Etanolni izvleček semen Cucurbita Pepo L. spremeni nevroendokrine motnje pri podganah s kroničnim stresom in nadledvično ekspresijo vnetnih markerjev in HSP70

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Hailah M. Almohaimeed1, Shereen Hamed2, Hanan S. Seleem3,4, Ashwaq H. Batawi 5, Zuhair M. Mohammedsaleh6, Maha Jameal Balgoon7, Soad S. Ali 8,9, Soad Al Jaouni 9,10 in Nasra Ayuob11*

Ozadje: Buče(Cucurbita pepo L.) so opisali, da imajoantioksidant,deluje protivnetno, proti utrujenosti in antidepresivu. Nadledvična žleza je pomemben organ, ki se odziva na stres in vzdržuje homeostazo med stresom.

Cilji:Namen te študije je bil oceniti učinkovitost uporabe izvlečka Cucurbitapepo L. (CP) pri lajšanju vedenjskih, biokemičnih in strukturnih sprememb v nadledvični žlezi, ki jih povzroča izpostavljenost kroničnemu nepredvidljivemu blagemu stresu (CUMS), in raziskati mehanizem za tem vplivom.

Materiali in metode:Štirideset samcev albino podgan je bilo razdeljenih v 4 skupine (n=10): kontrolne, CUMS, skupine, zdravljene s fluoksetinom, in skupine, zdravljene s CP. Spremembe vedenja, raven kortikosterona, provnetni citokini TNF- in IL-6 ter oksidant/antioksidantprofil so ocenili v serumu na koncu poskusa. Nadledvične žleze so bile obdelane za histopatološko in imunohistokemično oceno. Genska ekspresija kaspaze-3 in Ki67 ter proteina toplotnega šoka 70 (HSP70) je bila ocenjena v nadledvičnih žlezah z uporabo RT-PCR.

Rezultati:Izvleček CP je znatno zmanjšal raven kortikosterona (p < {{0}},001),="" čas="" nepremičnosti="" (p="">< 0,001)="" ter="" vnetne="" in="" oksidativne="" spremembe,="" povezane="" z="" depresijo,="" ki="" jo="" povzroča="" cums,="" v="" primerjavi="" z="" nezdravljeno="" skupino.="" izvleček="" cp="" je="" omilil="" histopatološke="" spremembe="" nadledvične="" žleze,="" ki="" jih="" povzroča="" cums,="" in="" znatno="">apoptoza(p < 0,001) in znatno povečanantioksidantravni v serumu.

Zaključek:Cucurbita pepo L. je učinkovito blažila s kroničnim stresom povzročene vedenjske, biokemične in nadledvične strukturne spremembe predvsem s svojimantioksidantin protivnetne učinke.

Ključne besede: buča, stres, depresija, kaspaza-3, ki67, Hsp70,apoptoza

Cistanche, kitajsko zelišče, deluje antioksidativno.

UVOD

Več kot 264 milijonov ljudi vseh starosti po vsem svetu trpi za depresijo (WHO, 2020). Uspešnost depresivne osebe je na splošno slaba v šoli, na delovnem mestu in v družini. Depresija lahko vodi v samomor; zato velja za drugi vodilni vzrok smrti pri 15- do 29-letnikih (WHO, 2020). Sesalci lahko preživijo stresne dogodke z aktiviranjem ustreznih fizioloških odzivov na te dogodke. Nadledvična žleza je del hipotalamus-hipofizno-adrenokortikalne (HPA) osi in simpatije-adrenomedularne osi, ki vzdržuje homeostazo med stresom (Ulrich-Lai et al., 2006). Poročali so, da izpostavljenost toplotnemu stresu povzroči hitro izražanje HSP70 v skorji nadledvične žleze (Huang et al., 2001). Ti proteini delijo znotrajcelično trgovanje, predstavitev antigena,apoptozain številni drugi ukrepi (Khar et al., 2001). Opisano je bilo, da imajo lahko eksogeni hormoni ali interferenca z endogenimi hormoni v kritičnih obdobjih razvoja trajne učinke na fiziološke in vedenjske poti, ki jih uravnavajo hipotalamično-nevroendokrini krogi (Gore in Patisaul, 2010). Opisana je bila tudi nevroendokrina motnja, ki je razširila koncept endokrinih motenj na vključujejo celotno širino integrativne fiziologije; zato je več kot le hormonska motnja (Waye in Trudeau, 2011).

Spremembe v nevroendokrini regulaciji, metabolizmu in prehrani/mikrobioti veljajo za sprožilce vnetja in nagnjenosti k razvoju depresije (Huang et al., 2019). Predpostavljeno je bilo, da sta depresija – ena od nevropsihiatričnih motenj – in vnetje dvosmerno povezana. Medtem ko depresija spodbuja vnetne reakcije, vnetje spodbuja nevropsihiatrične motnje, vključno z depresijo (Bauer in Teixeira, 2019).

Fluoksetin, klasični antidepresiv, je med zdravili, ki so na voljo na trgu za zdravljenje depresije. Zdaj velja za nastajajočega nevroendokrinega motilca. Ta učinek fluoksetina je stranski učinek in ne glavni terapevtski cilj pri sesalcih (León-Olea et al., 2014). Zato obstaja potreba po varnejših antidepresivih brez stranskih učinkov na nevroendokrini status.

