Funkcionalni dejavniki in mehanizem proti staranju Cistanche Deserticola Ⅱ

3. Rezultat

3.1 Potencialne učinkovine in tarče Cistanche deserticola

S pregledom literature in združevanjem s prejšnjimi raziskavami te raziskovalne skupine je bilo 12 kemičnih komponent, vključno s feniletanol glikozidi, iridoidi in lignani, izbranih kot ciljne spojine za mrežne farmakološke raziskave. Specifične informacije so prikazane v tabeli 3. Po odstranitvi dvojnikov iz zbirke podatkov je bilo pridobljenih skupno 86 ciljnih vrednosti za 12 potencialnih učinkovin.

Visokokakovostna cistanča za preprečevanje staranja

3.2 Cilji, povezani s staranjem

V zbirkah podatkov GeneCards in OMIM je bilo zbranih 7753 in 295 ciljev, povezanih s staranjem.

3. 3 Skupne tarče zdravil in bolezni ter izgradnja mreže PPI

Rezultat presečišča tarč zdravil in tarč bolezni je bilo 75 tarč presečišč, ki so bili uvoženi v platformo za analizo omrežja STRING, nepovezana vozlišča v omrežju so bila skrita in zgrajeno je bilo omrežje PPI. Oglejte si izboljšana gradiva za objavo. V omrežju PPI je skupaj 45 vozlišč in 59 povezav. Osem glavnih ciljev je bilo pregledanih s topološko analizo, kot je prikazano v tabeli 4.

3.4 Analiza obogatitve GO in analiza obogatitve KEGG

Prek baze podatkov OmicsBean so bile glavne tarče izpostavljene funkcionalni obogatitvi GO in analizi poti KEGG. Analiza GO vključuje tri vidike: celično komponento, molekularno funkcijo in biološki proces. Prvih 10 postavk z najmanjšo vrednostjo P je prikazanih v izboljšanem publikacijskem gradivu. Rezultati kažejo, da biološki procesi vključujejo predvsem uravnavanje reaktivne presnove kisika, pozitivno uravnavanje imunskih odzivov, lokalizacijo beljakovin v organele, prebavo polisaharidov itd.; celične komponente vključujejo predvsem endomembranski sistem, zunajcelično regijo, plazemsko membrano in celice, vezane na membrano.

Organi, zunajcelična sekretorna telesa, Golgijev aparat itd.; molekularne funkcije so v glavnem povezane z aktivnostjo glukozidaze, regulativno aktivnostjo sintaze dušikovega oksida, vezavo ogljikovih hidratov, aktivnostjo -fruktoze furanozidaze itd. Z obogatitvenim presejanjem KEGG je bilo pridobljenih skupno 27 poti, povezanih s staranjem, in 20 najboljših poti je bilo vključenih v pot diagram mehurčkov (glejte izboljšano gradivo za objavo). Cistanche deserticola zavira staranje.

Tabela 3 Učinkovine Cistanche deserticola

Preglednica 4: Glavni cilji Cistanche deserticola za upočasnitev staranja

Vključuje predvsem poti raka, nevrosekretorne sisteme in poti prenosa signalov. Poti raka vključujejo predvsem rak prostate, rak dojke in druge poti; nevroendokrini sistem vključuje signalno pot estrogena, signalno pot GnRH in signalno pot insulina (signalna pot insulina) in tako naprej; signalne poti vključujejo fosfatidilinozitol 3-kinazo-protein kinazo B (PI3K Akt) signalno pot in fosfolipazo D signalno pot (fosfolipaza D signalna pot).

3.5 Konstrukcija mreže zdravilnih materialov-sestavnih delov-tarč

Aktivne sestavine, tarče in poti Cistanche deserticola, ki upočasnjujejo staranje, so bile preslikane v mrežo zdravilne sestavine-tarče-poti s programsko opremo Cytoscape 3.8.0. V tem omrežju je skupaj 114 vozlišč in 218 linij (glejte gradivo za izboljšano objavo).

3.6 Vpliv Cistanche deserticola na življenjsko dobo ogorčic

Rezultati testa toksičnosti so prikazani na sliki 1. V primerjavi s kontrolno skupino, Cistanche deserticola 25 in 50 ug·mL–1

Lahko podaljša življenjsko dobo nematod. 100 ug·mL–1 nima očitnega učinka. 200 in 500 ug·mL–1

Ima določeno toksičnost za ogorčice in skrajšuje njihovo življenjsko dobo. Na podlagi rezultatov testa toksičnosti izberite

Cistanche deserticola so dajali v masnih koncentracijah 25, 50, 75 in 100 ug·mL–1, da bi določili življenjsko dobo ogorčic N2. Rezultati so prikazani v tabeli 5. V primerjavi s kontrolno skupino, Cistanche deserticola 25, 50, 75 ug·mL–1

Življenjska doba ogorčic v skupini je bila znatno podaljšana, zato so bili naslednji poskusi izvedeni pri 25, 50 in 75 ug·mL–1.

