Cepivo MRNA izzove od STING-a odvisne protitumorske imunske odzive

Povzetek

Cepiva RNA, oblikovana z lipidi, so bila pogosto uporabljena za preprečevanje in zdravljenje bolezni, vendar njihov mehanizem delovanja in posamezne komponente, ki prispevajo k takim ukrepom, še niso opredeljene. Tukaj prikazujemo, da je terapevtsko cepivo proti raku, sestavljeno iz jedra protamina/mRNA in lipidne lupine, zelo močno pri spodbujanju odzivov citotoksičnih celic CD8þ T in posredovanju protitumorske imunosti. Mehansko gledano sta za popolno stimulacijo ekspresije interferonov tipa I in vnetnih citokinov v dendritičnih celicah potrebna tako jedro mRNA kot lipidna ovojnica. Stimulacija ekspresije interferona-b je odvisna izključno od STING, protitumorska aktivnost cepiva mRNA pa je znatno ogrožena pri miših z okvarjenim genom Sting. Tako mRNA cepivo izzove protitumorsko imunost, odvisno od STING.

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

1. Uvod

Hiter razvoj in svetovna uporaba mRNA cepiv za preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2 sta pokazala moč zdravil na osnovi mRNA v zdravstvu1,2. Zaradi velike molekulske mase in negativnega naboja je treba molekule mRNA zapakirati v nosilce za dostavo, da lahko učinkovito vstopijo v celice sesalcev. Prednost pakiranja v dostavna vozila nanometrske velikosti je tudi pri zaščiti molekul mRNA pred encimsko razgradnjo. Za ta namen je bilo razvitih več dostavnih platform, kot so lipidni nanodelci4, lipo polipleks (LPP)5, liposom-protamin-RNA (LPR)6, lipopleks RNA (RNA-LPX)7 in virusu podobni delci cepiva (VLVP). )8. Medtem ko ima vsaka platforma svojo edinstveno strukturo in sestavo, večina nosilcev vsebuje ionsko lipidno molekulo, ki olajša pakiranje mRNA in uhajanje molekul mRNA iz endosomov. Z uspehom profilaktičnih cepiv obstaja splošno spoznanje, da se terapevtiki mRNA lahko uporabljajo za zdravljenje morda večine, če ne vseh vrst bolezni9e12. Dejansko so terapevtska cepiva proti raku na osnovi mRNA proučevali že več let13,14. Nedavni napredek v kliničnih preskušanjih je pokazal tudi možnost njihove uporabe pri izbranih bolnikih z rakom15e17. Za razliko od peptidnih cepiv proti raku, ki so pripravljena z adjuvansnimi molekulami18e20, lahko delci mRNA cepiva služijo tudi kot samoadjuvansi21.

Na primer, dvokomponentno cepivo proti raku na osnovi mRNA, ki vsebuje prosto in protaminsko kompleksirano mRNA, lahko prav tako aktivira signalizacijo toll-like receptorja 7 (TLR7)22. Vendar pa zaradi naraščajoče zaskrbljenosti glede akutne prirojene imunske toksičnosti zaradi gole mRNA večina raziskovalcev in podjetij uporablja modificirano RNA, da bi se izognili prirojenemu prepoznavanju s TLR-ji23. Posledično igrajo lipidne komponente pomembno vlogo pri povečanju adjuvantne aktivnosti v delcu mRNA cepiva, prednostno z aktiviranjem signalizacije, ki ni TLR. Nedavna študija lipidno formuliranega, negativno nabitega RNA-LPX, sestavljenega iz liposoma 1,2- di-oktadecenil-3-trimetilamonija (DOTMA, kationski lipid)/dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE, pomožni lipid), je razkrila aktivacija osi interlevkin 1 (IL1)-antagonist receptorja interlevkina 1 (IL-1ra) pri uravnavanju izločanja vnetnih citokinov in bistvena vloga aktiviranja dvostopenjske vnetne poti v monocitih24. Zanimiva je še ena nedavna preiskava BNT162b2 na osnovi LNP, pripravljenega z ALC-0315 (ioniziranim lipidom), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholinom (DSPC, pomožni lipid) , polietilen glikol-2000-N, N-di tetradecil acetamid (PEG2000-DTA) in holesterol so pokazali ključno vlogo aktiviranja od interferona tipa I odvisnega signaliziranja MDA5, ne pa tudi TLR ali inflammasoma, pri spodbujanju obeh prirojena in adaptivna imunost cepiva proti COVID-1925. Te študije kažejo na možnost, da se dostavne platforme, sestavljene iz variabilnih lipidnih molekul, lahko zanašajo na različne poti prenosa signala za aktivnost cepiva. Zato je pomembno v celoti raziskati delovanje ključnih molekul in njihovih kombinacij, da bi še izboljšali terapevtiko mRNA.

V trenutni študiji smo postavili poskuse za seciranje funkcionalne vloge posameznih komponent v terapevtskem cepivu proti raku. Delec cepiva mRNA (MVP) je sestavljen iz jedra protamin/mRNA, ki je inkapsulirano v lipidni ovoj, sestavljen iz kationskega lipida, pomožnega lipida, pegiliranega lipida in holesterola (slika 1A). Dokazano je bilo, da lahko vključitev nabitega lipida olajša ciljno dostavo RNA26, dioleoiletyl fosfatidilholin (EDOPC) in dioleoil-3- trimetilamonijev propan (DOTAP) pa sta dva od kationskih lipidov, ki sta bila testirana v ta namen5,27. Preučili smo stimulacijo izražanja interferona-b (IFN-b), IL-1b in faktorja tumorske nekroze-a (TNF-a) z jedrom mRNA, nosilcem brez mRNA in celotnim MVP ter povezal takšne dejavnosti s TLR7, mitohondrijsko protivirusno signalizacijo (MAVS, znano tudi kot IPS-1), stimulatorjem genov IFN (STING) in adapterjem, ki vsebuje domeno TIR, ki inducira signalizacijo IFN-b (TRIF). Nato smo raziskali vlogo protamina v jedru in kationskega lipida v lupini pri spodbujanju ekspresije IFN-b in TNF-a. Končno smo primerjali protitumorske imunske odzive MVP pri divjih in gensko izločenih miših.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