Buče(Cucurbita pepo L.) so gospodarsko pomembne vrste, ki se gojijo po vsem svetu. Imajo prehranske in zdravstvene koristi, saj so bogati s fenoli, flavonoidi, aminokislinami, ogljikovimi hidrati in vitamini (Wang et al., 2002). Več raziskav je razkrilo, da imajo buče obsežno bioaktivnost, kot so antidiabetična, protirakava,antioksidant, protivnetni učinki, proti utrujenosti in antidepresivom podobni učinki (Wang et al., 2012; Zhanget al., 2012; Nawirska-Olszańska et al., 2013; Kim Nr et al., 2016). Tradicionalna medicina predvsem ajurvedska sistemi in kitajska medicina so uporabljali različne dele buče, vključno z mesom plodov in semeni (Perez Gutierrez, 2016). Antidepresivna učinkovitost Sweetme Sweet Pumpkin (SSP) in Cucurbita moschata Duch je bila predhodno testirana v študiji in vivo z uporabo živalskega modela depresije, povzročenega s testom prisilnega plavanja (FST), in primerjana s fluoksetinom (Kim Nr et al., 2016). V enem od sorazmerno nedavnih pregledov je bilo povzeto, da je bilo opisano, da imajo antidepresivna živila, kot so bučna semena, 47-odstotni rezultat antidepresivov, kar zagotavlja učinek, podoben antidepresivu (Lachance in Ramsey, 2018). Pred kratkim sta Dotto in Chacha podprla izvedbo več raziskovalnih študij na živalih in kliničnih preskušanjih, da bi potrdili omilitveni učinek bučnih semen na depresijo (Dotto in Chacha, 2020).

Ta poročila so bila spodbudna za testiranje učinkovitostibučepri blaženju vpliva kroničnega stresa na nadledvične žleze. Zato je bila ta študija izvedena za oceno učinka peroralnega dajanja izvlečka Cucurbita pepo L. (CP) na lajšanje vedenjske, biokemične in nadledvične strukture, ki jo povzroča kronični nepredvidljivi blagi stres (CUMS), ter za raziskovanje mehanizma za tem vplivom.

izvleček puščavske cistanče: Antioksidacija

MATERIALI IN METODE

Ekstrakcija in odmerjanje buče

Cucurbita pepo L. (vzorec vavčerja: AQJ_95) je bil kupljen na lokalnem trgu v Džedi v Savdski Arabiji. Identificirani so bili v herbariju univerze kralja Abdulaziza z uporabo vzorcev herbarija in flore KSA (Chaudhary, 2001). Vzorci bonov so bili deponirani v herbariju. CP so identificirali avtorji, preveril pa ga je botanik s Fakultete za naravoslovje Univerze King Abdulaziz.

Ekstrakcija CP je bila izvedena v skladu s prejšnjimi študijami (Wang et al., 2012). Surovo sadje z lupino je bilo narezano z rezalnikom in posušeno z liofilizatorjem (FD5508; ilShinBioBase Co., Ltd., Koreja) in nato zdrobljeno z uporabo električnega brusilnega stroja. Prašek smo presejali skozi 40-mrežasto sito, da smo dobili fin prah in shranili v nepredušno zaprto posodo. Posušen prašek (50 g) smo zmešali s 450 ml 80-odstotnega etanola in pustili 1 dan pri 37 stopinjah v stresalniku (JSSI-100T; JS Research Inc., Compact ShakingIncubator., Koreja) in nato filtrirali z vato in filtrirnim papirjem drugi dan. Ta postopek ekstrakcije smo dvakrat ponovili pri 37 stopinjah, da smo dobili ekstrakt etanola.

Identifikacija sestavin CP

Kemično sestavo PE smo analizirali s plinsko kromatografijo v sledovih GC-TSQ evo 8000 masnega spektrometra (ThermoScientific, Austin, TX, Združene države) z neposredno kapilarno kolono TG–5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm debelina filma). Temperatura pečice kolone je bila prvotno nastavljena na 50 stopinj in nato povišana za 5 stopinj/min do 250 stopinj in vzdrževana 2 minuti ter nato povišana na končno temperaturo 300 stopinj za 25 stopinj/min in vzdrževana 2 minuti. Temperature injektorja in prenosne linije MS so bile vzdrževane pri 270 oziroma 260 stopinjah; helij smo uporabili kot nosilni plin pri konstantnem pretoku 1 ml/min. Zakasnitev topila je bila 4 minute, razredčeni vzorci po 3 µl pa so bili samodejno vbrizgani z uporabo avtomatskega vzorčevalnika AS1300, povezanega z GC, v načinu brez deljenja v injektorju PTV. Masni spektri EI so bili zbrani pri 70 eVionizacijskih napetostih v območju m/z 50–650 v polnem načinu skeniranja. Temperatura ionskega vira je bila nastavljena na 250 stopinj. Komponente so bile identificirane s primerjavo njihovih masnih spektrov s tistimi iz podatkovne baze masnih spektrov WILEY 09 in NIST 14, ki se uporabljajo za identifikacijo in preučevanje kemične sestave neznanih komponent v katerem koli izvlečku (Wiley, 2006; Mikaia et al., 2014). Analiza je bila izvedena nekvalitativno s programsko opremo Thermo Scientific™ Xcalibur™ 2.2 in vse vrednosti so bile sporočene v relativnih odstotkih (Abd El-Kareem et al., 2016).

