Učinek urolitina A proti staranju na goveje jajčne celice in vitro 2

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

2.8. Statistična analiza

Podatki iz proizvodnje zarodkov in sej kakovosti so bili analizirani z uporabo Proc Glimmix iz SAS (Statistical Analysis Systems, SAS Inst., Inc., Cary, NC, ZDA), z uporabo binarne porazdelitve in logit kot povezovalnih funkcij. Splošni linearni mešani model je vključeval zdravljenje (odmerki UA, učinek staranja in starost ženske ter njuno medsebojno delovanje) kot fiksni učinek in ponovitve kot naključni učinek. Poleg tega so bile izračunane srednje vrednosti za vsako zdravljenje in opravljene primerjave med skupinami s testom PDIFF. Podatki JC-1, ravni transkripta mRNA in število kopij mt-DNA so bili analizirani z uporabo Proc Mixed of SAS z modelom, ki vključuje zdravljenje (učinek UA, učinek staranja in/ali starost ženske ter njuna interakcija) kot fiksni učinek. Seja je veljala za naključen učinek. Podatke o kromosomskih konfiguracijah smo primerjali med skupinami z uporabo natančnega Fisherjevega testa v kontingenčni tabeli 2 x 2. Analiza rezultatov je veljala za statistično značilno, ko je p<>

Za več informacij kliknite tukaj

3. Rezultati

3.1. Prejšnji test – študija odziva na odmerek

Stanje zorenja jajčnih celic, opaženo med študijo odziva na odmerek UA, dopolnjenega z medijem za zorenje, je predstavljeno na sliki 1. Ta dodatek je pomembno vplival na stopnje zorenja jedra jajčnih celic. Skupina 50 UA (38,9±0,5 odstotkov) je pokazala višjo stopnjo oocitov v statusu faze AI/TI v primerjavi s kontrolo (10,8±{{ 15}}.5 odstotkov ,P=0.03)in 10 UA(0.0±0.{{ 45}} odstotkov ,p=0.0006) skupin. V tej fazi je bila višja stopnja v skupini 25 UA (17,2±0,5 odstotka ,p=0.05) v primerjavi z identificirana je bila tudi skupina 10 UA. Poleg tega je bil ugotovljen trend med skupino 50 UA in 1 UA (14,3±2,0 odstotka, p=0.08). Najvišji odmerek je prav tako pokazal škodljiv učinek, saj je zmanjšal število jajčnih celic, razvrščenih v metafazo-II. (MII) stopnja (50 UA, 44,4 ±2,0 odstotka) v primerjavi s kontrolo (86.5±7,0 odstotka, p=0.003), 1 UA (82,1±2,5 odstotka, p{{ 53}}.01), 10 UA (89,3 ± 6,5 odstotka, p =0.002) in 25 UA (82,8 ± 9,0 odstotka, p =0.01) skupin. Med preostalimi niso opazili razlik faze zorenja jajčnih celic. Fazi zorenja GV in CCl na sliki 1 nista bili prikazani, ker v teh kategorijah niso bile ocenjene nobene jajčne celice.

Preskus odziva na odmerek ni pokazal pomembnega vpliva koncentracij UA na cepitev in stopnje izvaljenih zarodkov. Vendar pa so na stopnjo zarodkov, proizvedenih 7. dan, vplivale različne koncentracije UA. Skupina 50 UA (7,2±2,7 odstotka) je imela nižje stopnje zarodkov na dan 7 v primerjavi z 1 UA (28,5±4,8 odstotka, p=0.004), 10 UA (20,4±4,0 odstotka) , p=0.03) in 25 UA(18,5±4,7 odstotka ,p=0.05) skupin. Čeprav med kontrolno in 50 skupinami UA niso bile ugotovljene pomembne razlike, je bil ugotovljen trend (p=0.06). Poleg tega so stopnje zarodkov 7. dan (p =0.07) običajno višje po dodatku 1 odmerka UA v primerjavi s kontrolo. Poleg tega je skupina z 1 UA podvojila število odlične/dobre kakovosti zarodkov (68,9 odstotka zarodkov stopnje 1, n=20) v primerjavi s kontrolo (34,6 odstotka, n=10) in 10 UA (26,8 % ,n=10). Majhno število zarodkov stopnje 1 je bilo pridobljeno z višjimi odmerki: skupina 25UA (15,4 odstotka ,n=4) in 50UA (35,4 odstotka ,n=3). Na podlagi zgoraj omenjenih rezultatov je bil 1 uM UA izbran za nadaljevanje naslednjih študij.

