Proti staranju in inhibicijski učinki tirozinaze butanoličnega izvlečka cvetov Cassia Fistula 1. del

Povzetek

Ozadje: Naravni izdelki iz rastlinskih virov so bili uporabljeni v različnih kozmetičnih aplikacijah kot vir prehrane in kot belilno sredstvo. Cvetovi Cassia fistula L, družine Fabaceae, so bili uporabljeni kot tradicionalno zdravilo za kožne bolezni in celjenje ran in so poročali, da imajo antioksidativne lastnosti. Raziskovali so učinek izvlečka cvetov C. fistule proti staranju na fibroblast človeške kože.

Glikozid cistanche lahko tudi poveča aktivnost SOD v srčnem in jetrnem tkivu ter znatno zmanjša vsebnost lipofuscina in MDA v vsakem tkivu, učinkovito lovi različne reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂ itd.) in ščiti pred povzročeno poškodbo DNK z OH-radikali. Cistanche feniletanoidni glikozidi imajo močno sposobnost lovljenja prostih radikalov, večjo redukcijsko sposobnost kot vitamin C, izboljšajo aktivnost SOD v suspenziji semenčic, zmanjšajo vsebnost MDA in imajo določen zaščitni učinek na delovanje membrane semenčic. Cistanche polisaharidi lahko povečajo aktivnost SOD in GSH-Px v eritrocitih in pljučnem tkivu eksperimentalno starajočih se miši, ki jih povzroča D-galaktoza, pa tudi zmanjšajo vsebnost MDA in kolagena v pljučih in plazmi ter povečajo vsebnost elastina. dober čistilni učinek na DPPH, podaljša čas hipoksije pri starajočih miših, izboljša aktivnost SOD v serumu in upočasni fiziološko degeneracijo pljuč pri eksperimentalno starajočih se miših. Pri celični morfološki degeneraciji so poskusi pokazali, da ima Cistanche dobro antioksidativno sposobnost in ima potencial, da postane zdravilo za preprečevanje in zdravljenje bolezni staranja kože. Hkrati ima ehinakozid v Cistanche pomembno sposobnost čiščenja prostih radikalov DPPH in lahko lovi reaktivne kisikove vrste, preprečuje razgradnjo kolagena, ki jo povzročijo prosti radikali, in ima tudi dober učinek popravljanja poškodb anionov prostih radikalov timina.

Kliknite na Prednosti Desert Cistanche

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Metode: Ekstrakcija cvetov C. fistula z butanolom je bila zaključena in aktivne spojine razvrščene. Citotoksičnost fibroblastov je bila ovrednotena s testom SRB, da bi izbrali netoksične odmerke za nadaljnje poskuse. Sintezo kolagena in hialuronske kisline (HA) smo nato izmerili z uporabo kolagenskega kompleta oziroma ELISA. Poleg tega je bila ovrednotena tudi aktivnost encimov, vključno s kolagenazo, matriksmeloproteinazo-2 (MMP-2) in tirozinazo.

Rezultati: Ugotovljeno je bilo, da izvleček cvetov ni vplival na rast kožnih fibroblastnih celic (IC50 > 200 ug/mL). Rezultati so pokazali, da je ekstrakt cvetov znatno povečal sintezo kolagena in HA na način, ki je odvisen od odmerka. Izvleček cvetov (50–200 ug/mL) je prav tako znatno zaviral aktivnost kolagenaze in MMP-2. Poleg tega lahko ta cvetni izvleček zavira aktivnost tirozinaze, ki povzroča hiperpigmentacijo, ki povzroča staranje kože.

Sklepi: Izvleček cvetov C. fistule je pokazal preventivni učinek pri uporabi v namene proti staranju v fibroblastih človeške kože in je lahko primerna izbira za kozmetične izdelke, katerih namen je zagotoviti belilne učinke in so označeni kot izdelki za nego kože obraza proti staranju. .