Eksperimentalno načrtovanje

To študijo je odobril Odbor za etiko biomedicinskih raziskav na Medicinski fakulteti Univerze King Abdulaziz, Jeddah, KSA (referenčna številka {{0}}). V tej študiji je bilo štirideset samcev albino podgan, težkih 150–200 g in starih 2–3 mesece, pridobljenih iz King Fahd MedicalResearch Center (KFMRC). Pred začetkom poskusa so podgane pustili, da se 1 teden prilagodijo na laboratorijske pogoje. Deset podgan je bilo določenih kot kontrolna skupina, ki ni bila izpostavljena CUMS. Ostalih trideset podgan je bilo 4 tedne izpostavljenih postopku CUMS, ki je vključeval različne vrste stresorjev ob različnih urah dneva, da bi preprečili navajanje na stres. Postopek CUMS je bil v celoti opisan v prejšnjih delih (Ayuob et al., 2016; Ali et al., 2017) in je bil prikazan v tabeli 1. Podgane, izpostavljene CUMS, so bile razdeljene v 3 skupine (n 10). Nezdravljena skupina (CUMS) je 2 tedna prejemala nosilec 0,03-odstotno karboksimetil celulozo (CMC-Na) z gavažo. Skupina, zdravljena z gripo, je prejela FLU (Dar Al Dawa Pharmaceuticals Co., Ltd., Amman, Jordanija), antidepresiv, ki se uporablja za farmakološko validacijo, raztopljen v CMC-Na 0,03 odstotka v odmerku 20 mg/kg z želodčno sondo (Li et al. , 2014). Skupina, zdravljena s CP, je prejela ekstrakt CP, raztopljen v destilirani vodi, v odmerku 100 mg/kg z gavažo 2 tedna v skladu z Wang et al. (2012).

Ocena vedenjskih sprememb

FST je bil izveden po 4 tednih, da bi potrdili učinek CUMS na podgane (Ali et al., 2017). Med tem testom je bila vsaka podgana postavljena v stekleno cilindrično posodo (višina 20 cm, premer 14 cm) s 15 cm vode pri 25 ± 2 stopinjah. Podgana je bila posneta 6 minut z uporabo programske opreme za obnašanje (Noldus InformationTechnology, EthoVision XT®) in skupni čas, preživet v nepokretnosti v 6 minutah, je izmeril tehnik, slep za poskusne skupine. Določen je bil skupni čas v sekundah, ki so ga podgane preživele brez gibanja okončin, razen manjšega gibanja, potrebnega za ohranjanje miške na površju, "čas nepremičnosti" v 6 minutah.

Biokemijske tehnike

Štiriindvajset ur po končanem vedenjskem testu so bili vzeti vzorci krvi iz intraorbitalnega sinusa podgan po anesteziji s 4 odstotki izoflurana (SEDICO PharmaceuticalsCompany, Kairo, Egipt) v 100 odstotkih kisika. Po tem so bile podgane evtanazirane z izpahom materničnega vratu. Vzorce krvi smo centrifugirali pri 3,000 obratih na minuto 15 minut pri 4 stopinjah, da smo dobili serum, in hranili pri -18 stopinjah za biokemijsko oceno.

Raven kortikosterona (ALPCO Diagnostics, Orangeburg, NY, Združene države) je bila ocenjena s kompleti za encimsko imunosorbentni test v skladu z navodili proizvajalca. V skladu z navodili proizvajalca sta bila TNF- in IL-6 (Quantakin R&D sistem, komplet ZDA) ocenjena z uporabo encimsko vezanega imunskega testa. Optična gostota vsakega vzorca je bila določena v dvojniku z bralnikom mikroplošč ELISA, nastavljenim na 450 nm.

Za spektrofotometrično merjenje ravni malondialdehida (MDA) pri 535 nm (Gamal et al., 2018) je bil uporabljen komplet za testiranje reaktivnih snovi na tiobarbiturno kislino (TBARS) (Biodiagnostic; Egipt). Raven superoksid dismutaze (SOD) je bila izmerjena z uporabo kompleta za testiranje SOD (Biodiagnostic; Egipt) (Packer, 2002). Ocena ravni glutation peroksidaze (GPX) je bila izvedena z uporabo kompleta GPX (Randox Labs, Crumlin, Združeno kraljestvo). Za kvantifikacijo aktivnosti katalaze (CAT) je bila ustvarjena umeritvena krivulja za test in vse vzorce z uporabo testnih kompletov (Biodiagnostic; Egipt). Metoda je predhodno opisana (Gamal et al., 2018).

koristi izvlečka puščavske cistanče: protivnetno

Kvantitativni PCR v realnem času

Ekstrakcija RNA iz vzorcev tkiva je bila izvedena z uporabo reagenta TriFast™ (PeqLab, Nemčija, kat. št.: 30-2010), kot je opisano v protokolu proizvajalca. Koncentracijo očiščene RNA smo ocenili s spektrofotometrom NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Združene države). Ekstrahirano RNA iz vsakega vzorca smo reverzno prepisali z uporabo kompleta za sintezo cDNA SensiFAST™ za RT-qPCR (Bioline USA Inc., Združene države, kat. št.: BIO-65053), po navodilih proizvajalca. Sintetizirana cDNA je bila shranjena pri -80 stopinjah do uporabe za qRT-PCR.