3.2.Poskus 1——Kakovost jajčnih celic in razvojni potencial starih in fiziološko zrelih jajčnih celic

3.2.1.Jedrno zorenje

Raziskali smo učinek dodatka UA na status kromosomskega zorenja starih in fiziološko zrelih jajčnih celic, zbranih pri predpubertetnih in odraslih ženskah. Neodvisno od učinka UA sta staranje jajčnih celic in starost samic povzročila pomemben škodljiv učinek na zorenje. V kontrolnih jajčnih celicah so bile ugotovljene višje stopnje faze MII v primerjavi s starimi (22h=93.2±5,4 odstotka v primerjavi s 30h=77.6±4,1 odstotka, p {{11 }}.02). Poleg tega je bila ugotovljena zamuda pri napredovanju zorenja pri starih gametah in samicah v predpuberteti z več oociti v fazi AI/TI (22h=3.4±0.5 odstotkov v primerjavi s 30h =17.9±0.6 odstotkov, p=0.01 in pred puberteto=21.1±1,1 odstotka v primerjavi z odraslimi=6.8±0,7 odstotka p =0.03). Poleg tega je bilo ugotovljeno večje število degeneriranih jajčnih celic po 30 urah IVM v primerjavi s po 22 urah (7,1 ±1,39 odstotka v primerjavi s 4,1 ±0,89 odstotka, p =0.02) . Starost ženske in dodatek UA nista vplivala (p 0,05) na število degeneriranih jajčnih celic.

Tako staranje in vitro kot dodatek UA v medij za zorenje sta pomembno vplivala na kromosomsko konfiguracijo jajčnih celic pri predpubertetnih in odraslih ženskah (p<0.05, figure="" 2).="" on="" the="" al/ti="" phase="" of="" the="" maturation="" status,="" higher="" rates="" of="" oocytes="" were="" found="" in="" this="" stage="" in="" the="" control="" aged="" 30="" h="" prepubertal="" group="" (46.7±0.5%)="" when="" compared="" to="" control="" prepubertal="" (0.0±0.0%,p="0.05)" and="" ua="" aged="" 30h="" prepubertal="" (0.0="" ±0.0%,p="0.02),and" both="" adult="" control="" (5.6±0.5%,p="0.01" and="" ua="" adult,0.0±0.0%,="" p="0.0002)and" control="" aged="" 30h="" adult="" (9.1±10%,p="0.02)groups." a="" trend="" was="" also="" identified="" between="" ua="" adults="" and="" ua="" aged="" 30="" h="" adult="" (p="">

Kar zadeva fazo MII, ki ustreza popolnemu zorenju jedra, so bile ugotovljene tudi pomembne razlike med skupinami (slika 2). Nižje stopnje oocitov na stopnji MII so bile ugotovljene pri kontrolni skupini, stari 30 h pred puberteto (53,3±2.0 odstotka ) v primerjavi s kontrolno skupino pred puberteto (10{{2{ {27}}}.0±1,5 odstotka, p=0.05), UA v starosti 30 ur pred puberteto (100,0±2,5 odstotka, p=0.02) in UA odrasli (100,0) ±10,5 odstotka, p=0.0002) in kontrolna skupina, stara 30 let, je imela skupine odraslih (86.0±5,5 odstotka p =0.056). Poleg tega je skupina odraslih z UA pokazala višje stopnje zrelih jajčnih celic (MII) v primerjavi z UA, starimi 30 ur odraslih (76,2±11,3 odstotka, p=0.01), kontrolna skupina, stara 30 ur odraslih (86). 0±5,5 odstotka, p=0.08) in kontrolna odrasla oseba (83,3±4,5 odstotka, p=0.057).