Slika 1 Krivulja preživetja ogorčic po dajanju različnih masnih koncentracij Cistanche deserticola

• Legenda:

• Rdeča: Nadzorna skupina
• Modra: skupina Cistanche 25 µg·mL⁻¹
• Zelena: skupina Cistanche 50 µg·mL⁻¹
• Vijolična: skupina Cistanche 100 µg·mL⁻¹
• Oranžna: skupina Cistanche 200 µg·mL⁻¹
• Rjava: skupina Cistanche 500 µg·mL⁻¹

• Osi:

• Os Y: Stopnja preživetja (%)

• Os X: Čas (t/d)

  
  

3.7 Vpliv Cistanche deserticola na stresno sposobnost ogorčic

V pogojih oksidativnega stresa, ki ga povzroča H2O2-, se je v primerjavi s kontrolno skupino življenjska doba ogorčic v zdravljeni skupini Cistanche deserticola podaljšala (slika 2A). Povprečna življenjska doba ogorčic v kontrolni skupini je bila (1,44±0.07) h, Cistanche deserticola pa 75 ug·mL– Povprečna življenjska doba ogorčic v skupini 1 je bila (2.02 ±0.05) h, življenjska doba pa se je znatno podaljšala (P<0. 001). Under heat stress conditions, compared with the control group, the heat shock resistance of nematodes in the Cistanche deserticola treatment group was improved and their lifespan was extended (Figure 2B). The average lifespan of nematodes in the control group was (19.25±0.20) h, and that of Cistanche deserticola was 75 The average lifespan of nematodes in the μg·mL–1 group was (22.80±0.08) h, and compared with the control group, the lifespan extension effect was significant (P<0.001).

Tabela 5 Vpliv različnih masnih koncentracij Cistanche deserticola na življenjsko dobo ogorčic (xˉ±s, n=100)

Opomba:V primerjavi s kontrolno skupino, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

3. 8 Vpliv Cistanche deserticola na kopičenje lipofuscina in sposobnost upogibanja telesa nematod

Lipofuscin se postopoma kopiči s starostjo. V primerjavi s kontrolno skupino so se ravni modre fluorescence nematod v skupinah Cistanche deserticola 25, 50 in 75 ug·mL–1 zmanjšale za 15,09 %, 28,7 % oziroma 39, 86 %. 7. dan (slika 3A~B); Na 11. dan so se ravni modre fluorescence zmanjšale za 8,55 %, 22,36 % oziroma 36,84 %, kar kaže, da je Cistanche deserticola zaviral kopičenje lipofuscina.

Učinek Cistanche deserticola na sposobnost upogibanja telesa nematod je prikazan na sliki 3C. V primerjavi s kontrolno skupino se je število časov upogibanja telesa ogorčic v skupini Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 povečalo za 25 % oziroma 36 % v 30 s 3. oziroma 7. dan. 17 %, kar kaže, da lahko Cistanche deserticola spodbuja upogibanje telesa ogorčic.

3.9 Vpliv Cistanche deserticola na sposobnost požiranja in sposobnost razmnoževanja ogorčic

3. in 7. dan v primerjavi s kontrolno skupino ni bilo statistično pomembne razlike v stopnji faringealnega črpanja (številu faringealnih črpanj v 60 s) ogorčic v skupini, ki je prejemala Cistanche deserticola (slika 4A), kar kaže, da je Cistanche deserticola ni spremenilo hitrosti faringealnega črpanja ogorčic N2. Vnos hrane, učinki dolgoživosti, ki jih posreduje Cistanche deserticola, niso odvisni od prehranskih omejitev. Ni bilo pomembnih sprememb v številu jajčec (slika 4B) in številu potomcev (slika 4C) ogorčic, zdravljenih z zdravilom, v primerjavi s kontrolno skupino, kar kaže, da Cistanche deserticola ni vplivala na sposobnost razmnoževanja ogorčic.