Reakcije qRT-PCR so bile izvedene z uporabo kompleta SensiFAST™ SYBR Lo-ROX (Bioline USA Inc., Združene države, kat. št.: BIO-94002) na Applied Biosystems 7500real -time PCR detekcijski sistem (Life technology, Združene države Amerike). Gensko specifični primerji za podgane, uporabljeni v tej študiji, so bili zasnovani s programsko opremo Primer3 (v.0.4.0), njihova specifičnost pa je bila preverjena s programom NCBI/Primer-BLAST. Primerji so bili nato kupljeni pri Willowfort™ (Združeno kraljestvo). Primerji so bili GAPDH (5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′, 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′), kaspaza-3 (naprej 5- TGTATGCTTACTCTACCGCACCCG-3, vzvratno {{ 20}}GCGCAAAGTGACTGGATGAACC-3), HSP70 (5′-ACGAGGGTCTCAAGGGCAAG-3′, 5′-CTCTTTCTCAGCCAGCGTGTTAG-3′).

Ki67 (naprej 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA-3, vzvratno 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA 3). Mešanico PCR smo pripravili na naslednji način: 10 µl mešanice SensiFASTTM SYBRLo-ROX, 0.8 µl prednjega primerja, 0,8 µl povratnega oligonukleotidne celice, 2 µl šablonske cDNA in 6,4 µl vode brez nukleaze. Reakcijska mešanica je bila prenesena v termični cikeler, ki je bil predhodno programiran za vzdrževanje 95 stopinj 2 minuti, čemur je sledilo 40 ciklov pri 95 stopinjah 15 sekund in nato 60 stopinjah 30 sekund. V vsakem poskusu je bila izvedena negativna kontrolna reakcija, ki ni vsebovala predloge.

Izvedena je bila analiza talilne krivulje, da se dokaže specifičnost produktov PCR, vrednost Ct za vsako reakcijo pa je bila pridobljena iz grafov pomnoževanja. Relativno kvantifikacijo za vsako gensko ekspresijo v vzorcih tkiv smo izračunali z uporabo metode primerjalnega praga (ΔΔCt) z GAPDH kot notranjim kontrolnim genom. Za celotno spremembo zgiba je bila izračunana in linearizirana z aritmetično formulo 2−ΔΔCt.

Histološke tehnike

Na koncu poskusa in po anesteziji so podgane odprli trebuh in izrezali desno nadledvično žlezo. Za pridobitev parafinskih blokov je bila izvedena fiksacija nadledvične žleze v 10-odstotnem nevtralnem pufriranem formalinu in nadaljnji postopki. Parafinske reze debeline 4- μm smo pripravili in obarvali s hematoksilinom in eozinom (H&E). Poleg tega so bili drugi parafinski odseki imunohistokemično obarvani s tehniko streptavidin-biotin-peroksidaze. Predmetna stekelca smo inkubirali čez noč pri 4 stopinjah, nato pa smo jih inkubirali z monoklonskim anti-Ki67 (Dako Cytomation, Združene države, pri razredčitvi 1:1, 000) ​​za prikaz celične proliferacije. Poleg tega je bilo za detekcijo uporabljeno poliklonsko protitelo proti kaspazi-3 (Santa Cruz Biotechnology, Združene države, pri razredčitvi 1:1,000).apoptoza. Uporabljeno je bilo tudi poliklonsko protitelo proti proteinu toplotnega šoka -70 (HSP70) (Dako, Carpinteria, CA, Združene države, pri razredčitvi 1:1, 000). Uporabljeno je bilo ustrezno biotinilirano konjugirano sekundarno protitelo iz sistema za barvanje Dako. Predmetna stekelca, obarvana samo s sekundarnim protitelesom, so uporabili kot negativne kontrole.

Jedra so bila kontrastno obarvana s hematoksilinom. Rjavo citoplazmatsko obarvanje je veljalo za pozitivno reakcijo. Obarvane odseke smo pregledali in fotografirali z Olympusovim mikroskopom BX{{0}} (Olympus), povezanim z digitalnim fotoaparatom in računalnikom. Polkvantitativno analizo imunoreaktivnosti protiteles smo opravili s programsko opremo za analizo slik Pro Plus. Odstotek površine imunopozitivne reakcije smo ocenili v 30 poljih pri ×400 povečavi. Pozitivne celice so bile preštete na 1,0 mm2 površine, kot so opisali Zhou et al. (2016). Pregledanih je bilo vsaj pet polj z vsakega preparata in za vsako žival je bila izračunana povprečna vrednost.

Za morfometrično analizo smo pri vsaki živali pregledali štiri reze (povečava × 100). Debelina različnih območij nadledvične žleze je bila izmerjena v mikrometrih. Debelina skorje nadledvične žleze je bila pridobljena z merjenjem razdalje med medulo in kapsulo nadledvične žleze v ravni črti, ena meritev se opravi v vsakem kvadrantu skorje nadledvične žleze.