Ključne besede: kolagenaza, sinteza kolagena, glikozaminoglikan, hialuronska kislina, matrična metaloproteinaza

Ozadje

Staranje kože je zapleteno biokemično napredovanje, ki je posledica mnogih posameznih intrinzičnih in ekstrinzičnih dejavnikov, kot so starost, hormoni in izpostavljenost UV-svetlobi [1]. Napredovanje se pojavi v epidermalni in dermalni plasti in je v glavnem povezano z razgradnjo zunajceličnega matriksa (ECM) [2]. Encimi, ki sodelujejo pri razgradnji ECM, so matrične metaloproteinaze (MMP), kot sta želatinaza (MMP-2) in kolagenaza [3]. Koža izgubi svojo natezno trdnost zaradi učinka razgradnje ECM z MMP. V tem procesu pride do gubanja kože, izrazito pa se pojavita tudi hrapavost in suhost skupaj z nekaterimi pigmentnimi nepravilnostmi, kot sta hipo- ali hiperpigmentacija [2, 4]. Za zdravljenje hiperpigmentacije so raziskovali zaviralce tirozinaze. Tirozinaza je encim, ki omejuje hitrost in pretvori tirozin v melanin [5]. Inhibitorji tirozina tako igrajo pomembno vlogo kot sredstva za posvetlitev kože [6], medtem ko sinteza hialuronske kisline (HA) uravnava hidracijo kože in nastanek gub. HA, nesulfatiran glikozaminoglikan (GAG), je sestavljen iz ponavljajočih se enot disaharidov, vključno z D-glukuronsko kislino in N-acetil-Dglukozaminom [7]. HA uravnava tudi obnovo tkiv, vključno z izboljšanjem odziva imunskega sistema z aktivacijo vnetnih celic in kot odziv na poškodbo fibroblastov [8–10].

Naravni izdelki iz rastlinskih virov, kot sta Glycyrrhiza glabra [11] ali zeleni čaj [12], so bili uporabljeni v kozmetičnih aplikacijah kot vir prehrane in kot belilno sredstvo. Veliko dokazov je pokazalo na koristne učinke oralno ali lokalno danih fitokemikalij iz rastlinskih izvlečkov, zlasti pri izboljšanju stanja kože. Nekateri primeri koristnih učinkov so, da je mogoče zmanjšati staranje kože in vnetje kože. C. fistula (zlati tuš), družina Fabaceae, najdemo v številnih azijskih državah, kot so Tajska, Kitajska, Mjanmar in Indija. V prejšnjih študijah je bilo ugotovljeno, da ima ekstrakt cvetov C. fistule antioksidativne, antikancerogene, antibakterijske, protiglivične in antidiabetične lastnosti [13, 14]. Znano je, da učinek C. fistule v ajurvedski medicini sodeluje pri zdravljenju različnih motenj, vključno s kožnimi boleznimi, gobavostjo, hematemezo, pruritusom in sladkorno boleznijo [15, 16]. Različni deli C. fistule so pokazali farmakološke lastnosti [17]. Cvetovi, semena, sadje in pulpa so bili uporabljeni za zdravljenje kožnih bolezni, vključno z gobavostjo [18]. Meso je znano po svojih antidiabetičnih lastnostih [15] in se uporablja v toniku, ki se uporablja pri zdravljenju protina in revmatizma [19]. Listi in zreli stroki so se tradicionalno uporabljali kot odvajalo [20, 21]. Poročali so tudi, da so fenolne in flavonoidne fitokemikalije C. fistula uporabne pri zdravljenju kožnih bolezni [14]. Zato nas v tej študiji zanima vloga izvlečka cvetov C. fistule v kozmetičnih aplikacijah. Proučeni so bili preventivni učinki razgradnje ECM skupaj z encimi staranja kože, ki vključujejo aktivnosti kolagenaze in MMP-2 ter tirozinaze. Poleg tega je bila določena sinteza kolagena in HA.

Metode

Kemikalije in reagenti

Dulbeccov modificirani Eagle Medium (DMEM), DQ želatina in penicilin-streptomicin so bili dobavljeni iz Gibca (Grand Island, NY, ZDA). Fetalni goveji serum (FBS) je dobavil Thermo Scientific (ZDA). Sirius Red/Fast Green Collagen Staining Kit je bil kupljen pri Chondrex, Inc. (Redmond, WA, ZDA). Sulforhodamin B reagent, hialuronska kislina in gobja tirozinaza so bili pridobljeni pri Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA).