3.10 Vpliv Cistanche deserticola na ROS, vsebnost MDA in aktivnost antioksidativnih encimov

Posledica akutne stresne toksičnosti so povečane ravni ROS. Kot je prikazano na slikah 5A in 5B, se je v primerjavi s kontrolno skupino stopnja kopičenja ROS ogorčic v skupini Cistanche deserticola znatno zmanjšala 7. dan dajanja (P<0.05, P<0.01, P<0.001). In order to explore the effect of Cistanche deserticola on the endogenous antioxidant defense ability of nematodes, the activity of antioxidant enzymes in nematodes was measured. Compared with the control group, the SOD, CAT, and GSH-Px activities of nematodes in the Cistanche deserticola 25, 50, and 75 μg·mL–1 groups were significantly increased (Figure 5C~E). MDA is an important biomarker of lipid peroxidation. Compared with the control group, the MDA level in nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced (P<0.05, Figure 5F). The above results show that Cistanche deserticola can effectively alleviate oxidative stress in nematodes.

• Legenda:

• Rdeča: Nadzorna skupina
• Modra: skupina Cistanche 25 µg·mL⁻¹
• Zelena: skupina Cistanche 50 µg·mL⁻¹
• Vijolična: skupina Cistanche 100 µg·mL⁻¹
• Oranžna: skupina Cistanche 200 µg·mL⁻¹
• Rjava: skupina Cistanche 500 µg·mL⁻¹

3.11 Vpliv Cistanche deserticola na izražanje mRNA genov, povezanih s staranjem

Signalna pot insulina (IIS) med 20 najboljšimi potmi, ki jih je analiziral KEGG, je tesno povezana s staranjem C. elegans, raziskave mehanizma pa so razmeroma zrele [10], s čimer se preverja izražanje genov, povezanih s staranjem, na signalni poti insulina. Inzulinu podobni peptidi (ILP), sproščeni v C. elegans, se vežejo na njihov receptor DAF-2 in aktivirajo končni produkt napredne glikacije-1 (AGE-1), ki dodatno aktivira protein kinazo B{{ 7}}/2 (Akt-1/2). , ki fosforilira transkripcijski faktor DAF-16, kar povzroči aktivnost DAF-16 in

Njegova migracija v jedro je zavrta [11]. Kot je prikazano na sliki 6, so ravni izražanja mRNA DAF-2, AGE-1 in Akt-1 v ogorčicah v Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 v primerjavi s kontrolno skupino. skupina je bila znatno zmanjšana (P<0.05, P<0.01) , the expression level of DAF-16 mRNA was significantly increased (P<

0.01). Pokazalo se je, da je učinek podaljšanja življenja, ki ga posreduje Cistanche deserticola, odvisen od signalne poti IIS. Gen sir-2.1 ima pomembno vlogo pri fizioloških dejavnostih, kot so staranje ogorčic, stres in apoptoza. Povečana regulacija izražanja gena sir-2.1 bo podaljšala življenjsko dobo ogorčic [12], vendar po dajanju zdravila ni učinka. Bistveno spremenjen nivo izražanja SIR-2. 1 mRNA (slika 6). HSF-1 in SKN-1 imata pomembno vlogo pri uravnavanju oksidativnega stresa in staranja pri C. elegans [11]. Rezultati so pokazali, da je v primerjavi s kontrolno skupino Cistanche deserticola 75 ug·mL–1

Stopnje izražanja HSF-1, HSP-16. 1, HSP -16. 2 in SKN-1 mRNA v skupini C. elegans sta bili znatno povečani (slika 6). Transkripcijski faktorji DAF-16/forkhead box protein (FOXO) in SKN-1/jedrski transkripcijski faktor E2-sorodni faktor 2 (Nrf2) se aktivirajo in lahko uravnavajo številne gene, ki kodirajo antioksidante beljakovine [13]. V primerjavi s kontrolno skupino so ravni izražanja mRNA SOD-3, GST-4, CTL-1, CTL-2 in MTL-1 ogorčic v Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 se je znatno povečalo, kar kaže, da lahko Cistanche deserticola poveča antioksidativno zmogljivost. podaljšati življenje. Prehranska omejitev lahko izboljša delovanje mitohondrijev in podaljša življenjsko dobo z omejevanjem vnosa hrane [14]. V vsaki skupini ni bilo statistično pomembne razlike v izražanju mRNA EAT-2 pri ogorčicah, kar kaže, da se učinek podaljšanja življenja, ki ga posreduje Cistanche deserticola, ne pojavi po poti omejevanja prehrane (slika 6).

Slika 4 Vpliv Cistanche deserticola na sposobnost požiranja in sposobnost razmnoževanja ogorčic (xˉ±s, n=5)

Legenda:

• 对照组: Kontrolna skupina
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: skupina Cistanche 25 ug/mL
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组: skupina Cistanche 50 ug/mL
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: skupina Cistanche 75 ug/mL

Graf B:

• 30 s内水平游泳距离/次: Horizontalna preplavana razdalja v 30 sekundah/čas
• 第3日: 3. dan
• 第7日: 7. dan

Graf C:

• 相关水平的百分率: Odstotek ustrezne ravni
• 第7日: 7. dan
• 第11日: 11. dan

Graf A:

• 60 s内爬壁次数: število vzponov na steno v 60 sekundah
• 第{{0}}日: 0. dan
• 第3日: 3. dan
• 第7日: 7. dan

Graf B:

• 广泛测试得分: rezultat testa odprtega polja
• 第1日: 1. dan
• 第2日: 2. dan
• 第3日: 3. dan
• 第4日: 4. dan
• 第5日: 5. dan

Graf C:

• 千元迷宫次数: napake Y-labirinta
• 第1日: 1. dan
• 第2日: 2. dan
• 第3日: 3. dan
• 第4日: 4. dan
• 第5日: 5. dan

3. 12 Vpliv Cistanche deserticola na življenjsko dobo ogorčic s sorodnimi genskimi mutanti

V primerjavi s kontrolno skupino je bila krivulja življenjske dobe gensko mutiranih ogorčic daf{{0}}, skn-1 in hsf-1 v skupini Cistanche deserticola 75 ug·mL–1. se po zdravljenju ne premakne bistveno v desno (slika 7A~C). Povprečna življenjska doba mutiranih ogorčic gena -2 se je povečala za 16,45 % (P < 0,001, slika 7D).

Rezultati so pokazali, da je bil učinek podaljšanja življenja, ki ga posreduje Cistanche deserticola, povezan z geni daf-16, hsf-1 in skn-1, ne pa z genom eat-2 .

3. 13 Vpliv Cistanche deserticola na jedrsko translokacijo proteinov DAF-16 in SKN-1

Reprezentativne slike izražanja proteina DAF-16 v citoplazmi, medceličnem prostoru in jedru so prikazane na sliki 8A. V primerjavi s kontrolno skupino se je jedrsko lokalizacijsko razmerje proteina DAF-16 v ogorčicah bistveno povečalo, citoplazmatsko lokalizacijsko razmerje pa znatno zmanjšalo po dajanju Cistanche deserticola (P<0.05, P<0.01, P<0.001, Figure 8C). Representative pictures of SKN-1 protein expression in the cytoplasm and nucleus are shown in Figure 8B. Compared with the control group, the proportion of SKN-1 protein localized in the cytoplasm of nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced, while the proportion of nuclear localized protein was significantly increased (P<0.05, Figure 8D).

Slika 5 Učinki Cistanche deserticola na ROS, vsebnost MDA in aktivnost antioksidativnih encimov pri ogorčicah (xˉ±s, n=100)

Legenda:

• 对照组: Kontrolna skupina
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: skupina Cistanche 25 ug/mL
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组: skupina Cistanche 50 ug/mL
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: skupina Cistanche 75 ug/mL

Graf B:

• 30 s内水平游泳距离/次: Horizontalna preplavana razdalja v 30 sekundah/čas
• 第3日: 3. dan
• 第7日: 7. dan

Graf C:

• 相关水平的百分率: Odstotek ustrezne ravni
• 第7日: 7. dan
• 第11日: 11. dan

Graf A:

• 60 s内爬壁次数: število vzponov na steno v 60 sekundah
• 第{{0}}日: 0. dan
• 第3日: 3. dan
• 第7日: 7. dan

Graf B:

• 广泛测试得分: rezultat testa odprtega polja
• 第1日: 1. dan
• 第2日: 2. dan
• 第3日: 3. dan
• 第4日: 4. dan
• 第5日: 5. dan

Graf C:

• 千元迷宫次数: napake Y-labirinta
• 第1日: 1. dan
• 第2日: 2. dan
• 第3日: 3. dan
• 第4日: 4. dan

• 第5日: 5. dan

  
  

3. 14 Vpliv Cistanche deserticola na izražanje beljakovin SOD-3, GST-4 in HSP-16.2 v ogorčicah

Ravni izražanja beljakovin SOD-3, GST-4 in HSP-16.2 so bile vizualizirane in kvantificirane z uporabo transgenih ogorčic CF1553, CL2166 oziroma TJ375 (slika 9). V primerjavi s kontrolno skupino so se ravni izražanja beljakovin SOD-3 in GST-4 v ogorčicah v vsaki masni koncentracijski skupini Cistanche deserticola znatno povečale (P<0.05, P<0.01, P<0.001). The HSP-16.2 protein expression level of nematodes in Cistanche deserticola 50 and 75 μg·mL–1 groups was significantly increased (P<0.01, P<0.001).