Statistična analiza

Vedenjski, biokemični in imunohistokemični podatki so bili analizirani s statističnim paketom za družbene vede (SPSS), različica 16. Na študijske spremenljivke sta vplivala dva neodvisna dejavnika: izpostavljenost stresu in zdravljenje. Zato je bila izvedena analiza z uporabo mešanega modela dvosmerne ANOVA, ki temelji na Bonferroni post hoc. Statistična značilnost je bila upoštevana pri p <>

koristi desert cistanche: proti staranju

REZULTATI

Vedenjski rezultati

Čas nepremičnosti med FST je bil značilno daljši (p=0.03) v skupini CUMS kot v kontrolni skupini, medtem ko je bil značilno nižji (p=0.01, p=0.001) v skupinah, zdravljenih z FLU in CP, kot v skupini CUMS (slika 1A).

Rezultati analize CP ekstrakta z uporabo GC-MS

Glavne spojine, odkrite v CP, vključujejo predvsem oleinsko kislino (približno 56 odstotkov), palmitinsko kislino (približno 8,9 odstotka), linolensko kislino 3,5 odstotka in linolno kislino 2,8 odstotka poleg številnih drugih spojin (tabela 2; slika 2). Med spojinami CP, za katere so poročali, da imajo protivnetni učinek, so oleinska kislina, palmitinska kislina, linolenska kislina, betulin in linolna kislina, medtem ko so tiste zantioksidantučinek imajo palmitinska kislina,10-oktadecenska kislina in metilni ester.

Biokemijska ocena

Raven kortikosterona v serumu

Raven kortikosterona se je znatno povečala (p < {{0}}.001) pri nezdravljenih podganah, ki so bile izpostavljene CUMS, v primerjavi s tistimi pri kontrolnih podganah, medtem ko so tiste, zdravljene z FLU in CP, pokazale znatno zmanjšanje (p < 0,001) serumskega kortikosterona ravni v primerjavi s tisto pri nezdravljenih podganah, izpostavljenih CUMS (slika 1B).

Ravni TNF- in IL-6 v serumu

Ob koncu poskusa je ocena serumskega TNF- in IL-6 pokazala, da sta bila znatno povišana (p < 0,001) v skupini CUMS, medtem ko sta pokazala pomembno zmanjšanje (p< 0.001)="" in="" flu-="" and="" cp-treated="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" rats="" exposed="" to="" cums="" (figures="" 1c,="">

Ravni MDA, SOD, GPX in CAT v serumu

Opazili so, da je bila raven serumskega MDA bistveno višja (p < {{0}}.001)="" v="" skupini="" cums="" kot="" pri="" kontrolnih="" podganah,="" medtem="" ko="" je="" bila="" v="" skupinah,="" zdravljenih="" s="" cp,="" bistveno="" nižja="" (p="" 0,003).="" kot="" pri="" nezdravljenih="" podganah,="" izpostavljenih="" cums.="" dajanje="" flu="" ni="" moglo="" bistveno="" zmanjšati="" ravni="" mda="" pri="" podganah,="" izpostavljenih="" cums="" (slika="">

Nasprotno pa so bile ravni SOD, GPX in CAT v serumu skupine CUMS bistveno nižje (p < {{0}}.001,="" p="">< 0,001,="" p="0" 0,002)="" kot="" tiste="" v="" serumu="" kontrolne="" skupine,="" medtem="" ko="" so="" njihove="" ravni="" pokazale="" značilno="" povečanje="" (p="0.01," p="0.003," p="" 0,03)="" v="" skupini,="" zdravljeni="" s="" cp="" v="" primerjavi="" s="" tistimi,="" v="" skupini,="" izpostavljeni="" cums.="" dajanje="" flu="" ni="" moglo="" bistveno="" povečati="" sod,="" gpx="" in="" cat="" pri="" podganah,="" izpostavljenih="" cums="" (slike="">

Izražanje genov Ki67, kaspaze-3 in HSP70

RT-PCR je razkril zanemarljivo visoko ekspresijo gena Ki67 (p=0.14) v nadledvičnih žlezah skupine CUMS v primerjavi s kontrolno skupino, medtem ko je skupina, zdravljena z FLU in CP, pokazala značilno visoko ekspresijo (p {{6 }}.02, p 0.01) v primerjavi s skupino, izpostavljeno CUMS (slika 3E). Kar zadeva kaspazo-3, se je izražanje njenih genov znatno povečalo (p < 0,001) v nadledvičnih žlezah skupine CUMS v primerjavi s kontrolno skupino, medtem ko je skupina, zdravljena z gripo in CP, pokazala pomembno zmanjšanje (p=0.03, p=0.04) v primerjavi s skupino, ki je bila izpostavljena CUMS (slika 3F). Kar zadeva ekspresijo gena HSP70, je zabeležila značilno višje ravni (p < 0,001) v nadledvičnih žlezah skupine CUMS kot v kontrolni skupini, medtem ko je pri FLU in Skupine, zdravljene s CP, so pokazale nepomemben upad (p=0.07, p=0.08) v primerjavi s skupino, izpostavljeno CUMS (slika 3G).