Med preostalimi stopnjami zorenja oocitov niso opazili razlik.flavonoidi,Če povzamemo, je dodajanje UA izboljšalo napredovanje zorenja in vitro v jajčnih celicah, ki so bile podvržene procesu staranja, zlasti pri predpubertetnih ženskah. Tako je bil ugotovljen pomemben učinek UA proti staranju.

3.2.2. Potencial mitohondrijske membrane

Da bi analizirali vpletenost mitohondrijske disfunkcije v ženske stare jajčne celice in učinek UA in starosti matere, je bil ocenjen potencial mitohondrijske membrane (MMP) v jajčnih celicah različnih skupin.

Cistanche lahko upočasni staranje

Neodvisno od starosti samice in učinkov UA je imelo staranje oocitov pomemben škodljiv učinek na MMP, ocenjen kot razmerje med izmerjeno rdečo in zeleno fluorescenco (22-urno razmerje =0.54±1,8 odstotka proti 30hratio{{6} },47±1,5 odstotka, p=0,002).

Kombinacija starosti samice, učinka staranja in dodajanja UA med zorenjem je pomembno vplivala na MMP (p{{0}}.{{10}}07). (Slika 3). Kot je prikazano na sliki 3, so bile višje stopnje MMP dosežene v skupinah UA pred puberteto (razmerje=0.55±0.04) in UA odraslih (razmerje=0.63±0.04), kjer so jajčne celice zorele 22 ur v primerjavi s kontrolno skupino, staro 30 ur, odrasli (razmerje=0.45±0,04,p=0.04 oziroma p=0.0007) in UA, staro 30 ur, odrasli (razmerje{ {23}}.45±0.03,p=0.03 in p=0.0003, oziroma) skupine.uporaba hesperidinaPoleg tega so v skupini odraslih UA opazili znatno povečanje razmerja JC{{0}} agregat/monomeri, kar kaže na znatno povečanje MMP, v primerjavi s kontrolnim odraslim (razmerje =0).47 ±0.04,p =0.0031),kontrolna predpuberteta(razmerje=0.52±0,04, p=0. 03), kontrola, stara 30 ur odrasla oseba (razmerje=0.48±0,03, p=0.003) in UA, stara 30 ur odrasla oseba (razmerje=0.47±0,03, p{{25 }}.001)skupinah. Trend je bil ugotovljen tudi med UA pred puberteto in UA v starosti 30 ur pred puberteto (p=0.07).

Če povzamemo, je UA izboljšal MMP med fiziološkim zorenjem, vendar ni bil sposoben premagati negativnega učinka staranja tako v predpubertetnih kot odraslih jajčnih celicah.

3.2.3. Embrionalni razvoj

Embrionalni razvojni potencial je bil ovrednoten s stopnjami cepitve, D7 in izvaljenih zarodkov, pridobljenimi z različnimi zdravljenji (staranje in dodajanje UA), uporabljenimi za COC pred puberteto in odrasle samice med zorenjem. Neodvisno od starosti samice in učinkov UA je imelo staranje oocitov pomemben škodljiv učinek na cepitev (22h=79.5±1,7 odstotka v primerjavi s 30h=68.6±2,0 odstotka, p=0.0001) in D7 stopnje zarodkov (22h=18.6±1,9 odstotka

v primerjavi s 30h=12.1±1,7 odstotka ,p=0.01). Pokazalo se je tudi, da dodatek UA izboljša stopnje zarodkov D7 (kontrola{ {8}}.1±1,5 odstotka v primerjavi z UA=20.0±2,0 odstotka, p=0.0009).

Kombinacija starosti samice, učinka staranja in dodatka UA med zorenjem je pomembno (p {{0}}.{{30}}1) vplivala na razvoj zarodka, in sicer na cepitev in Stopnje zarodkov D7 (tabela 2). Višje stopnje cepitve so bile dosežene, ko so odrasle jajčne celice zorele 22 ur z ali brez dodatka UA (kontrolna odrasla oseba=1.4±3,2 odstotka in odrasla oseba UA=80). 9±3,4 odstotka ) in predpubertetni oociti so zoreli 22 ur z dodatkom UA (UA pred puberteto=80.6±3,2 odstotka ), v primerjavi z UA pri 30odraslih (66,5±4,2 odstotka, p Manj kot ali enako 0,01), kontrolni skupini, stari 30 ur pred puberteto (66,9 ± 3,9 odstotka, p manj kot ali enako 0,02) in UA, stari 30 ur pred puberteto (67,2 ± 4,0 odstotka, p manj kot ali enako 0,01) (tabela 2). Trend (p=0.09) je bil ugotovljen tudi med kontrolnimi odraslimi in kontrolnimi skupinami odraslih, starih 30 ur.