Rastlinski materiali

Cvetovi C. fistule so bili pridobljeni iz Lampang Herb Conservation, provinca Lampang, Tajska. Številko vzorca vavčerja (023197) je potrdila Wannaree Charoensup, botaničarka v herbariju Flore Tajske, Fakulteta za farmacijo, Univerza Chiang Mai, Tajska.

Priprava izvlečka cvetov kasije

Cvetove C. fistule smo posušili v zračnem prostoru in nato 500 g posušenih cvetov drobno zmleli v prah. Po tem smo prašek namočili v 50-odstotnem etanolu in nato 24 ur stresali pri 70 obratih na minuto. Po 24 urah smo vzorce nato filtrirali skozi filtrirni papir, da smo ločili ostanek. Ostanek smo namočili v 50-odstotnem etanolu in stresali pri 70 obratih na minuto 24 ur in ta korak ponovili 2-krat. Filtrirane vzorce smo združili in uparili z rotacijskim vakuumskim uparjalnikom (BUCHI, Švica), da smo dobili vodne frakcije. Vodni frakciji smo dodali heksan v razmerju heksana 2:1. Vzorce smo pretresli in pustili ločevati 30 minut. Vzorce smo ločili v dve frakciji, in sicer heksansko in vodno frakcijo. Nato smo zbrali vodno frakcijo in dodali 10 odstotkov oglja za 30 minut z blagim mešanjem pri sobni temperaturi. Vzorce smo filtrirali skozi filtrirni papir in celit, da smo ločili oglje. Vzorce smo zmešali z nasičenim butanolom v razmerju nasičenega butanola 2:1 in pustili, da so se vzorci ločili v obdobju 12 ur, ta korak pa smo ponovili 3-krat. Vzorce smo ločili v dve frakciji, ki sta vsebovali vodno in butanolno frakcijo. Frakcijam butanola smo nadalje dodali vodo do enakega volumna in pustili, da so te frakcije izparele z uporabo rotacijskega vakuumskega uparjalnika. Uparjene vzorce smo liofilizirali, da smo dobili prašek cvetnega ekstrakta C. fistule.

Kvantifikacija skupne vsebnosti fenolov v izvlečku cvetov C. fistula z UV-vidnim spektrofotometrom

Celotno vsebnost fenolov v izvlečku cvetov C. fistula je bila določena s Folin-Ciocalteu testom. Na kratko, 0.4 mL izvlečka cvetov C. fistule smo zmešali z 0.3 mL 10-odstotnega Folin-Ciocalteaujevega reagenta in inkubirali v temi pri sobni temperaturi 3 minute . Nato smo dodali 0.3 ml raztopine natrijevega karbonata in raztopino nadalje inkubirali v temi pri sobni temperaturi 30 minut. Absorbanco smo ovrednotili pri 765 nm z UV-vidnim spektrofotometrom. Koncentracija skupne vsebnosti fenolov je bila izračunana in primerjana s standardno krivuljo za galno kislino (GA) pri 0–20 ug/mL. Skupna vsebnost fenolov je bila navedena kot miligrami GA ekvivalentov na gram C. fistula. izvleček cvetov (mg GAE/g izvlečka).

Kvantifikacija fenolnih spojin v ekstraktu cvetov C. fistule z analizo HPLC

Različne vrste fenolnih spojin v izvlečkih cvetov C. fistula so analizirali z analizo HPLC in jih nato primerjali s standardno galno kislino, katehini, protokatehuinsko kislino, vanilijevo kislino, klorogensko kislino, ferulinsko kislino in kumarično kislino. Cvetne izvlečke smo raztopili v 50 odstotnem etanolu in nadalje ocenili s HPLC (Agilent Technologies, CA, ZDA) z uporabo kolone C18 z reverzno fazo (WATER, MA, ZDA). Mobilna faza je bila sestavljena iz metanola (A) in 0.1 odstotkov trifluoroocetne kisline (TFA) v vodi (B) z gradientnimi pogoji. Hitrost pretoka je bila nastavljena na 1,0 ml/min, valovna dolžina detekcije pa je bila zabeležena pri 280 z UV detektorjem. Ravni koncentracije fenolnih spojin so bile izračunane in primerjane s standardno krivuljo ob upoštevanju standardnih koncentracij in površin vrhov (mg/g ekstrakta).

Kvantifikacija celotne vsebnosti flavonoidov v ekstraktu cvetov C. fistule z uporabo kolorimetričnega testa

Skupna vsebnost flavonoidov je bila določena z modificiranim kolorimetričnim testom z aluminijevim kloridom (AlCl3), kot je bilo opisano prej [22]. Na kratko, 0.25 mL cvetnega ekstrakta smo zmešali z 0.125 mL 5-odstotnega natrijevega nitrita (NaNO2) in raztopino inkubirali 5 minut pri sobni temperaturi. Nato smo v zmes vmešali 0.125 ml 10-odstotnega AlCl3 in jo 5 minut hranili v temi. Nato smo dodali 1 ml natrijevega hidroksida (NaOH) in raztopino inkubirali 15 minut pri sobni temperaturi v temi. Absorbanco smo izmerili pri 510 nm z UV-vidnim spektrofotometrom. Celotna vsebnost flavonoidov je bila izračunana in primerjana s standardnimi vrednostmi katehinov ter izražena kot mg ekvivalenta katehina na gram ekstrakta (mg CE/g ekstrakta).

Celične kulture

Primarni fibroblasti človeške kože so bili aseptično izolirani iz trebušne brazgotine po kirurškem posegu, ki je vključeval porod s carskim rezom na kirurškem oddelku bolnišnice CM Maharaj, univerze Chiang Mai (Chiang Mai, Tajska) (oznaka študije: BIO-2558-03549, ki jo je odobril Medical Odbor za raziskovalno etiko, Univerza Chiang Mai). Iz začetnega materiala smo odstranili maščobo in ga namočili v DMEM, ki vsebuje antipenicilin in streptomicin. Po tem je bila koža potopljena v DMEM, ki vsebuje 1 odstotek proteaze (Dispase, Gibco, Grand Island, NY, ZDA) za 48 ur pri 4 stopinjah. Epidermalne plasti smo odstranili in normalne fibroblaste izolirali iz dermisa. Fibroblaste smo gojili v DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki FBS, 2 mM L-glutamina, 50 U/mL penicilina in 50 ug/mL streptomicina. Celice smo vzdrževali v 5-odstotnem CO2 navlaženem inkubatorju pri 37 stopinjah.

Test viabilnosti celic

Test viabilnosti celic ekstrakta cvetov C. fistule proti celicam kožnih fibroblastov je bil izmerjen s testom sulfohodamina B (SRB), kot je bilo opisano prej [23]. Na kratko, celice (8x103 celic/jamico) smo zasejali v 96-ploščo z jamicami in inkubirali pri 37 stopinjah, 5 odstotkih CO2 24 ur. Po tem smo celice 48 ur obdelali z ali brez različnih koncentracij (0–200 ug/mL) izvlečka cvetov C. fistule. Po 48 urah smo celicam dodali 10 odstotkov (m/v) trikloroocetne kisline (TCA) in celice nato 1 uro inkubirali pri 4 stopinjah. Medij smo odstranili in celice splaknili s počasi tekočo vodo iz pipe. V vsako vdolbino smo dodali 0,057-odstotno (m/v) raztopino SRB (100 μL) in celice inkubirali 30 minut pri sobni temperaturi. Raztopino SRB smo odstranili in nato celice 4-krat sprali z 1 odstotkom (v/v) ocetne kisline in jih pustili, da se posušijo pri sobni temperaturi. Barvilo smo raztopili z 10 mM raztopino Tris baze (pH 10,5) in izmerili absorbanco pri 510 nm z uporabo bralnika mikroplošč.