Histopatološka ocena

Nadledvične žleze kontrolnih podgan imajo nedotaknjeno strukturo z ohranjeno arhitekturo skorje, vključno z glomerulozno cono, fascikulatno cono in retikularno cono ter medulo (slika 4). Nadledvične žleze podgan, izpostavljenih CUMS, so pokazale veliko celic v ZG, ZF in ZR z očitno vakuolacijo in degeneriranimi jedri ter včasih globoko obarvanimi jedri z zmerno zadebelitvijo v kapsuli in trabekulah vezivnega tkiva. Številne celice ZR so bile temne z rjavimi pigmenti lipofuscina. Po drugi strani pa so nadledvične žleze podgan, zdravljenih s CP, pokazale manj očitno vakuoliranih celic in globoko obarvanih jeder v ZG, ZF in ZR pa sta razkrila malo temnih celic.

Morfometrične meritve so pokazale, da sta se debelina ZG in ZR po izpostavljenosti CUMS zanemarljivo povečala, medtem ko sta se pri FLU- (p 0.01,p 0.02) znatno povečali. in skupine, zdravljene s CP (p=0.02, p=0.001), oz. Kar zadeva debelino ZF, se je značilno povečala (p 0,02) v skupini, ki je bila izpostavljena CUMS, in se je dodatno povečala, vendar nepomembno, v skupinah, zdravljenih z FLU in CP, v primerjavi s skupino, ki ni bila zdravljena s CUMS.

Da bi ugotovili, ali je bila celična hiperplazija omejena na določeno podregijo nadledvične žleze, smo uporabili imunohistokemično označevanje za Ki67 (marker celice, ki se deli). Število Ki67-pozitivno proliferirajočih celic se je znatno povečalo (p < 0.001)="" v="" zf="" po="" izpostavljenosti="" cums,="" medtem="" ko="" se="" je="" zdravljenje="" z="" flu="" in="" cp="" neznatno="" povečalo="" v="" primerjavi="" z="" nezdravljeno="" skupino="" cums.="" čeprav="" je="" bilo="" število="" proliferirajočih="" celic="" neznatno="" povečano="" v="" zg="" in="" zr="" in="" neznatno="" zmanjšano="" v="" meduli="" skupine="" cums="" v="" primerjavi="" s="" kontrolno="" skupino,="" je="" zdravljenje="" z="" flu="" in="" cp="" pomembno="" povečalo="" število="" proliferirajočih="" celic="" v="" zg="" (p="0.001" ,="" p="0.003)," zr="" (p="">< 0,001)="" in="" medulo="" (p="0.004," p="0.003)" v="" primerjavi="" z="" nezdravljeno="" skupino="" cums="" (sliki="" 4,="">

Za oceno je bilo izvedeno imunohistokemično barvanje z uporabo kaspaze-3apoptoza(Slika 6). Opazili so, da se je odstotek površine izražanja kaspaze-3 znatno povečal (p < 0.001)="" v="" vseh="" predelih="" žleze="" po="" izpostavljenosti="" cums="" 4="" tedne="" v="" primerjavo="" s="" kontrolno="" skupino.="" skupina,="" zdravljena="" s="" cp,="" je="" pokazala="" znatno="" zmanjšanje="" izražanja="" kaspaze-3="" v="" zg="" (p="">< 0,001),="" zf="" (p="">< 0,001),="" zr="">< 0.001,="" p=""
="" 0.005),="" and="" medulla="" (p="0.004," p="0.001)," in="" comparison="" to="" that="" of="" the="" cums="" group="" (figures="">

Površinski odstotek izražanja HSP70 se je značilno povečal (p < 0,001) v vseh conah korteksa kot tudi v meduli nadledvične žleze skupine CUMS v primerjavi s tistim v kontrolni skupini, medtem ko je bil v kontrolni skupini nepomembno zmanjšan. vsa območja in medulo skupin, zdravljenih z FLU in CP, v primerjavi s skupino CUMS (slike 5).

Posušene rezine Cistanche tubulosa

DISKUSIJA

Sodobna družba je očitno polna stresa, ki lahko izhaja iz vsakodnevnih težav, zdravstvenih težav in vprašanj, povezanih z delom. Ti stresorji lahko povzročijo tako imenovane s stresom povezane motnje (Clayton in Mccance, 2014). V tej študiji je bil etanolni izvleček mesa in lupine Cucurbita pepo L. uporabljen za raziskovanje njegovega potenciala pri blaženju depresivnega vedenja, ki ga povzroča CUMS, in njegovega vpliva na nadledvično žlezo. To je bilo dokazano s pomembnim povečanjem ravni kortikosterona v serumu in potrjeno s podaljšanim časom nepremičnosti med FST. Te ugotovitve so bile skladne s predhodno poročanimi (Tang et al., 2015).

Poročali so, da sta tako TNF- kot IL-6 vpletena v patogenezo depresije (Taraz et al., 2015; Pedraz-Petrozziet al., 2020). Poročali so, da so miši s pomanjkanjem receptorjev IL-6 ali TNF odporne na depresivno vedenje (Viana et al., 2010). Zato so jih ocenili v tej študiji in ugotovili, da tako TNF kot IL{ {9}} so se znatno povečali v serumu podgan, ki so bile 4 tedne izpostavljene CUMS, kar kaže, da so bile depresivne. To ugotovitev so podprli Numakawa et al. (2014) pri miših z vedenjskim obupom in Taraz et al. (2015) pri bolnikih z depresijo.

V tej študiji je bilo dajanje ekstrakta buče povezano z izboljšanjem depresivnega vedenja, kar je razvidno iz znatnega zmanjšanja časa nepremičnosti FST in potrjeno s pomembnim zmanjšanjem kortikosterona in vnetnih citokinov TNF- in IL-6 v serumu. Te ugotovitve so podprli Kim Nr et al. (2016), ki je poročal, da je SSP 28 dni zmanjšal raven vnetnih citokinov pri depresivnih podganah. Protivnetno delovanjebučalahko pripišemo aktivnim spojinam buče, kot so oleinska in palmitinska kislina ter estradiol.

Znižana regulacija oleinske kisline, palmitinske kisline in linolne kisline je bila opisana pri depresiji (Conklin et al., 2010; Martín et al., 2010). Poročali so, da je nevroprotekcija, posredovana z oleinsko kislino, povezana z njenim protivnetnim učinkom, ki ga posreduje aktivacija receptorja gama (PPAR-), aktiviranega s peroksisomeproliferatorjem (Song et al., 2019). Poleg tega so poročali, da palmitinska kislina zavira fosfolipazo A(2) in zato. velja za protivnetno spojino (Aparna et al., 2012). Estradiol je bil ena od spojin buče, odkritih v tej študiji. Poročali so, da estradiol inducira protivnetni učinek in posledično ublaži depresivno vedenje (Xu et al., 2015). Drugi mehanizem, s katerim lahko estradiol povzroči anantidepresivni učinek, je povečana regulacija ekspresija možganskega nevrotrofičnega faktorja (BDNF) in fosforilacija ERK z aktivacijo ER- v možganih (Yang et al., 2010).

V tej študiji je bila serumska raven MDA zvišana, medtem ko so bile ravni SOD, GPX in CAT znižane pri živalih, ki so bile izpostavljene CUMS. Podobne spremembe so dokumentirali po izpostavljenosti CUMS v prejšnjih študijah in dodali, da so te biokemične spremembe povzročile oksidativni stres in okvaro HPA (Nabavi et al., 2015). Liu T. et al. (2015) so tudi poročali, da je razvoj depresije mogoče pripisati nizki vsebnosti antioksidantov v telesu. Antioksidativne lastnostibučapogosto poročali o sadnem izvlečku (Bahramsoltani et al., 2017). Poleg tega so poročali, da imata meso in lupina Cucurbita pepo L. večjo antioksidativno aktivnost kot drugi deli, na primer semena (Oyeleke et al., 2019). Dajanje izvlečka buče je v številnih prejšnjih študijah znatno povečalo ravni SOD in GPX ter zmanjšalo MDA v serumu miši (Guo-Huaet al., 2000; Dang, 2004), ta učinek pa je bil dokumentiran tudi v tej študiji. Zato jeantioksidantaktivnost buč bi lahko kriva za njen antidepresivni učinek, očiten v tej študiji. To je v skladu z opažanji Kim Nr et al. (2016). Poročali so, da naravni izdelki delujejo protivnetno,antioksidant, učinki proti utrujenosti pa imajo tudi učinek, podoben antidepresivu (Jeong et al., 2015). Vse te dosedanje aktivnosti so bile dokazane vbuče.

Cistanche deluje proti staranju

Povečano citoplazmatsko vakuolizacijo kortikalnih celic nadledvične žleze, opaženo v skupini CUMS v tej študiji, bi lahko pripisali povečanemu povpraševanju po lipidih, ki tvorijo temelj sinteze kortizola. Cigankova idr. (2005) so opazili, da je dolgotrajna eksperimentalna hiperdinamika povzročila koalescenco več citoplazemskih lipidnih kapljic kortikalnih celic. Te lipidne kapljice vsebujejo holesterol, ki je glavni predhodnik pri sintezi steroidnih hormonov. Vendar sta Koldysheva in Lushnikova (2008) poročali, da je stres povzročil znatno zmanjšanje lipidnih kapljic v celicah skorje nadledvične žleze, zlasti ZF (Koldysheva in Lushnikova, 2008). Opisano je, da se po izpostavljenosti fizičnemu stresu bolečinski dražljaji prenesejo v hipotalamus, kar povzroči izločanje CRH v hipofizni portalni sistem, ki poveča izločanje ACTH in stimulira njegove receptorje v ZF in ZR, da povečajo izločanje kortizola (Patti et al., 2018). Prej so poročali o zadebeljeni adrenalni kapsuli in trabekulah pri podganah, izpostavljenih CUMS (El-Desouki et al., 2011; Altayeb in Salem, 2017), kot rezultat povečane sinteze kolagena s fibroblasti ob izpostavljenosti imobilizacijskemu stresu.

Številne celice v nadledvičnih žlezah podgan, izpostavljenih CUMS, so pokazale globoko obarvana jedra, kar kaže, da so bile podvržene metapoptozi, kar je bilo potrjeno z imunohistokemičnim barvanjem s kaspazo-3. Podobno opažanje sta poročala Altayeb in Salem (2017), ko sta proučevala učinek imobilizacijskega stresa na nadledvične žleze podgan. Liu Q. et al. (2015) so poročali, da čezmerni oksidativni stres, očiten po izpostavljenosti CUMS v tej študiji, spremeni ravni izražanja "apoptoza-povezani geni" in inducira celično apoptozo in degeneracijo prek signalnih poti Bcl-2, Bax in kaspaze-3. Ta mehanizem je bil v tej študiji potrjen z RT-PCR, ki je razkrila pomembno regulacijo gena kaspaze-3 Pri pregledu literature ni bilo neposrednega učinka Cucurbita pepo na apoptozo, ki jo posreduje kaspaza-3, v različnih tkivih. Zdi se, da je bilo zmanjšanje števila apoptotičnih celic, pozitivnih na kaspazo-3, odkritih v nadledvičnih žlezah, pripisanoantioksidantučinek Cucurbita pepo, dokumentiran v tej študiji. To podpirajo številne prejšnje študije, izvedene na drugih rastlinah in zeliščih s pomembnimi antioksidativnimi aktivnostmi (Banagozar Mohammadi et al., 2019; Ghazizadeh et al., 2020).

Ta študija je pokazala, da je izpostavljenost CUMS povečala Ki67-pozitivne celice v skorji nadledvične žleze, kar je bilo opazno v ZF, kar kaže na povečano število proliferirajočih celic, posledično pa se je debelina te plasti znatno povečala. po drugi strani pa se je število Ki67-pozitivnih proliferirajočih celic neznatno zmanjšalo v meduli kot odziv na CUMS. Ta opažanja so bila v skladu s tistimi Ulrich-Lai et al. (2006), ki so poročali o povečanju Ki{{ 4}}pozitivna celična jedra le v zunanjem ZF po izpostavljenosti kroničnemu spremenljivemu stresu, medtem ko je medula pokazala celično hipertrofijo in ne hiperplazije. Poleg tega so Laborie et al. (2003) poročali o splošnem povečanju medularne funkcije po izpostavljenosti kroničnemu stresu, kar kaže, da kronični stres lahko privede do medularne hipertrofije. V tej študiji je dajanjebučaizvleček znatno povečano celično proliferacijo, kar je razvidno iz povečane regulacije gena Ki67 in imunske ekspresije v skoraj vseh conah in meduli nadledvične žleze v primerjavi s CUMS. To je pojasnilo povečano debelino žleznih con, zabeleženih v tej študiji. Prav tako lahko kompenzira apoptotični učinek, ki ga povzroča izpostavljenost CUMS. To ugotovitev podpirajo Kim Hy et al. (2016), ki so poročali o pomembnem povečanju ekspresije mRNA Ki67 in proliferaciji splenocitov, izoliranih iz vranice miši BALB/c, zdravljenih s SSP, streamed in Cucurbita moschataDuch in njeno glavno komponento, -karoten.

V tej študiji je izpostavljenost CUMS znatno povečala izražanje genov in imunsko izražanje HSP70 v vseh conah nadledvične žleze. V skladu s tem Zheng et al. (2008) je tudi dokazal, da povečana ekspresija HSP70 po izpostavljenosti stresnim razmeram modulira vnetne odzive z zaviranjem aktivacije transkripcijskega faktorja vnetja, jedrnega faktorja kapa B(NF-kappaB). Poleg tega lahko HSP70 neposredno vpliva na apoptozo in nekrozo (Yenari et al., 2005). Nedavno je Liet al. (2019) so poročali o povečani ekspresiji HSP70 v tkivu nadledvične žleze prašičev po izpostavljenosti toplotnemu stresu, kar kaže na vlogo HSP70 pri poškodbi nadledvične žleze in poudarja njegov pomen za vnetne odzive. Hitra indukcija HSP70 kot odziv na stres velja za bistveno za proces celične zaščite.

V naši študiji je zdravljenje podgan, izpostavljenih CUMS, zbučeje bilo povezano z nepomembnim zmanjšanjem izražanja HSP70, kar je bilo povezano z zmanjšano apoptozo in vnetnimi odzivi. To bi lahko kazalo na ugoden učinek relativno visoke ravni HSP70, ki jo povzročata gripa in kronična kronična bolezen, saj je povzročila zmanjšanje s kaspazo -3apoptozain sproščanje vnetnih citokinov. Čeprav učinek buč na družino beljakovin toplotnega šoka še ni bil opisan, oleinska kislina, ki predstavlja glavno sestavinobučeuporabljen v tej študiji, je bilo opisano, da uravnava izražanje HSP60 v celični liniji človeških limfocitov T (Martins De Lima et al., 2004), kar podpira ugotovitve naše študije. Predlagani mehanizem delovanja Cucurbita pepo kot antidepresivu podobne snovi je povzet na sliki 7. Med omejitvami te študije je bila nezmožnost nadaljnjega raziskovanja poglobljenega mehanizma antidepresivnega učinka CP, zato se za to spodbuja nadaljnja študija .

Za zaključek ta študija zagotavlja znanstveno podprte dokaze o učinkovitosti izvlečka Cucurbita pepo L. za ublažitev vedenjskih in biokemičnih sprememb, ki jih povzroča CUMS, ter histopatološkega vpliva na nadledvične žleze. Ti učinki so bili očitni z znižanjem regulacijeapoptozain HSP70 in se je zdelo, da je posredovan prekoantioksidantin protivnetni učinek Cucurbita pepoL. ekstrakt. Čeprav so ta študija in nekatere druge nedavne študije dokumentirale antidepresivu podoben učinek Cucurbita pepo in raziskale njegov mehanizem, so za potrditev tega učinka pri ljudeh potrebne nadaljnje študije, vključno s kliničnimi študijami.

Cistanche zrnca