Another parameter that was significantly (p=0.01) influenced by the combination of the female age, the supplementation with UA, and COCs aging was the rate of embryos produced at day 7(Table 2). Exceptions were made for the UA prepubertal and UA 30 h prepubertal groups, the UA adult group presented the highest rates of the embryo at day7 (26.8±4.3%,p≤0.05). Moreover, lower D7 embryo rates were produced from aged oocytes from both adult and prepubertal females without the supplementation of UA (control aged 30hprepubertal=7.7±2.6% and control aged 30h adult=7.7±2.6%)compared to those that were supplemented with UA, respectively (UA aged 30 h prepubertal=18.9±4.0%,p=0.03 and UA aged 30 h adult=15.9±4.0%,p=0.09). The supplementation of UA to the maturation medium did not significantly (p>0.05) vplivalo na stopnje kakovosti proizvedenih zarodkov stopnje 1, 2 in 3, niti učinek staranja ali vsi proučevani učinki skupaj (tabela 3). Vendar pa se je število zarodkov odlične/dobre kakovosti, ki so nastali, ko so bili UA dopolnjeni z jajčnimi celicami, dozorelimi 22 ur, podvojilo (tabela 3).

3.3 Poskus 2

3.3.1. Ravni izražanja genov

Da bi preučili učinek UA in vpliv materine starosti na signalno pot Nrf2, je bila analiza ravni ekspresije genov NFE2L2 in NQO1 v kulturi GC predpubertetnih in odraslih krav ocenjena z RT-qPCR. Neodvisno od drugih proučevanih dejavnikov je starost žensk pomembno vplivala na ekspresijo gena NFE2L2, kar se odraža v višji ravni transkriptov NFE2L2 v GC predpubertetnih žensk (ravni mRNA pred puberteto=0.00015 ±0,0012 odstotka v primerjavi z odraslim=0.00011±0.0012,p=0.048).

The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly(p>0.05) vplivajo na ravni genske ekspresije genov NFE2L2, NQOl in mt-ND5. Slika 4 predstavlja ravni ekspresije teh genov, ki so bile normalizirane z ustrezno kontrolo, tako v predpubertetnih kot v odraslih GC, zdravljenih z UA.

3.3.2.mt-DNK številka kopije

Analysis of mt-ND5 DNA content in GC culture from prepubertal and adult cows was assessed by qPCR. The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly (p>0.05) vplivajo na število kopij gena mt-ND5.izgubljeno cesarstvo cistancheSlika 5 predstavlja število kopij tega gena, normalizirano z ustreznimi kontrolami, v predpubertetnih in odraslih GC, zdravljenih z UA.

4. Razprava

V zadnjih desetletjih so opazili naraščajoče povpraševanje po uporabi ART pri živini [8,46,47]. Poleg tega je zapoznelo rojstvo otroka, povezano z visoko starostjo matere, postalo glavni dejavnik, zaradi katerega se ženske zatekajo k ART [5]. Kakovost jajčnih celic je ključnega pomena za uspešno spočetje, staranje ženske gamete pa je glavna skrb za uspeh ART. Kljub vse večjemu napredku na tem področju uporabljene tehnologije še ne morejo obnoviti plodnosti in biološke ure obrniti nazaj [7]. V pričujočem delu je bil razvit model za preučevanje s starostjo povezane neplodnosti v jajčnih celicah goveda. Zaradi podobnosti s človeško nosečnostjo, folikularnimi in endokrinimi dogodki [48, 49] je ta model lahko koristen tudi za raziskave na ljudeh, pri čemer se je treba izogniti etičnim in fizičnim omejitvam, ki ovirajo te študije na človeških jajčnih celicah. Naš model za staranje ženskih spolnih celic se je izkazal za zelo učinkovitega in primernega za proučevanje različnih problemov, povezanih z reproduktivnim staranjem in poslabšanjem plodnosti, ki je trenutno eden najbolj kritičnih izzivov na svetu. Poleg tega je iskanje novih prihajajočih antioksidativnih terapij s potencialom za preprečevanje neplodnosti, ki jo povzroča staranje ženskih spolnih celic, kot je raziskano v tem delu, prav tako izjemnega pomena.