Test sinteze kolagena

Skupni intracelularni kolagen v celicah fibroblastov je bil določen s kompletom za barvanje kolagena Sirius Red/Fast Green (Chondrex, Inc, Redmond, WA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko, kožne fibroblastne celice so bile posejane v plošče s 24 vdolbinicami za 24 ur pri 37 stopinjah, 5 odstotkih CO2. Po tem smo celice predhodno obdelali z medijem DMEM brez seruma 24 ur. Medij smo odstranili in celice nato inkubirali z ali brez cvetnega ekstrakta C. fistule (0-150 ug/mL) 48 ur. Po 48 urah smo gojišče odstranili. Nato smo celice sprali s PBS in fiksirali s fiksativom Kahle 10 minut. Fiksativ smo odstranili in celice sprali s PBS. V vsako vdolbinico smo dodali barvilo Sirius Red/Fast Green in vzorce inkubirali 30 minut pri sobni temperaturi. Barvilo smo odstranili in celice štirikrat sprali z DI vodo ali dokler tekočina ni postala brezbarvna. Nazadnje smo dodali ekstrakcijski pufer in izmerili absorbanco pri 540 nm in 605 nm z UV-vidnim spektrofotometrom.

Test aktivnosti kolagenaze

Aktivnost kolagenaze je bila izmerjena z uporabo modificiranega fluorogenega DQ™-želatinskega testa, kot je bilo že opisano [24]. Na kratko, različne koncentracije izvlečka cvetov C. fistule (0–200 ug/mL) smo dodali v plošče s 96 jamicami. V vsako vdolbino smo dodali eno U/ml kolagenaze (100 μL/vdolbino). Po tem smo dodali 15 ug/mL želatine (DQ želatina) in mešanice inkubirali 10 minut. Hitrost proteolize je bila določena z merjenjem absorbance v 2-minutnih intervalih 20 minut z uporabo bralnika mikroplošč pri valovni dolžini vzbujanja 485 nm in valovni dolžini emisije 528 nm. Aktivnost encima je bila ocenjena s preučevanjem naklona linearne regresije med časom in absorbanco v obdobju 2-6 min.

Test aktivnosti MMP-2

Aktivnost MMP{{0}} je bila določena z želatinsko zimografijo, kot je bilo prej opisano [25]. Celice fibroblastov smo gojili v mediju brez seruma DMEM 24 ur. Po tem smo zbrali supernatant kulture. Supernatant kulture smo izpostavili 10 odstotnim poliakrilamidnim gelom, ki so vsebovali 0.1 odstotka m/v želatine v nereducirnih pogojih. Gele smo dvakrat izpirali z 2,5 odstotki v/v Tritona X-100 30 minut pri sobni temperaturi, da smo odstranili SDS. Ploščo gela smo razrezali na rezine, ki so ustrezale stezam, nato pa rezine dali v različne rezervoarje in inkubirali z aktivacijskim pufrom (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4), ki je vseboval različne koncentracije C ekstrakt cvetov fistule (0–200 ug/mL) pri 37 stopinjah 18 ur. Po tem je bil trak gelov opran in obarvan s Coomassie Brillant Blue R (0,1 odstotka m/v) in nato razbarvan v 30 odstotkih metanola in 10 odstotkih ocetne kisline. Aktivnost MMP-2 se je prikazala kot jasen pas na modrem ozadju. Digestivni trakovi so bili kvantificirani s programom Image J.

Test sinteze hialuronske kisline (HA) z ELISA

Učinek izvlečka cvetov C. fistule na sintezo HA je bil določen z uporabo kompleta ELISA, kot je opisano prej [26]. Celice fibroblastov (50 × 104 celic/vdolbinico) so bile zasejane v 24-plošče z vdolbinicami za 24 ur pri 37 stopinjah, 5 odstotkih CO2. Celice so bile predhodno obdelane v mediju brez seruma 6 ur in nato obdelane z ali brez različnih koncentracij cvetnega ekstrakta C. fistule (0–200 ug/mL) 48 ur. Gojilo smo zbrali in sintezo HA izmerili z ELISA. Absorbanco smo izmerili pri 450 in 570 nm z uporabo bralnika mikroplošč. Koncentracijo HA v gojenem supernatantu, pridobljenem iz obdelanih celic fibroblastov, smo izračunali in primerjali s standardno krivuljo HA.

Test inhibicije tirozinaze

Test inhibicije tirozinaze je bil določen, kot je opisano prej [27]. V 96-ploščo z vdolbinicami smo dodali različne koncentracije ekstrakta cvetov C. fistule. Reakcija je bila izvedena v natrijevem pufru (pH 6,4), ki je vseboval 100 U/mL gobje tirozinaze. Reakcijski zmesi smo dodali substrat L-DOPA (1 mM) in jo nato inkubirali 10 minut pri sobni temperaturi. Spremembo absorbance pri 490 nm smo merili vsakih 1,5 min 15 min z uporabo bralnika mikroplošč. Odstotek inhibicije tirozinaze je bil izračunan po naslednji formuli:

Test antioksidativne aktivnosti

Antioksidativno aktivnost izvlečka cvetov C. fistule so določili z aktivnostjo prostih radikalov 1, 1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), kot je opisano prej [28]. Različne koncentracije cvetnega izvlečka (0–100 ug/mL) smo pripravili v metanolu. 1 mL 0,002 odstotka DPPH dodamo 1 mL raztopine cvetnega izvlečka in zmes pustimo 30 minut v temi. Absorbanco smo izmerili pri 517 nm s spektrofotometrom. Odstotek inhibicije je bil izračunan in primerjan s standardnim vitaminom E (1–100 ug/mL) po naslednji formuli:

Antioksidativno delovanje cvetnih izvlečkov C. fistule je bilo potrjeno s testom ABTS, kot je bilo opisano prej [29]. Kationski radikal ABTS [2, 2'- azino-bis (etilbenztiazolin-6-sulfonska kislina)] smo pripravili z mešanjem 7 mM osnovne raztopine ABTS z 2,45 mM kalijevega persulfata (K2S2O8) (1/1, v/v). Zmes smo inkubirali v temi 12–16 ur, dokler reakcija ni bila končana. Test smo izvedli na 990 μL raztopine ABTS in 10 μL cvetnega izvlečka (0–4 ug/mL). Po 6 minutah smo takoj zabeležili absorbanco pri 734 nm s spektrofotometrom. Odstotek inhibicije aktivnosti ABTS cvetnega izvlečka je bil izračunan z uporabo naslednje enačbe:

Statistična analiza

Vsi podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti ± standardni odklon (SD). Statistično analizo smo analizirali s programsko opremo Prism različice 6.0 z uporabo enosmerne ANOVA z Dunnettovim testom. Statistična značilnost je bila določena pri * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0,001 ali **** p < 0,0001.

Rezultati

Fitokemična karakterizacija izvlečka cvetov C. fistule

Po koraku, ki je vključeval liofilizacijo vzorcev, je bil izvleček cvetov C. fistule stehtan in nadalje izpostavljen fitokemičnim in biološkim študijam. 18.08 g izvlečka cvetov C. fistula je bilo pridobljenih iz 500 g surovine in odstotek izkoristka izvlečka cvetov je bil 3,62. HPLC prstni odtis cvetnih izvlečkov C. fistule je bil določen s HPLC analizo (slika 1). Profil HPLC, ki je pokazal vrh fenolnih spojin, je bil označen glede na posamezne komponente pri vsakem retenzijskem času. Karakterizacija fenolnih spojin izvlečka cvetov C. fistula je prikazana v tabeli 1. Celotna vsebnost fenolov v izvlečku cvetov je bila 275,32 ± 14,21 mg GAE/g ekstrakta. Ugotovljeno je bilo, da so derivati ​​hidroksibenzojske kisline, vključno z vanilijevo kislino in protokatehuinsko kislino, {{20}}.95 ± 0.09 in 2.56 ± 0. 42 mg/g ekstrakta, medtem ko je bila galna kislina zabeležena pri {{30}}.60 ± 0.02 mg/g ekstrakta. Derivati ​​hidroksicimetne kisline, vključno s kumarno kislino, ferulinsko kislino in klorogensko kislino, so bili odkriti pri 0,39 ± 0,08, 0,80 ± 0,09 oziroma 0,83 ± 0,03 mg/g ekstrakta. Vsebnost flavonoidov je bila 27,62 ± 3,56 mg CE/g ekstrakta. Katehin, kot derivat flavonola, je bil izmerjen pri 1,10 ± 0.00 mg/g ekstrakta.

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】