2. Materiali in metode

2.1. Materiali

1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfoholin (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidil-etanolamin (DOPE) (850725) ), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N- [amino(polietilenglikol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoil-3-trimetilamonijev propan (DOTAP) (890890), 1,2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DOPC) (850375) so bili kupljeni pri Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, AL, ZDA). Holesterol (C8667) je bil pridobljen pri Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, ZDA). Reagenti so bili raztopljeni v etanolu pri koncentraciji 2 mg/mL za DSPE-PEG2k, 10 mg/mL za holesterol in DOPC ter 20 mg/mL za EDOPC, DOPE in DOTAP. Protamin sulfat (P4020) je bil pridobljen pri Sigma Aldrich. pri TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, ZDA). Voda brez RNaze (W0805-010) je bila pridobljena pri GeneDEPOT (Baker, TX, ZDA). Agonist TLR7 imikvimod (tlrimq) in agonist Stinga 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) sta bila produkta podjetja Invivogen (San Diego, CA, ZDA). Lipofectamine 2000 (11668019) in Quant-iT™ RiboGreen™ RNA testni komplet (R11490) sta bila kupljena pri Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, ZDA). Rekombinantni mišji GM-CSF (554586) je bil kupljen pri BD Biosciences (San Diego, CA, ZDA). 500 koktajl zaviralcev transporterja beljakovin (00-4980-93) je bil izdelek podjetja Invitrogen. Komplet Cytofix/Cytoperm (AB_2869010) je bil kupljen pri BD Biosciences. EasySep™ Mouse T Cell Isolation Kit (19851) je bil pridobljen pri STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). Naslednja protitelesa so bila pridobljena pri BioLegend (San Diego, CA, ZDA): anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) in anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643) in anti-CD103-PE (121406). Anti-CD40-FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979) in anti-IFN-g-PE (554412) so bili iz BD Biosciences. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) je bil kupljen pri ImmuDex (Fairfax, VA, ZDA). Kompleti ELISA za IL-1b (EM2IL1B) in TNF-a (BMS607-3) so bili kupljeni pri Invitrogenu, kompleti ELISA za CCL5 (DY478) in IFN-b (DY8234) pa so bili pridobljeni pri R&D Systems , Inc. (Minneapolis, MN, ZDA). Protitelesa za Western blot analizo, vključno z anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), antifosfo-TBK1 (5483), anti-b-aktin (4970) in anti-GAPDH (5174) so bili kupljeni pri Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, ZDA).

Slika 1 Priprava in karakterizacija delcev mRNA. (A) Shematski prikaz priprave delcev cepiva. (B) Elektroforeza v agaroznem gelu kaže, da so se molekule mRNA obdržale v vdolbinici za nalaganje vzorca v vzorcih, pripravljenih z mRNA/protaminom v razmerju 1:1 do 1:2. (CeF) Karakterizacija delcev mRNA cepiva (MVP) na podlagi odstotka inkapsulacije, indeksa polidisperznosti, zeta potenciala in velikosti. (G) Reprezentativne TEM slike delcev MVP2, lestvica Z 50 nm. (H) Odstotek ekspresije eGFP po tem, ko so bile celice DC2.4 16 ur obdelane z eGFP-MVP. (I) Fluorescentno slikanje celic DC2.4, ki izražajo eGFP, lestvica Z 400 mm. (J) Kvantitativna analiza bioluminiscence v BMDC, zdravljenih z MVP, inkapsuliranimi z mRNA, ki kodira luciferazo, 16 ur. (K) Spremembe v sposobnosti preživetja BMDC, zdravljenih s PBS, vehiklom brez mRNA, jedrom mRNA/protamina ali MVP2, inkapsuliranim z mRNA. Koncentracije pri zdravljenju so bile enakovredne mRNA. Podatki so predstavljeni kot povprečje SEM (n Z 3). *P <0,05; **P <0,01.

2.2. Celične linije in celične kulture

Mišjo dendritično celično linijo DC2.4 smo pridobili pri ATCC (Manassas, VA, ZDA) in jo gojili v RPMI-1640, ki vsebuje 10 % fetalnega govejega seruma (FBS) in 1 % penicilin-streptomicina. Celična linija mišjega melanoma B16-OVA je bila pridobljena od dr. Kennetha Rocka, Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, ZDA). Celice B16-OVA smo gojili v DMEM, dopolnjenem z 10 % FBS in 1 % penicilin-streptomicina. Celična linija mišjega adenokarcinoma debelega črevesa MC38 je bila kupljena pri ATCC. Celice smo oblikovali z ekspresijo OVA in jih gojili v DMEM z 10 % FBS in 1 % penicilin-streptomicina. Celično kulturo smo vzdrževali pri 37 °C s 5 % CO2.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

2.3. Priprava delcev cepiva mRNA

Vsi delci cepiva mRNA so bili pripravljeni z uporabo mikrofluidnega instrumenta NanoAssemblr Benchtop podjetja Precision Nanosystems, Inc. (Vancouver, BC, CAN) z mešanjem organske faze in vodne faze. Za pripravo organske faze smo EDOPC (20 mg/mL), DOPE (20 mg/mL), holesterol (10 mg/mL) in bis-DSPE-PEG2k (2 mg/mL) raztopili v etanolu in zmešali pri 34 °C. :30:35:1 M razmerje s pretokom 9 ml/min. Za pripravo jedra mRNA vodne faze smo mRNA zmešali s protamin sulfatom v razmerju 1:1 (m/m) v mikrofluidnem instrumentu pri pretoku 9 ml/min. Po 20 minutah inkubacije pri 20 °C smo jedro mRNA vodne faze zmešali z organsko fazo, da smo ustvarili delce cepiva mRNA. Po 20 minutah smo suspenzijo delcev cepiva prenesli v ultra centrifugalni filter Amicon (MWCO 30 kDa) in dodali 9-volumensko vodo molekularne stopnje, da smo razredčili koncentracijo etanola s 25 % na 2,5 %. Suspenzijo delcev smo nato koncentrirali s centrifugiranjem pri 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) pri 4 °C. Koncentriranemu produktu smo dodali enak volumen 2 PBS za prilagoditev osmotskega tlaka.

2.4. Test retardacije gela

Jedro mRNA/protamina je bilo najprej analizirano z retardacijo gela. Na kratko, mRNA/protaminsko jedro, ki je vsebovalo 0,5 mg mRNA, smo naložili v jamico 1 % agaroznega gela v 1 raztopini TBE in izvedli elektroforezo pri 120 V 30 minut (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). Trakovi RNA so bili obarvani z Gelredom (Biotium, Hayward, CA) in odkriti s sistemom GelDoc (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Karakterizacija delcev mRNA cepiva

Porazdelitev velikosti in zeta potencial sta bila izmerjena z Zetasizerjem za dinamično sipanje svetlobe (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, ZDA). Hitrost inkapsulacije je bila določena z uporabo kompleta za analizo Quant-iT™ RiboGreen™ RNA. Na kratko, vzorec delcev cepiva, ki je vseboval 0.5 mg mRNA, je bil razredčen s pufrom TriseEDTA (10 mmol/L TriseHCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,5) z ali brez 2 % Triton-X100 v { {10}}vdolbinska plošča. Po 10 minutah inkubacije pri 37 C smo v vsako vdolbinico dodali RiboGreen in izmerili intenzivnost fluorescence. Učinkovitost inkapsulacije je bila izračunana, kot je prikazano v enačbi. (1): Transmisijska elektronska mikroskopija (TEM) delcev cepiva je bila izvedena po prej opisanem postopku9.