Predstavljeni rezultati so prvič poročali o koristnem učinku UA na rezultate ART. UA je živilski metabolit, ki lahko prepreči kopičenje s starostjo povezanih disfunkcionalnih mitohondrijev z induciranjem njihove mitofagije in podaljšanjem življenjske dobe celic [28]. Ker UA še nikoli ni bil testiran pri razmnoževanju goveda, so bili uporabljeni odmerki, ki so bili uspešno uporabljeni v različnih celičnih linijah in so pokazali njegove učinke proti raku, vnetjem in staranju [28, 35, 39]. V naši študiji je prejšnji odmerek- Opravljen je bil test odziva in koncentracija 1 uM UA je bila jasno opredeljena kot najbolj obetavna. Poleg tega je bil škodljiv učinek dokazan pri višjih odmerkih, zlasti pri odmerku 50 uM UA, kar je škodovalo napredovanju zorenja jedra do MII. Ta učinek se je odražal v motnjah v razvoju zarodka. V skladu s tem so Liu in sodelavci (2019) opazili znatno zmanjšano viabilnost celic in proliferacijo človeških starajočih se kožnih fibroblastov pri koncentraciji UA 50 uM. Omenili so, da visoki odmerki UA vodijo do zmanjšane viabilnosti celic, kar povečuje število celic, aretiranih v G/M celičnem ciklu [35]. Nasprotno, višje stopnje zarodkov so nastale 7. dan po dodatku 1 uM UA v medij za zorenje v primerjavi z drugimi odmerki. Za nadaljnje raziskovanje možnih mehanizmov delovanja UA pri reprodukciji žensk je bila izvedena študija med staranjem jajčnih celic in uporabo samic različnih starosti kot darovalk jajčnih celic. Yamamoto in sodelavci (2010) so poročali o s starostjo povezanem upadu stopnje oploditve starih krav, kar kaže, da so bile te jajčne celice bolj nagnjene k nadaljevanju prve mejotske delitve med zorenjem in so pogosto že začele mejotsko zorenje ob zbiranju oocitov [50]. Ti podatki kažejo, da so jajčne celice starejših krav imele hitrejše napredovanje jedrnega zorenja in dosegle fazo MII hitreje kot jajčne celice mladih samic zaradi nižje kompetence oocitov [51]. V skladu s tem naša študija razkriva, da starost darovalk in proces staranja jajčnih celic pomembno vplivata na kromosomsko konfiguracijo jajčnih celic med napredovanjem zorenja. Pravzaprav so jajčne celice krav pred puberteto pokazale višjo stopnjo zapoznelih faz, kot so faze Al/TI (predpuberteta=21.1 odstotek v primerjavi z odraslimi =6.8 odstotkov), kar kaže na počasnejše napredovanje jedrske zorenje, kar je lahko posledica nižje kompetence oocitov, kot so predlagali Soto-Heras in sodelavci (2018). Stare jajčne celice imajo tudi nižje stopnje oocitov, ki so dosegle fazo MII v 30-urnem obdobju (7,6 odstotka) v primerjavi s fiziološkim obdobjem (93,2 odstotka). Poleg tega so ugotovili pozitiven učinek zdravljenja z UA med procesom fiziološkega zorenja in tudi učinke proti staranju tako pri predpubertetnih kot odraslih ženskah.

