sci. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Stene, AC; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Glikanski ščit in maskiranje epitopa proteina konice koronavirusa, opazovanega s krioelektronsko mikroskopijo. Nat. Struct. Mol. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 je boljši od RBD kot antigen podenote cepiva COVID-19. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [CrossRef]

8. Theoharides, TC; Conti, P. Bodite pozorni na koničaste beljakovine SARS-CoV-2: obstaja več, kot se zdi na prvi pogled. J. Biol. Regul. Homeost. Agenti 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Hung, T.; Lu, Z.; Tan, W. Sistemska in mukozna imunost pri miših, izzvana z enkratno imunizacijo s cepivi na osnovi humanega adenovirusa tipa 5 ali 41, ki temeljijo na vektorjih, ki prenašajo spike protein koronavirusa respiratornega sindroma Bližnjega vzhoda. Imunologija 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Najsodobnejša vektorologija humanega adenovirusa za terapevtske pristope. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [CrossRef]

11. Xing, K.; To, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Učinkovitost in varnost cepiv proti COVID-19: sistematični pregled. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [CrossRef]

12. Voysey, M.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, PM; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabas, SL; Bhorat, QE; et al. Varnost in učinkovitost cepiva ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) proti SARS-CoV-2: vmesna analiza štirih randomiziranih kontroliranih preskušanj v Braziliji, Južni Afriki in Združenem kraljestvu. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Analiza zaščitne učinkovitosti odobrenih cepiv proti COVID-19 proti različnim mutantom. Spredaj. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, MD; Do ˘ganay, HL; Akova, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalın, EH; Tabak, Ö.F.; et al. Učinkovitost in varnost inaktiviranega cepiva SARS-CoV-2 s celim virionom (CoronaVac): Vmesni rezultati dvojno slepega, randomiziranega, s placebom nadzorovanega preskušanja faze 3 v Turčiji. Lancet 2021, 398, 213–222. [CrossRef]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Varnost in imunogenost inaktiviranega cepiva proti SARS-CoV-2, BBIBP-CorV: randomizirano, dvojno slepo, s placebom kontrolirano preskušanje faze 1/2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; On, P.; Li, C.; Fang, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; et al. Varnost in imunogenost rekombinantnega tandemsko ponavljajočega se dimernega cepiva na osnovi proteinske podenote RBD (ZF2001) proti COVID-19 pri odraslih: dve randomizirani, dvojno slepi, s placebom nadzorovani preskušanji faze 1 in 2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [CrossRef]

17. Mallapaty, S. Indijsko DNK cepivo proti covidu je prvo na svetu – prihaja še več. Narava 2021, 597, 161–162. [CrossRef]

18. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; et al. Tarče odzivov celic T na koronavirus SARS-CoV-2 pri ljudeh z boleznijo COVID-19 in neizpostavljenih posameznikih. Cell 2020, 181, 1489–1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Sonce, W.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; et al. Močna nevtralizirajoča protitelesa proti SARS-CoV-2, identificirana z visoko zmogljivim enoceličnim sekvenciranjem celic B rekonvalescentnih bolnikov. Celica 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. Cepiva proti SARS-CoV-2: poročilo o stanju. Imuniteta 2020, 52, 583–589. [CrossRef]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; et al. Nova formulacija cepiva proti COVID{1}} s kombinacijo DNK in beljakovin zagotavlja popolno zaščito pred SARS-CoV-2 pri rezus makakih. Emerg. Mikrobi okužijo. 2021, 10, 342–355. [CrossRef]

22. Du, L.; Zdravo.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Konični protein SARS-CoV–tarča za cepivo in terapevtski razvoj. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Dolgi, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. N-terminalno skrajšani nukleokapsidni protein SARS-CoV-2 kot boljši serološki marker kot celoten nukleokapsidni protein pri ocenjevanju imunogenosti inaktiviranega SARS-CoV-2. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Gentles, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD. Cepivo SARS-CoV-2 mRNA-1273 izzove bolj nevtralizacijo, osredotočeno na RBD, vendar s širšo vezavo protiteles znotraj RBD. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; et al. Vrednotenje celičnih in seroloških odzivov na akutno okužbo s SARS-CoV-2 prikazuje funkcionalni pomen domene, ki veže receptorje. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [CrossRef]

26. On, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. Receptorsko vezavna domena koničastega proteina SARS-CoV inducira zelo močna nevtralizirajoča protitelesa: posledice za razvoj podenotnega cepiva. Biochem. Biophys. Res. Komun. 2004, 324, 773–781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Oboževalci.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; et al. Razvoj in uporaba cepiva proti virusnemu vektorju med pandemijo COVID-19. Mikroorganizmi 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; et al. Imunogenost in varnost rekombinantnega cepiva-5-vektorskega COVID-19 tipa adenovirusa pri zdravih odraslih, starih 18 let ali več: randomizirano, dvojno slepo, s placebom kontrolirano preskušanje 2. faze. Lancet 2020, 396, 479–488. [CrossRef]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Ši, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; et al. Imunizacija z enim odmerkom s cepivom na osnovi adenovirusa šimpanzov povzroči trajno in zaščitno imunost proti okužbi s SARS-CoV-2. Spredaj. Immunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Razvoj novih vektorjev cepiva: adenovirusni vektorji šimpanzov. Hum. Cepiva Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [CrossRef]

32. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; Farmer, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; et al. Izguba Bcl-6-izražajočih T folikularnih celic pomočnic in zarodnih centrov pri COVID-19. Celica 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albreht, I.; Lepenies, I.; Richter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- in IL-12 sinergizirata za pretvorbo in vivo generiranih Th17 v celice Th1/Th17. EUR. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; Kaj.; Li, J.; Gao, P.; et al. Heterologna primarno okrepljena imunizacija z adenovirusnimi vektorji šimpanzov izzove močno in zaščitno imunost proti okužbi s SARS-CoV-2. Cell Discov. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]