2.6. Živali

Vse operacije na živalih je odobril Odbor za nego živali in uporabo Houstonske metodistične bolnišnice (številka protokola AUP06200042). Miši so bile nameščene v okolju, ki je popolnoma izpolnjevalo regulativne standarde Nacionalnega inštituta za zdravje in standarde Ameriškega združenja za nego laboratorijskih živali. Miši divjega tipa C57BL/6J in miši z genskim inženiringom, vključno z mišmi Tlr7 /, Sting /, Mavs / in Trif /, so bile kupljene pri Jackson Laboratory.

2.7. Generacija dendritičnih celic mišjega kostnega mozga (BMDC)

Celice kostnega mozga so bile odplaknjene iz stegnenice in golenice s popolnim RPMI 1640. Rdeče krvne celice so bile lizirane s pufrom za lizo ACK, nezrele celice kostnega mozga pa so bile 10 let kultivirane v RPMI 1640, dopolnjenem z 20 ng/mL rekombinantnega mišjega GM-CSF. dni pri 37 C s 5% CO2. Medij celične kulture je bil osvežen 3., 6. in 8. dan, nesprijete dendritične celice pa so bile zbrane 10. dan.

2.8. Merjenje citokinov in kemokinov

BMDC so bili zasejani v 24-ploščo z vdolbinicami pri gostoti 5  105 celic/vdolbinico. Po 1 h naselitve smo celice obdelali z 1 mg/mL imikvimoda, 20 mg/mL 20 30 -cGAMP (ekvivalent 1 mg/mL mRNA) delci cepiva ali kontrole. Gojišča celične kulture so bila zbrana 24 ur pozneje in ravni TNF-a, CCL5, IFN-b in IL-1b so bile izmerjene z uporabo kompletov za encimski imunski test (ELISA) po postopkih, ki jih je predlagal proizvajalec.

rastlina cistanche krepi imunski sistem

2.9. Analize DC transfekcije, DC zorenja in stimulacije

Za analizo učinkovitosti transfekcije DC in vitro smo celice DC2.4 zasejali po 2.5 105 celic/vdolbinico v 24-ploščo z vdolbinicami. Celice smo obdelali z eGFP- ali luciferazo-enkapsuliranimi delci mRNA pri končni koncentraciji 1 mg mRNA/mL. Celice smo pobrali 24 ur kasneje, sprali z 2 % FBS v raztopini PBS in nato resuspendirali v isti raztopini, preden smo jih uporabili za analizo pretočne citometrije s pretočnim citometrom BD LSR II (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) . Za merjenje zorenja DC in predstavitve antigena in vitro so bili BMDC zasejani pri 2.5  105 celicah/vdolbino v 24-plošči z vdolbinicami in 24 ur obdelani z 1 mg/mL OVA-MVP. BMDC-ji so bili 30 minut obarvani s protitelesi, specifičnimi za CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 in CD86 za zorenje DC, in anti-H-2Kb (SIINFEKL) za predstavitev antigena. Za določitev stimulativne jakosti in vivo so miši C57BL/6J cepili enkrat z 10 mg OVA-MVP na miš v tačko in pobrali drenažne poplitealne LN 24, 48 in naslednje označevalce celične površine: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Analize s pretočno citometrijo na aktivacijo in proliferacijo celic T

Za merjenje aktivacije celic T in vivo so miši enkrat cepili z 10 mg OVA-MVP in poplitealne LN izolirali po 24 ali 48 urah. Celice T smo obarvali z naslednjimi protitelesi: CD45, CD3, CD4, CD8 in CD69. Za odkrivanje antigen-specifičnih celic T so tumorje, vranico in poplitealne bezgavke pobrali 5 dni po drugem cepljenju. Tkiva smo obdelali, da smo ustvarili enocelične suspenzije, celice pa smo po navodilih proizvajalca obarvali s protitelesi, specifičnimi za celice T, in dekstramerjem OVA257e264-MHCI. Za merjenje znotrajcelične ravni IFN-g smo 2  106 splenocite ali celice, izolirane iz poplitealnih LN in tumorjev, stimulirali z 10 mg/mL peptida OVA257e264 v popolnem mediju RPMI 1640, dopolnjenem s 55 mmol/L b-merkaptoetanola in 1 inhibitorjem proteinskega transporterja koktajl 18 ur. Celice smo pobrali in obarvali s protitelesi, specifičnimi za celice T. Po fiksaciji in permeabilizaciji s kompletom Cytofix/Cytoperm smo celice obarvali s protitelesom anti-IFN-g in jih uporabili za analizo na pretočnem citometru BD LSR II (BD Biosciences). Za merjenje proliferacije celic T smo celice T izolirali iz vranic transgenih miši OT-I z uporabo kompleta za izolacijo celic T miši. Obarvali so jih z 1 mmol/L CFSE v RPMI 1640, ki je vseboval 200 mg/mL BSA, 10 minut pri 37 °C. CFSE označene T celice smo dvakrat sprali s 5 volumni hladnega popolnega RPMI 1640. Medtem smo zrele BMDC obdelali z 2 mg/mL OVA mRNA-inkapsuliranega MVP 24 ur pred izolacijo celic T. Ko so bile T celice pripravljene, so bile BMDC in T celice so-kultivirane v razmerju 1:5 (DC: T) 72 ur. Celice smo zbrali in obarvali s površinskimi protitelesi za celice T, proliferacijo testirali s pretočnim citometrom BD LSR II (BD Biosciences) in analizirali. Vse rezultate pretočne citometrije smo analizirali s programsko opremo FlowJo v10 (Ashland, OH, ZDA).

2.11. Sledenje izražanju beljakovin v živih miših

BALB/c miši smo zdravili z intra-footpad injekcijo z 10 mg Luc mRNA-inkapsuliranega MVP. Intraperitonealno so jim injicirali 30 mg RediJect D-luciferina na miš 6, 12, 24 ali 48 ur kasneje in bioluminiscenco izmerili s slikovnim sistemom Xenogen IVIS-200 (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, ZDA).

2.12. ELISpot test

IP filtrirne plošče smo predhodno splaknili s 50 mL 35% etanola in 3-krat temeljito sprali s PBS, preden je etanol izhlapel. Plošče so bile nato prekrite s protitelesi za zajemanje anti-IFN-g pri 4 °C čez noč. Plošče so bile blokirane s popolnim medijem RPMI 1640, ki je vseboval 55 mmol/L b-merkaptoetanola, 2 uri pri 37 °C. Celice (1  105 splenocitov, 1  105 celic iz poplitealne LN) smo zasejali v vsako vdolbinico in 36 ur stimulirali z 10 mg/ml peptida OVA257e264. Medij smo zavrgli in celice 4-krat sprali s PBST (PBS, ki vsebuje 0,05 % Tween 20) in dvakrat s PBS. Po končnem pranju smo dodali detekcijsko protitelo proti IFN-g in ga inkubirali 2 uri pri sobni temperaturi v temi. Plošče smo sprali 4-krat s PBST in dvakrat s PBS ter dodali avidin-HRP in inkubirali še 45 minut pri sobni temperaturi v temi. Končno smo plošče ponovno sprali s PBST in PBS, kot je opisano zgoraj, in nanesli 50 mL substrata AEC ter opazovali reakcijo na mestu. Ko so postale vidne lise, smo reakcijo ustavili tako, da smo substrat AEC zavrgli in ga 5-krat splaknili z dvojno destilirano vodo. Po sušenju na zraku čez noč so bile plošče skenirane in analizirane z uporabo analizatorja CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, ZDA).