V skladu z našimi ugotovitvami je študija pokazala, da bi dodajanje melatonina med zorenjem in oitro lahko spodbudilo ponovni začetek mejoze pri govejih COC, medtem ko so imele kontrolne jajčne celice, gojene brez hormonov, stopnje ponovne vzpostavitve mejoze počasnejše [52]. Nasprotno, dopolnjevanje z drugimi antioksidanti, kot so kvercetin, vitamin C ali resveratrol, ni imelo nobenega učinka na stopnje zorenja jedra, tudi če so opazili znižane ravni ROS ali povečane ravni antioksidativnih encimov [53, 54].mikronizirana prečiščena flavonoidna frakcija 1000 mg uporabljaNasprotno pa naši rezultati kažejo, da bi UA lahko rešil jajčne celice pred učinki staranja pri starih odraslih in predpubertetnih ženskah, ki predstavljajo nižjo usposobljenost, kar izboljša stopnjo zorenja.

Eden od glavnih dejavnikov, ki prispevajo k slabim rezultatom plodnosti, ki vplivajo na kakovost jajčnih celic, so povezane z mitohondrijskimi funkcijami, ki postanejo ogrožene s starostjo matere in staranjem po ovulaciji [21, 55]. MMP so obsežno raziskali v različnih modelih in razkrili, da tako starane gamete po ovulaciji kot staranje matere povzročijo izgubo mitohondrijske funkcije [56]. Posledično se je izguba MMP negativno odrazila na razvoj oocitov in zarodkov [26, 57]. V skladu s temi ugotovitvami je bilo v naši študiji ugotovljeno zmanjšano razmerje MMP v starih jajčnih celicah tako predpubertetnih kot odraslih krav. Poleg tega je dodajanje UA v gojišče povzročilo povečanje MMP predpubertetnih in odraslih jajčnih celic, ki so dozorele 22 ur, kar je odmevalo v višjih stopnjah cepitve. Ti podatki se ujemajo z rezultati, ki so jih odkrili Liang in sodelavci (2017), ki so opazili povečanje MMP, ko so bile goveje jajčne celice 22 ur dopolnjene z melatoninom [26]. Vendar pa smo ugotovili tudi zmanjšanje MMP v starih jajčnih celicah, dopolnjenih z UA, kar pomeni, da UA morda ne bo mogel odpraviti negativnega učinka staranja pri MMP. Opazili so neskladne rezultate v zvezi z MMP po dodatku starih jajčnih celic z antioksidantnimi spojinami. Dejansko je več avtorjev poročalo o večjih ravneh MMP na jajčnih celicah po dodatku melatonina [26] in laminarina [21], medtem ko so drugi opazili nasprotno, zmanjšano MMP v starih jajčnih celicah, zdravljenih z L-karnitinom [58] in melatoninom [38]. Poleg tega so Ryu in sodelavci (2016) pokazali zmanjšanje MMP v mioblastih miši, gojenih z UA [28]. V zvezi z našimi rezultati je treba opraviti nadaljnje študije, da bi poglobili znanje o mehanizmu delovanja UA v mitohondrijih oocitov in razložili ugotovljene diferencialne učinke na stare in fiziološko dozorele jajčne celice.

O intrinzični kakovosti jajčnih celic so poročali kot o glavni determinanti poznejšega embrionalnega razvoja. Zbrani dokazi so razkrili, da se več celičnih in molekularnih nepravilnosti pojavi med podaljšanimi obdobji zorenja in vitro kot tudi med postovulacijskim staranjem in oivo [57]. Poleg tega lahko te nenormalnosti pomembno vplivajo na kakovost jajčnih celic, kar se odraža v proizvodnji zarodkov [52]. Da bi dokazali, da lahko UA deluje kot spojina proti staranju in izboljša kakovost jajčnih celic, kar upočasni staranje jajčnih celic, smo raziskali razvojno sposobnost ostarelih jajčnih celic po in vitro oploditvi. V naši študiji so opazili pomemben (p Manjši ali enak 0,01) škodljiv učinek staranja gamete na cepitev in stopnjo proizvodnje zarodkov na dan 7. V skladu s tem je več avtorjev navedlo, da imajo stare samice s starostjo povezano zmanjšanje reproduktivnih sposobnosti, kar se kaže v nižji stopnji plodnosti in slabi kakovosti zarodkov [44,55]. Po drugi strani pa so prejšnje študije, ki so testirale druge molekule antioksidantov za reševanje ostarelih jajčnih celic, poročale o koristnem učinku nekaterih od teh spojin med zorenjem in vitro na razvoj zarodkov starih samic različnih vrst, kot so govedo [58], prašič 38] in miši [6]. Na primer, L-karnitin je bil testiran na govejih jajčnih celicah in ni bilo ugotovljenih pomembnih razlik v dobljenih stopnjah cepitve. Vendar pa je bilo ugotovljeno znatno povečanje stopnje zigot, razvitih do stopnje blastociste, v primerjavi s starimi jajčnimi celicami brez L-karnitina [59]. Naši rezultati tudi kažejo, da je dodajanje UA med fiziološkim zorenjem izboljšalo stopnjo cepitve pri predpubertetnih in odraslih ženskah. Čeprav se stopnje cepitve jajčnih celic, starih z UA, niso bistveno razlikovale od jajčnih celic v kontrolni starosti, so bile ugotovljene višje stopnje zarodkov D7 v jajčnih celicah, starih z UA, tako pri predpubertetnih kot odraslih ženskah. Ti rezultati so poudarili, da učinek UA proti staranju, ki je bil prej ugotovljen v različnih celičnih kulturah [28, 35], velja za jajčne celice in zarodke. Staranje jajčnih celic je večfaktorski proces, ki poslabša razvoj zarodka, in obnovitev razvojne sposobnosti ostarelih jajčnih celic je pomemben cilj, ki je bil dosežen v tej študiji.

Poleg tega smo ocenili tudi vlogo preprečevanja UA pri s starostjo povezanim poslabšanjem kakovosti zarodkov. Čeprav v tej študiji niso bile ugotovljene pomembne razlike v stopnjah kakovosti zarodkov, so jajčne celice, dopolnjene z UA, povečale število prenosljivih zarodkov v primerjavi z neobdelanimi. Prejšnja študija je poročala, da bi zdravljenje z L-karnitinom lahko izboljšalo kakovost zarodkov, razvitih iz staranih govejih jajčnih celic z zmanjšanjem ravni ROS in višjih ravni glutationa ter drugih antioksidantnih encimov [58]. Razlike med temi rezultati in našimi so lahko posledica različnih tehnik, uporabljenih za oceno kakovosti zarodka. Morfološka ocena kakovosti zarodka ostaja subjektivna metoda, ki je odvisna od izkušenj opazovalca. V prihodnosti bi bilo treba obravnavati več študij z uporabo drugih tehnik za natančno oceno kakovosti zarodkov.

Splošno znano je, da ima oksidativni stres ključno vlogo pri s starostjo povezanim zmanjšanju plodnosti. Oksidativni stres je eden glavnih dejavnikov, ki prispevajo k nizki učinkovitosti zorenja jajčnih celic in poslabšanju kakovosti jajčnih celic, s čimer se poslabša kasnejši razvoj zarodka [11]. Medcelična komunikacija med gameto in somatskimi celicami je ključnega pomena za pravilen razvoj kakovostnih jajčnih celic. Poročali so o spremembah v mikrookolju starih jajčnikov, kot je zmanjšana antioksidativna encimska aktivnost, ki vodi do oslabljene učinkovitosti čiščenja ROS.oteflavonoidPoleg tega je bilo dokazano, da imajo GC iz mladih in starejših samic različno izražene gene, povezane z antioksidativnimi aktivnostmi in starostjo mater [2, 13]. Zato je zelo pomembno, da najdeni mehanizmi obvladujejo oksidativni stres, da bi rešili jajčne celice pred staranjem in premagali težave z neplodnostjo. Pot Nrf2-Keapl je bila obširno raziskana zaradi njene zmožnosti obvladovanja škodljivih učinkov oksidativnega stresa in izvajanja antioksidativnih lastnosti. [60] Za nadaljnjo študijo aktivacije signalne poti Nrf2 v govejih GC smo ocenili Raven izražanja mRNA NFE2L2 in njegovega antioksidanta (NQO1). Naši rezultati so pokazali pomemben vpliv starosti žensk na raven transkriptov NFE2L2, ki se s starostjo zmanjšuje. Dejansko so pri kravah v predpubertetni dobi opazili višje ravni izražanja mRNA v primerjavi z odraslimi. To je v skladu s prejšnjimi študijami, ki so poročale o visoko izraženi ravni proteina Nrf2 in mRNA na tkivih jajčnikov mladih miši in žensk v rodnosti, starih od 22 do 49 let, medtem ko so pri starih miših in ženskah ugotovili nižjo ekspresijo. Predlagano je bilo, da je lahko zmanjšana ekspresija Nrf2 vpletena v upad reproduktivne sposobnosti starejših žensk in ima lahko njen nadzor pomembne posledice pri odložitvi staranja jajčnikov [15,61]. Poleg tega so Akino in sodelavci (2019) pokazali, da lahko aktivacija poti Nrf2-Keapl z dajanjem dimetilfumarata zmanjša ravni ROS in vodi do zapoznele neplodnosti [18]. Poročali so o podobnih rezultatih glede učinka UA na zmanjšanje ROS v starajočih se fibroblastih človeške kože. Ko so bile te celice obdelane z UA, so poročali o znatnem povečanju izražanja mRNA ciljnih genov Nrf2, kot so SOD1, NQ01, GCLC in HMOX1. [35]. V naši študiji smo opazili, da dodatek UA ni bistveno vplival na raven izražanja genov NFE2L2 in NQO1 v GC. Vendar pa je treba opraviti nadaljnje študije, da bi potrdili zmanjšanje ROS in posledično izboljšanje proizvedene blastociste, kot tudi učinek UA na izražanje mRNA zgoraj omenjenih genov na starih oocitih.