2.13. Western blot analiza

Zbrani so bili BMDC-ji, pridobljeni iz miši divjega tipa, Mavs KO ali Sting KO, celice pa so bile lizirane v pufru za lizo celic RIPA, dopolnjenem z zaviralci proteaze in fosfataze. Koncentracijo beljakovin v celičnem lizatu smo izmerili s kompletom za analizo beljakovin BCA. Vzorce beljakovin smo ločili z elektroforezo v natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) in prenesli na membrano iz poliviniliden difluorida (PVDF). Izražanje MAVS in STING je bilo odkrito po inkubaciji membrane s protitelesom proti MAVS ali proti STING pri razredčitvi 1:2000, čemur je sledila imunska detekcija s SuperSignal West Pico in Femto Chemiluminescent Substrate. Za merjenje aktivacije poti STING smo BMDC, pridobljene iz miši divjega tipa, zdravili z MVP, inkapsuliranim z vehiklom ali OVA mRNA, pri navedeni koncentraciji 2 uri. Celice smo lizirali in nadaljevali z analizo Western blot s protitelesi proti TBK1 in antifosfo-TBK1 pri razredčitvi 1:2000.

2.14. Protitumorski test

Modeli mišjih tumorjev so bili ustvarjeni z inokulacijo 2  105 celic B16-OVA melanomskih celic ali 5  105 MC38-OVA celic na miš subkutano v levi bok od 6 do {{5} }teden stare samice miši C57BL/6J. Miši so bile naključno razporejene v skupine za zdravljenje in dvakrat obdelane v razmiku 7 dni z 10 mg OVA MVP ali kontrolnimi v tačko. Rast tumorja smo spremljali vsaka 2 dni. Volumen tumorja je bil izračunan v skladu z enačbo. (2):

Miši so bile evtanazirane 5 dni po drugem cepljenju in zabeležena je bila teža tumorskih tkiv.

2.15. Statistična analiza

Vsi rezultati so predstavljeni kot povprečje SEM. Statistika je bila ocenjena z enosmernim testom ANOVA z uporabo Tukeyjevega popravka za primerjavo več skupin in neparnega dvostranskega t-testa za primerjavo dveh skupin. Podatki so bili analizirani s programsko opremo GraphPad Prism v8.0.2. P < 0.{{10}}5 velja za statistično pomembno (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Rezultati

3.1. MVP posreduje robustno izražanje mRNA v dendritičnih celicah (DC)

Pripravili smo delce cepiva z jedrom in lupino v dvostopenjskem mikro-fluidnem pristopu (slika 1A) in sistematično ovrednotili posamezne komponente v nanodelcu, da smo sestavili delec cepiva z visoko stabilnostjo, visokim celičnim privzemom in visokim ekspresijskim potencialom v DC. Gelska elektroforeza je pokazala, da se lahko oblikuje stabilno jedro mRNA, ko je razmerje mRNA proti protaminu 1 ali manj (slika 1B). Z uporabo mRNA, ki kodira eGFP, kot nadomestnega markerja smo ugotovili, da sestava lipidov pri molskem razmerju 34 % EDOPC/30 % DOPE/35 % holesterola/1 % DSPEPEG2k zagotavlja idealno stopnjo inkapsulacije in najboljšo učinkovitost izražanja (tabela 1, Podporne informacije, slika S1AeS1D). Spreminjanje razmerja naboja ni bistveno spremenilo stopnje inkapsulacije, indeksa polidisperznosti ali površinskega naboja delcev (tabela 2, slika 1CeE); vendar je bila velikost nastalih delcev med 70 in 80 nm v premeru, ko je bilo razmerje med 12 in 16, v primerjavi s premerom 120-130 nm, ko je razmerje padlo izven območja (sl. 1F in G). Najboljšo ekspresijo smo odkrili v celicah DC2.4, obdelanih z MVP2, ki so imele razmerje naboja 12 (sl. 1H in I). Podoben vzorec so opazili, ko so delce pripravili z mRNA, ki kodira luciferazo, in zaznali ekspresijo, odvisno od odmerka (slika 1J). Delci, inkapsulirani z mRNA, so pokazali zaželeno stabilnost, saj niso izgubili aktivnosti po liofilizaciji ali zamrzovanju-odmrzovanju (sl. S1E in S1F). Poleg tega ni bilo citotoksičnosti, potem ko so bile dendritične celice, pridobljene iz kostnega mozga (BMDC), obdelane samo z jedrom mRNA, delcem nosilca, pripravljenim brez molekul mRNA, ali MVP2, ki vsebuje mRNA (slika 1K). Tako je MVP2 pokazal najboljši izrazni potencial. Uporabljen je bil za vse nadaljnje poskuse v študiji in označen kot MVP v preostalem delu besedila. Delci MVP bi lahko učinkovito dostavljali molekule mRNA in vivo in ni bilo zaznavne toksičnosti MVP, inkapsuliranega v mRNA, na podlagi sprememb telesne teže (slika S1GeS1I).

3.2. MVP učinkovito inducira predstavitev antigena in aktivacijo celic T in vitro in in vivo

Pripravili smo jedro mRNA, vehikel brez mRNA in OVA mRNA inkapsuliran MVP ter jih uporabili za testiranje zorenja DC in predstavitve antigena (slika 2A). BMDC, zdravljeni z MVP, so pokazali od odmerka odvisno čezmerno izražanje markerjev zorenja DC, vključno s CD40, CD80 in CD86 (slika 2BeD). Zdravljenje z vehiklom brez mRNA ali MVP, inkapsuliranim v mRNA, je sprožilo čezmerno izražanje MHC I (slika 2E), kar kaže, da je bil učinek povezan z vehiklom in ne s kompleksom mRNA. Poleg tega je zdravljenje z MVP povzročilo prikaz epitopa antigena OVA257e264 kompleksa MHC I (SIINFEKL-MHC I) na celični površini, ki je bil odkrit s protitelesom proti SIINFEKL-MHCI (slika 2F), kar kaže na učinkovito obdelavo antigena in predstavitev z BMDC. . Poleg tega soinkubacija BMDC, obdelanih z MVP, z B3Z, CD8þ linijo celic T, ki je specifično prepoznala epitop OVA257e264, ali celicami T, izoliranimi iz vranice miši OT-I, ki izražajo celico T, specifično za OVA257e264- receptorja, sprožilo izločanje IL-2, rezultat pa ni bil opažen v celicah T, sočasno inkubiranih z DC, zdravljenimi samo z nosilcem ali samo z mRNA/protaminskim jedrom (slika 2G). Analiza s pretočno citometrijo je odkrila 32,5 % proliferativnih celic CD8þ T po soinkubaciji z MVP (sliki 2H in I). Delce MVP, inkapsulirane z OVA mRNA, smo uporabili tudi za zdravljenje miši z intradermalno injekcijo. Preiskava celic v drenažnih bezgavkah je pokazala enakomerno povečanje izražanja CD86 med klasičnimi DC (CD8þ DC, CD11bþ DC, CD103þ DC) in plazmocitoidnimi DC (pDC) v prvih 48 urah, kar kaže na stimulacijo DC zorenje (slika 2J). Zdravljenje je prav tako spodbudilo obogatitev CD8þ T celic v bezgavkah, s pomembnim povečanjem populacije CD69þCD8þ T celic (sl. 2K in L), kar kaže na aktivacijo T celic z zdravljenjem. Za določitev aktivacije celic T smo zbrali celice v drenažnih bezgavkah 3, 5 ali 7 dni po zdravljenju z MVP in izvedli analize ELISpot, potem ko so bile celice izzvane s peptidom antigena OVA257e264 (podporne informacije, slika S2). Zdravljenje z MVP je v tem času sprožilo velik skok v celicah, ki izločajo IFN-g, z največjo aktivnostjo 5. dan (slika 2M). Ti rezultati so pokazali močno DC stimulacijo, predstavitev antigena in aktivacijo T-celic po zdravljenju z MVP.

Tabela 1 Sestava nanodelcev, inkapsuliranih z mRNA, ki kodira eGFP.

Tabela 2Lipidna sestava in razmerje nabojev MVPdelci.

3.3. MVP izzove močno protitumorsko imunost pri mišjih modelih kolorektalnega tumorja in melanoma

MVP je bil uporabljen za zdravljenje miši z rakom debelega črevesa MC38 in melanomom B16. V obeh modelih je zdravljenje z OVA mRNA inkapsulirano MVP dvakrat popolnoma blokiralo subkutano rast tumorja; za primerjavo, zdravljenje z eGFP mRNA inkapsuliranim MVP ali samim vehiklom ni imelo nobenega opaznega zaviralnega učinka na rast tumorja (slika 3AeD, podporne informacije, slika S3). V skladu z vzorcem premika CD4 v CD8 v bezgavkah (slika 2) smo opazili povečanje razmerja celic CD8+/CD4+ T v tumorjih miši, zdravljenih z MVP, inkapsuliranim z OVA mRNA (slika 3E). Poleg tega smo odkrili povišane ravni v celicah T IFN-gþCD8þ v vranici, bezgavkah in tumorjih pri miših, zdravljenih z MVP, inkapsuliranim z OVA mRNA, vendar ne samo z vehiklom ali MVP, inkapsuliranim z GFP mRNA (slika 3FeH, Podporne informacije Slika S4). Poleg tega je prišlo do pomembnega povečanja OVA257e264-MHCI dekstramer pozitivnih celic CD8þ T v tumorjih iz skupine za zdravljenje MVP, inkapsulirane z OVA mRNA, kar kaže na proliferacijo antigen-specifičnih celic CD8þ T (slika 3I). Test ELISpot s celicami, izoliranimi iz vranice in bezgavk, je dodatno podprl aktivacijo celic T (slika 3JeM).

3.4. MVP stimulira prirojene imunske odzive z aktiviranjem od STING-odvisnega signaliziranja

Uporabili smo jedro mRNA, nosilec brez mRNA in MVP, inkapsuliran z mRNA, za zdravljenje BMDC, da bi identificirali ključne dejavnike in poti, odgovorne za stimulacijo ekspresije IFN tipa I in vnetnih citokinov. Zanimivo je, da je bil MVP tako močan kot agonist Tlr7 imikvimod pri sprožanju izločanja IFN-b, sam vehikel pa je tudi pokazal aktivnost pri spodbujanju izločanja IFN-b, čeprav njegova moč ni bila tako visoka kot MVP; vendar je bilo samo jedro mRNA neučinkovito pri spodbujanju izločanja IFN-b (slika 4A). Rezultat je nakazal, da so bile za maksimiranje ekspresije IFN-b potrebne tako mRNA kot komponente v nosilcu. Medtem sta imikvimod in vehikel pokazala podobno aktivnost pri spodbujanju ekspresije TNF-a in IL-1b, medtem ko je bil MVP veliko močnejši od enega od njiju (sliki 4B in C). Izražanje CCL5, citokina, ki je običajno povezan z regulatornimi faktorji NF-kB in IFN, je bilo enako stimulirano v celicah, zdravljenih z imikvimodom, samo z vehiklom ali MVP (slika 4D). TLR7, MAVS, STING in TRIF so ključni dejavniki v glavnih poteh prenosa signala, ki posredujejo celični odziv na virusno RNA in poškodovano DNA28e30. Generirali smo BMDC iz miši z izločitvijo gena Tlr7, Mavs, Sting ali Trif (KO) in obdelali celice z jedrom mRNA, nosilcem brez mRNA ali MVP, inkapsuliranim z mRNA, da bi preučili izražanje IFN-b in TNF-a.

Slika 2 Stimulacija imunskih odzivov z MVP. (A) Shematski prikaz jedra mRNA/protamina, nosilca brez mRNA in celotnega MVP. (BeD) Zorenje BMDC po 24-urnem zdravljenju z OVA-MVP. (E in F) Ekspresija MHC I in kompleks epitop antigena OVA257e264-MHC I v BMDC po 24-urnem zdravljenju z OVA-MVP. (G) Raven IL-2 iz zdravljenih BMDC, soinkubiranih s celicami B3Z ali OT-I T. (H in I) Analiza proliferativnih T celic s pretočno citometrijo. Prikazani so reprezentativni kromatogrami celic T. (J) Zorenje DC po zdravljenju z MVP in vivo. Miši C57BL/6J smo zdravili z OVA-MVP in analizirali DC v poplitealnih bezgavkah. (K in L) Analiza populacije celic T. Miši C57BL/6J smo zdravili z vehiklom ali OVA-MVP in celice T v poplitealnih bezgavkah smo analizirali s pretočno citometrijo. (M) ELISpot test. C57BL/6J miši smo zdravili z OVA-MVP in bezgavke smo zbrali ob navedenih časovnih točkah. Izolirane celice smo uporabili za merjenje celic, ki izražajo IFN-g. Podatki so predstavljeni kot povprečje SEM (n Z 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0,005; ****P < 0,001; ns, ni pomembno.

Slika 3 Protitumorska aktivnost MVP. (A) Zaviranje rasti tumorja MC38-OVA. Samice miši C57BL/6J so bile subkutano cepljene s tumorskimi celicami 5  105 MC38-OVA/miš 0. dan in zdravljene s kontrolo PBS, kontrolo nosilca, GFP-MVP ali OVA-MVP na dan 3. in 1. dan0. (B) Zaviranje rasti tumorja B16-OVA. Samice miši C57BL/6J so bile subkutano cepljene s tumorskimi celicami 2  105 B16-OVA/miš na dan 0 in zdravljene s kontrolo PBS, kontrolo nosilca, GFP-MVP ali OVA-MVP 3. in 1. dan0. (C in D) Slika in teža tumorjev B16-OVA na dan 17. (E) Populacija celic T v tumorjih miši po zdravljenju. (FeH) IFN-gþCD8þ T celice v vranici, bezgavkah (LN) in tumorjih miši po zdravljenju. (I) OVA-specifične CD8þ T celice v tumorjih miši po zdravljenju. (JeM) Slike in kvantitativna analiza ELISpot testa celic vranice in LN iz miši po zdravljenju. Podatki so predstavljeni kot povprečje SEM (n Z 5). *P < 0.05; **P <0,01; ***P <0,005; ****P < 0,001.

Stanje KO Mavs in Sting v BMDC je bilo potrjeno z analizo Western blot (podporne informacije, slika S5A). Presenetljivo je, da je Sting KO izbrisal stimulativno aktivnost na izločanje IFN-b iz samega nosilca in MVP (slika 4E), kar kaže, da je MVP aktiviral izražanje IFN tipa I prek STING. Da bi podprli idejo, smo odkrili fosforilacijo kinaze, ki veže rezervoar 1 (TBK1) (slika S5B), kinaze, ki je običajno povezana z aktivnostjo STING31. Poleg tega je bila ta pot neodvisna od signalizacije TLR7, saj izražanje IFN-b ni bilo ogroženo v celicah, zdravljenih z imikvimodom (slika 4E). Za primerjavo sta imela Trif ali Mavs KO minimalen vpliv na ekspresijo IFN-b, ki jo spodbuja MVP. Kot je bilo pričakovano, je bil imikvimod neučinkovit pri spodbujanju izločanja IFN-b v BMDC, pridobljenih iz Tlr7 KO; vendar je imel Tlr7 KO negativen vpliv na stimulativni učinek MVP (slika 4E). Zanimivo je, da so pri istih zdravljenjih opazili drugačen profil izločanja TNF-a. Knockout Stinga, Trifa ali Tlr7 ni imel minimalnega vpliva na izražanje citokinov, stimulirano z MVP. Knockout of Mavs je po drugi strani dramatično znižal ravni TNF-a v celicah, zdravljenih s samim vehiklom ali MVP (slika 4F). Rezultat kaže, da je MAVS ključni regulator izražanja TNF-a v DC po zdravljenju z MVP.

3.5. MVP stimulira poti STING in MAVS za spodbujanje izločanja IFN-I in vnetnih citokinov

Za identifikacijo komponent v nosilcu, odgovornih za stimulacijo signalizacije STING in MAVS, smo pripravili nosilce in MVP tako, da smo zamenjali ali izpustili ključne komponente in jih uporabili za zdravljenje BMDC. Stingov agonist ciklični GMP-AMP (cGAMP) je služil kot pozitivna kontrola pri spodbujanju izločanja IFN-b. Zamenjava kationskega lipida EDOPC v nosilcu z drugim pozitivno nabitim lipidom, DOTAP, je popolnoma izbrisala izločanje IFN-b. Za primerjavo, stimulacijski učinek nosilca in MVP se je ohranil s protaminom ali brez njega, takšna stimulativna aktivnost pa je bila odvisna od nedotaknjenega gena Sting (slika 4G). Zanimivo je, da BMDC, zdravljeni s posameznimi komponentami lipidne lupine, vključno z EDOPC, niso spodbujali močnega izločanja IFN-b (podporne informacije, slika S6). Tako je bil EDOPC bistvenega pomena za aktivacijo STING, njegova aktivnost pa je odvisna od tvorbe lipidnega nanodelca (tj. nosilca ali MVP). Vehikel in MVP, pripravljena z EDOPC ali DOTAP, sta bila uporabljena tudi za zdravljenje BMDCS, pridobljenih iz miši divjega tipa in Mavs KO, in določene so bile ravni TNF v gojiščih za rast celic. Kot je bilo pričakovano, je zamenjava EDOPC z DOTAP ali DOPC odpravila stimulacijski napor vozila in MVP. Poleg tega je bila raven TNF-a znatno znižana v celicah Mavs KO v primerjavi s celicami divjega tipa, vendar se ni zmanjšala (slika 4H), kar kaže, da bi lahko bili dodatni dejavniki vključeni v posredovanje izražanja TNF-a, stimuliranega z MVP.

3.6. Pot STING je bistvena za protitumorske imunske odzive, ki jih posreduje MVP

Tako divji tip kot izločene miši smo zdravili z MVP, inkapsuliranim z OVA mRNA, pregledali pa smo zorenje DC in proliferacijo celic T. Sting KO je občutno zmanjšal odstotek celic CD80þ in CD86þ DC ter celic CD69þ T (slika 5AeD). Test ELISpot je pokazal znatno zmanjšano število celic, ki proizvajajo IFN-g, v vranici in bezgavkah miši Sting KO v primerjavi z mišmi divjega tipa, potem ko so bile zdravljene z enakim odmerkom MVP (slika 5EeH). Vpliv zdravila Mavs KO je bil minimalen, saj niso opazili nobene razlike pri CD44þCD8þ spominskih T-celicah, OVA257e264-MHCI dekstramer pozitivnih CD8þ T-celicah ali številu celic, ki proizvajajo IFN-g, v bezgavkah v primerjavi z divjimi vrste miši (slika 5IeL). Rezultat krepi idejo, da so lahko dodatni dejavniki poleg MAVS vključeni v izražanje vnetnih citokinov, ki jih stimulira MVP. Tako miši divjega tipa kot miši Sting KO so bile uporabljene za inokulacijo tumorjev B16-OVA, miši pa so bile zdravljene s kontrolo PBS ali MVP, inkapsulirano z OVA mRNA. Analiza pretočne citometrije na vzorcih bezgavk in tumorjev, zbranih pri cepljenih miših, je pokazala znatno zmanjšano število celic CD8þ T, ki proizvajajo IFN-g, pri miših Sting KO (sliki 6A in B). Posledično je bila rast tumorja popolnoma zavrta pri miših divjega tipa, zdravljenih z MVP, v primerjavi s samo delno inhibicijo pri miših Sting KO (slika 6C).

rastlina cistanche krepi imunski sistem

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Razprava

V trenutni študiji smo sistematično preučili funkcionalne vloge posameznih komponent v MVP pri stimulaciji protitumorskih imunskih odzivov. Naša študija, ki temelji na celicah, je jasno pokazala, da so tako molekule mRNA kot nosilec brez RNA v MVP potrebni za njegovo polno delovanje pri spodbujanju izražanja IFN-b in številnih vnetnih citokinov, vključno z IL-1b in TNF -a v dendritičnih celicah. Pokazalo se je, da imajo takšni citokini bistveno vlogo pri aktivaciji dendritičnih celic in protitumorski imunosti, posredovani s cepivom20. Naša študija je tudi pokazala, da je stimulacija proizvodnje citokinov odvisna od številnih ključnih poti prenosa signala, vključenih v prirojeno imunsko zaznavanje, vključno s tistimi, ki jih posredujeta STING in MAVS. Medtem ko je STING bistven za izražanje IFN-b, je MAVS v glavnem vključen v uravnavanje izražanja TNF-a (slika 6D). Pomen signalizacije STING na protitumorsko imunost, ki jo posreduje MVP, je nadalje prikazan z zmanjšano aktivnostjo celic T in posledično ogroženo inhibicijo rasti tumorja pri miših Sting KO. Ta rezultat je v skladu z drugimi poročili, da aktivacija STING določa protitumorsko imunost, posredovano s citotoksičnimi celicami T32. MAVS je ključni posrednik v signalizaciji RIG-I-receptorja (RLR) kot odziv na virusno okužbo. Aktivacija te poti vodi do kaskade vnetnih odzivov33. Zanimivo je, da aktivnost celic T ni ogrožena pri miših Mavs KO, glede na to, da signalizacija MAVS očitno igra veliko vlogo pri uravnavanju izražanja vnetnih citokinov, vključno s TNF-a. Možen razlog je, da stimulacijo takih citokinov z MVP posreduje več poti, motnja poti MAVS pa ne zmanjša izražanja citokinov na dovolj nizko raven, da bi povzročila pomemben učinek. Druga možnost je, da se izguba signalizacije MAVS kompenzira z drugimi potmi. Potrebne so nadaljnje študije za identifikacijo teh poti za nadaljnje razumevanje mehanizma delovanja cepiva MVP. Čeprav je bil TLR7 tradicionalno povezan s terapevtiki mRNA21, se zdi, da signalizacija TLR7 ne igra pomembne vloge pri posredovanju aktivnosti MVP. Uporaba popolnoma metiliranih molekul mRNA v trenutni študiji je morda povzročila, da je signalizacija TLR7 manj pomembna. Dobro je bilo dokazano, da metilacija RNA zavira prepoznavanje s TLR-ji23. TRIF je ključni adapterski protein za signalizacijo TLR3/7/828. Izločitev Trifa tudi ne vpliva na aktivnost MVP, kar potrjuje idejo, da zgornji TLR-ji, vključno s TLR7, nimajo pomembne vloge pri posredovanju celičnih odzivov na MVP. Pri razvoju cepiva proti raku je bilo uporabljenih več agonistov Stinga, vključno s cikličnimi dinukleotidi ter majhnimi in velikimi molekulskimi spojinami34e37. Takšne agoniste Stinga je treba dodati kot zunanje adjuvanse med pripravo cepiva, kar sestavi cepiva doda še eno plast kompleksnosti. Poleg tega lahko zunaj dodan agonist Stinga povzroči neželene stranske učinke, ko se loči od kompleksa mRNA. Za primerjavo, naš MVP služi kot samoadjuvans in deluje v kontekstu cepiva proti raku, saj nobena od posameznih komponent cepiva, vključno z EDOPC, ne more spodbuditi izražanja citokinov. Zanimivo je, da kationskega fosfolipida EDOPC ni mogoče nadomestiti z nefosfolipidnim DOTAP, ki je prav tako pozitivno nabit. Zanimivo je ugibati o potencialnem mehanizmu za razliko med tema dvema kationskima lipidoma. Vendar pa je bilo dokumentirano, da lahko druge lastnosti komponente lipidne molekule, kot je hidrofobnost, močno vplivajo na celotno delovanje nanodelcev in njihovo učinkovitost dostave za nukleinske kisline38. Zato je treba biti previden pri izbiri ustreznih molekul za pripravo popolnoma delujočega mRNA cepiva. Če povzamemo, razvili smo močno terapevtsko cepivo proti raku na osnovi mRNA in posameznim komponentam v cepivu dodelili njihovo funkcionalnost. Njegov mehanizem delovanja se precej razlikuje od drugih platform mRNA, ki se uporabljajo za profilaktične in terapevtske posege. Znanje, pridobljeno iz trenutne študije, bo zagotovo usmerjalo prihodnji razvoj dodatnih terapevtikov mRNA.

Slika 4 Spodbujanje prirojenih imunskih odzivov z MVP. (AeD) BMDC, zdravljeni z 1 mg/mL imikvimoda, 1 mg/mL mRNA-ekvivalentnega jedra, nosilca ali MVP 24 ur. Ravni IFN-b, TNF-a, IL-1b in CCL5 so bile izmerjene z ELISA. (E in F) Ekspresija IFN-b in TNF-a BMDC, pridobljenih iz miši divjega tipa in gensko izločenih (KO). BMDC smo zdravili z navedenimi reagenti 24 ur. IFN-b in TNF-a smo izmerili z ELISA. (G) IFN-b v BMDC, pridobljenih iz divjega tipa in Sting knockout miši. BMDC so 24 ur zdravili z 20 mg/mL cGAMP, 1 mg/mL mRNA-ekvivalentnega jedra, nosilca ali MVP. Vozilo (DOTAP): pripravljeno z zamenjavo EDOPC z DOTAP; nosilec (brez protamina): pripravljen z izpustitvijo protamina. ND: ni zaznati. (H) TNF-a v BMDC, pridobljenih iz divjega tipa in Mavs knockout miši. BMDC so 24 ur zdravili z 1 mg/mL mRNA-ekvivalentnim jedrom, vehiklom ali MVP. Vozilo (DOTAP): pripravljeno z zamenjavo EDOPC z DOTAP; vozilo (DOPC): pripravljeno z zamenjavo EDOPC z DOPC. Podatki so predstavljeni kot povprečje SEM (n Z 3). ***P < 0.005; ****P < 0,001; ns, ni pomembno.

Slika 5 Protitumorski imunski odzivi pri izločenih miših Sting in Mavs. (AeD) Zmanjšana aktivacija DC in T celic pri miših s Stingom. Tako miši divjega tipa kot miši Stinga so bile zdravljene z MVP, inkapsuliranim z OVA mRNA, in bezgavke so bile zbrane 48 ur kasneje za merjenje DC in T celic. (EeH) Zmanjšane T-celice, ki izražajo IFN-g, v vranici in bezgavkah iz izločenih miši Sting. Prikazane so slike madežev in kvantitativne analize. (IeL) Brez vpliva na aktivnost celic T pri izločenih miših Mavs. Tako divji tip kot Mavs knockout miši smo zdravili s PBS kontrolo ali MVP, inkapsuliranim z mRNA OVA, in 48 ur kasneje smo zbrali bezgavke za merjenje CD44þCD8þ spominskih celic T (I), OVA257e264-MHCI dekstramer pozitivnih CD8þ Celice T (J) in število celic, ki proizvajajo IFN-g (K in L). Podatki so predstavljeni kot povprečje SEM (n Z 3 ali 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0,005; ****P < 0,001; ns, ni pomembno.

Slika 6 Od vboda odvisna protitumorska imunost. (A in B) Analiza T-celic, ki izražajo IFN-g, v bezgavkah in tumorskih tkivih, potem ko so bile divje in Sting izločene miši, ki so nosile tumorje B16-OVA, zdravljene z MVP, inkapsuliranim z OVA mRNA. Miši smo zdravili 3. in 1. dan0, bezgavke in tumorje pa zbrali 15. dan. Posamezne celice smo analizirali s pretočno citometrijo. (C) Zaviranje rasti tumorja pri divjih in Sting izločenih miših. Miši smo 3. in 1. dan zdravili s PBS kontrolo ali MVP0. Podatki so predstavljeni kot povprečje SEM (n Z 5). *P <0,05; ****P < 0,001; ns, ni pomembno. (D) Shematski pogled na MVP stimulacijo poti signalne transdukcije, ki vodi do proizvodnje citokinov v DC. Medtem ko stimulacijo ekspresije IFN-b posreduje izključno STING, obstaja več dejavnikov, vključno z MAVS, ki posredujejo ekspresijo TNF-a in IL-1b.

Reference

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ, et al. Učinkovitost cepiva mRNA-1273 SARS-CoV-2 ob zaključku slepe faze. N Engl J Med 2021; 385: 1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A, et al. Varnost in učinkovitost tretjega odmerka cepiva BNT162b2 Covid-19. N Engl J Med 2022; 386: 1910e21.

. Dowdy SF. Premagovanje celičnih ovir za terapevtiko RNA. Nat Biotechnol 2017; 35: 222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Sistemi lipidnih nanodelcev za omogočanje genskih terapij. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP, et al. Lipopolyplex potencira protitumorsko imunost cepljenja na osnovi mRNA. Biomateriali 2017; 125: 81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P, et al. Sistemska dostava modificirane mRNA, ki kodira herpes simplex virus 1 timidin kinazo za ciljno gensko terapijo raka. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC, et al. Sistemska dostava RNA v dendritične celice izkorišča protivirusno obrambo za imunoterapijo raka. Narava 2016; 534: 396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L, et al. Cepivo mRNA, ki posnema virus, za zdravljenje raka. Adv Ther 2021; 4: 2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA cepiva nova doba v vakcinologiji. Nat Rev Drug Discov 2018; 17: 261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L, et al. Celice CAR T se proizvajajo in vivo za zdravljenje srčne poškodbe. Znanost 2022; 375: 91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. V dobi mRNA cepiv, Ali obstaja kaj upanja za funkcionalno ozdravitev HIV? Virusi 2021; 13: 501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Streuber M, Kirchhoff S, Bukur T, et al. Nevnetno mRNA cepivo za zdravljenje eksperimentalnega avtoimunskega encefalomielitisa. Znanost 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. mRNA cepivo za imunoterapijo raka. Mol Rak 2021; 20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K, et al. mRNA v imunoterapiji raka: onkraj vira antigena. Mol Rak 2021; 20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M, et al. Personalizirana RNA mutanomska cepiva mobilizirajo polispecifično terapevtsko imunost proti raku. Narava 2017; 547: 222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M, et al. Cepivo RNA spodbuja imunost pri melanomu, zdravljenem z zaviralci kontrolnih točk. Narava 2020; 585: 107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanović S, Gouttefangeas C, et al. Aktivno prilagojeno preskušanje cepljenja za na novo diagnosticiran glioblastom. Narava 2019; 565: 240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA, et al. Imunoterapija raka. Cepivo z dendritičnimi celicami poveča širino in raznolikost celic T, specifičnih za neoantigen melanoma. Znanost 2015; 348: 803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S, et al. Neoantigensko cepivo povzroči intratumoralne T-celične odzive v preskušanju glioblastoma faze Ib. Narava 2019; 565: 234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H, et al. Sinergistična aktivacija protitumorske imunosti s terapevtskim cepivom v obliki delcev. Adv Sci 2021; 8: 2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. Ustvarjanje prirojenega občutka adjuvantnosti mRNA cepiva. Nat Immunol 2022; 23: 474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, et al. Cepiva na osnovi messenger RNA z dvojno aktivnostjo inducirajo uravnotežene adaptivne imunske odzive, odvisne od TLR-7-, in zagotavljajo protitumorsko delovanje. J Immunother 2011; 34: 1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Zatiranje prepoznavanja RNA s Toll-podobnimi receptorji: vpliv modifikacije nukleozidov in evolucijski izvor RNA. Imuniteta 2005; 23: 165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L, et al. IL-1 in IL-1ra sta ključna regulatorja vnetnega odziva na RNA cepiva. Nat Immunol 2022; 23: 532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M, et al. Mehanizmi prirojene in adaptivne imunosti na cepivo PfizerBioNTech BNT162b2. Nat Immunol 2022; 23: 543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Zamenjava pomožnih lipidov z nabitimi alternativami v lipidnih nanodelcih olajša ciljno dostavo mRNA v vranico in pljuča. J Nadzorna izdaja 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA, et al. Majhna interferenčna RNA za zdravljenje raka: premagovanje ovir pri porodu. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Odziv interferona tipa I in prirojeno imunsko zaznavanje raka. Trendi Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Mitotično napredovanje po poškodbi DNA omogoča prepoznavanje vzorcev v mikronukleusih. Narava 2017; 548: 466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S, et al. Poškodba DNK aktivira interferonski sistem tipa I prek senzorja citosolne DNK STING za spodbujanje protimikrobne prirojene imunosti. Imuniteta 2015; 42: 332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. Helikaza DDX41 zazna znotrajcelično DNK, ki jo posreduje adapter STING v dendritičnih celicah. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH, et al. Velikost terapevtske aktivacije STING določa protitumorsko imunost, ki jo posredujejo celice CD8þ T. Cell Rep 2018; 25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. Prepoznavanje vzorcev in signalni mehanizmi RIG-I in MDA5. Front Immunol 2014; 5: 342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E, et al. Cepiva proti raku, oblikovana z agonistom STING, lahko ozdravijo uveljavljene tumorje, odporne na blokado PD-1. Sci Transl Med 2015; 7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE, et al. Neposredna aktivacija STING v mikrookolju tumorja vodi do močne in sistemske regresije tumorja in imunosti. Cell Rep 2015; 11: 1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, et al. Dostava mRNA cepiv s heterocikličnimi lipidi poveča protitumorsko učinkovitost z aktivacijo imunskih celic, ki jo posreduje STING. Nat Biotechnol 2019; 37: 1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y, et al. STING aktivirajoče nano cepivo za imunoterapijo raka. Nat Nanotechnol 2017; 12: 648e54.

38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Transfekcijska aktivnost binarnih mešanic kationskih o-substituiranih derivatov fosfatidilholina: hidrofobno jedro močno modulira fizikalne lastnosti in učinkovitost dostave DNA. Biophys J 2006; 91: 3692e706.