Poleg poškodbe mitohondrijske DNA (mt-DNA) [25,57] se je pokazalo, da tudi motnje izražanja mitohondrijskih genov prispevajo k mitohondrijski disfunkciji s starostjo. Zhang in sodelavci (2019) so poročali, da so bili nekateri geni, vključeni v OXPHOS, in sicer mt-ND2, mt-ND3, mt-ND4, mt-ND4L in mt-ND5, znatno zmanjšani v GV fazi oocitov starih miši, v primerjavi s tistimi iz mladih miši[62]. V naši študiji ni bilo ugotovljene bistvene razlike v izražanju mRNA mt-ND5 med GC, pridobljenimi iz predpubertetnih in odraslih krav. Poleg tega smo ocenili tudi število kopij mt-DNA, ker je bila vsebnost mt-DNA v GC pozitivno povezana s kakovostjo oocitov in razvojem zarodkov [63,64]. Čeprav v naši študiji ni bilo ugotovljenih pomembnih razlik med številom kopij mt-DNA v GC predpubertetnih in odraslih krav ali pri zdravljenju z UA, smo opazili večje število oocitov, ki so se razvili do stopnje blastociste, v primerjavi z nezdravljenimi skupinami. Poleg tega so Ryu in sodelavci (2016) poročali, da se vsebnost mt-DNA in raven beljakovin iz dihalnih kompleksov nista spremenila v mišjih mioblastih, dopolnjenih z UA [28]. Opraviti je treba nadaljnje študije, da bi razkrili mehanizem delovanja UA pri izboljšanju plodnosti žensk.

5. Sklepi

Rezultati, pridobljeni v tej študiji, so potrdili škodljiv učinek staranja jajčnih celic na njihovo razvojno sposobnost. Poleg tega se je naš model za staranje ženskih spolnih celic izkazal za zelo učinkovitega in uporabnega za preučevanje različnih težav, povezanih z reproduktivnim staranjem in posledično okvaro plodnosti. Poleg tega je dodajanje UA med procesom zorenja starih jajčnih celic izboljšalo stopnjo zorenja in proizvedlo zarodke. Zato je bil prvič ugotovljen učinek UA proti staranju pri reševanju ostarelih gamet, kar izboljša razvoj blastociste, kar vodi do povečanega števila zarodkov za prenos do samic prejemnic. Ugotovljen je bil tudi pozitiven učinek UA na fiziološko zorenje, MMP in embrionalni razvoj. Skratka, zdravljenje UA zagotavlja nov terapevtski pristop za preprečevanje ali odložitev staranja gamete in izboljšanje kasnejšega nastajanja blastociste in rezultatov plodnosti pri ART.

Ta članek je izvleček iz Animals 2021, 11, 2048. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals