Protiproliferacijski učinki Cistanches Salsa na napredovanje benigne hiperplazije prostate Ⅰ
Oct 18, 2022
Povzetek:Cistanche Tubulosase v tradicionalni medicini uporablja za zdravljenjepomanjkanje ledvic, nevrastenija, bolezni spolne disfunkcije, inbenigna hiperplazija prostate(BPH). Namen te študije je bil raziskati mehanizem, s katerim ekstrakt C. tubulosa (CSE) izzoveantiproliferativni učinek na tkivo prostatepodgan, povzročenih z BPH. Učinke CSE na BHP so ovrednotili glede na težo prostate, proizvodnjo serumskega dihidrotestosterona (DHT) in ekspresijo mRNA 5o-reduktaze tipa 1 in tipa 2 v tkivu prostate podgan, induciranih z BHP. Poleg tega je bilo izvedeno barvanje s hematoksilinom in eozinom (H&E) za histološko preiskavo morfologije prostate, ravni izražanja beljakovin v tkivu prostate pa so bile raziskane z analizo Western blot. Zdravljenje s CSE je zmanjšalo težo prostate, koncentracijo DHT v serumu in ekspresijo mRNA 5o-reduktaze tipa 1 in tipa 2 v tkivu prostate pri podganah, induciranih z BPH. Poleg tega je zdravljenje s CSE zavrlo celično proliferacijo z uravnavanjem ravni ekspresije proteinov, povezanih z vnetjem (inducibilna sintaza dušikovega oksida in ciklooksigenaza 2) in proteinov, povezanih z apoptozo (proteini družine kaspaza-3 in Bcl-2). CSE je lahko potencialni terapevtski kandidat za BPH zaradi svoje sposobnosti uravnavanja izražanja vnetnih in z apoptozo povezanih beljakovin.
Ključne besede:benigna hiperplazija prostate, Cistanche Tubulosa, dihidrotestosteron, vnetje, apoptoza, Bcl-2.
Uvod
Cistanche Tubulosaje parazitska rastlina, ki izvira iz severozahodne Kitajske. Njegovo steblo je pomembno tradicionalno orientalsko zdravilo, ki se uporablja za zdravljenjepomanjkanje ledvicinnevrastenija(Deng et al.2004). Poročali so tudi, da je C.tubulosa učinkovita pri zdravljenjubolezni spolne disfunkcije, kot naprimerimpotencainbenigna hiperplazija prostate(BPH) v korejski medicinski knjigi DonguiBogam. Feniletanoidni glikozidi (PhG) so glavne aktivne sestavine tega zelišča (Jimenez in Riguera 1994). Dokazano je, da imajo številni PhG širok razpon bioloških lastnosti, vključno z antioksidativnimi in protitumorskimi učinki. Akteozid, PhG iz C. tubulosa, zavira apoptozo, ki jo sproži 1-metil-4-fenilpiridinijev ion (MMP*) v nevronih cerebelarnih zrnc (Pu et al. 2003). Čeprav so bile izvedene študije o fizioloških funkcijah C. tubulosa, molekularni mehanizmi, na katerih temeljijo učinki C. tubulosa na BPH, niso bili raziskani.
Za BPH je značilno povečanje prostate zaradi nekancerozne rasti v žlezi (Andriole et al. 2004). Povečanje razširjenosti in incidence BHP se pojavlja v kontekstu staranja prebivalstva. Do leta 2030 bo 20 odstotkov prebivalstva ZDA starih 65 let ali več, kar bo vključevalo več kot 20 milijonov moških (Parsons 2010). Čeprav je BHP pogosta motnja pri starejših moških, sta etiologija in patologija BHP ni povsem opredeljena in trenutno ni popolnega zdravljenja za BHP (Djavan et al. 2010).
Možnosti zdravljenja BPH vključujejo farmakološke in kirurške strategije.
V zadnjih letih se je število kirurških posegov pri bolnikih z BHP zmanjšalo v korist farmakološkega zdravljenja (Emberton et al. 2011). Farmakološko zdravljenje zaradi narave BPH zahteva dolgotrajno in neprekinjeno uporabo zdravil. Zato je dolgo in neprekinjeno prenašanje zdravila zelo pomembno vprašanje. Za zdravljenje BHP se uporabljajo različne vrste farmakoloških učinkovin, kot so zaviralci 5a-reduktaze (finasterid in du-tasterid) in antagonisti a-adrenergičnih receptorjev (alfuzosin, terazosin, doksazosin, tamsulozin) (Lepor 2011;
Untergasser et al. 2005). Glavna farmakološka sredstva za zdravljenje BHP so zaviralci 5a-reduktaze, za katere je znano, da uravnavajo ravni 5o-dihidrotestosterona, in o-adrenergični blokatorji (Tiwari et al. 2005). Čeprav velja, da ta farmakološka sredstva znatno zavirajo napredovanje BPH, so številne študije poročale o njihovih neželenih stranskih učinkih (Patel in Chapple 2006). Na primer, poročali so, da finasterid povzroča različne stranske učinke, vključno z omotico, oslabljeno rastjo mišic in huda miopatija, zaradi svoje strukturne podobnosti s steroidnimi hormoni (McConnell et al. 2003; Uygur et al. 1998). Ker imajo ta farmakološka sredstva neželene stranske učinke, imajo zeliščna zdravila, ki učinkovito zdravijo BHP, veliko medicinsko vrednost.
Da bi ovrednotili učinek C. tubulosa na BHP, smo dokazali, da lahko izvleček C. tubulosa (CSE) modulira neravnovesje med rastjo celic prostate in apoptozo pri podganjih modelih BHP, ki jih povzroča testosteron.
Materiali in metode Materiali in reagenti
C.tubulosa je bila kupljena pri Omniherb Co.Ltd. (Daegu, Republika Koreja) in finasterid je bil pridobljen od Merck and Co.Inc. (New Jersey, ZDA). Testosteron, fenilmetilsulfonilfluorid (PMSF), Triton X-100, propidijev jodid (PI), Nonidet P-40(NP-40) in koktajl zaviralcev beljakovin (PIC) so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, Missouri, ZDA). Oligonukleotidne primerje GAPDH in 5o-reduktazo tipa 1 in tipa 2 smo kupili pri Bioneer (Deajeon, Koreja), SYBR Primix Ex Taq pa pri Takari (Shuzo, Shiga, Japonska). Protitelesa za anti-iNOS(M{{9} }), COX-2(C-20),poli(ADP-riboza)polimeraza-1(PARP-1,(D-1),kaspaza{{ 16}} (H-277),Bcl-2(C-2),Bcl-xL(H-5),Bax(B-9)in anti- -aktin(ACTBD11B7) so kupili pri Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornija, ZDA). Protitelo za anti-PCNA smo kupili pri BD Biosciences, Pharmingen (San Diego, Kalifornija, ZDA). Priprava C ekstrakt .tubulosa (CSE)
Zelišča C. tubulosa so bila kupljena pri Omniherb Co.Ltd. (Yeongcheon, Kyungpook, Republika Koreja). Imeli so vsebnost vlage<13% by="" weight="" and="" were="" air-dried.="" afterward,="" herbs="" underwent="" extraction="" with="" 50%(v/v)="" ethanol-water="" at="" 60="" ℃for="" 8="" h.="" the="" extract="" obtained="" was="" filtered="" through="" 20="" μm="" cartridge="" paper,="" and="" ethanol="" was="" removed="" by="" vacuum="" rotary="" evaporation="" (eyela,="" japan).="" the="" concentrate="" was="" subsequently="" freeze-dried,="" and="" the="" yield="" was="" found="" to="" be="" 12%="" w/w.="" the="" experiment="" was="" performed="" by="" dissolving="" the="" dry="" extract="" in="" distilled="" water,="" and="" the="" rest="" of="" extract="" was="" stored="" at="" -20="" ℃.="" the="" identities="" of="" the="" active="" components="" of="" the="" extract,as="" determined="" by="" hplc,="" were="" reported="" previously(jiang="" and="" tu="">
Živali
Deset tednov stare samce podgan Sprague-Dawley (200±20 g) smo kupili pri Daehan Biolink (Daejeon, Republika Koreja). Živali so bile nameščene v pogojih, ki so bili v skladu s smernicami za nego in uporabo laboratorijskih živali, ki jih je sprejel in razglasil Odbor za institucionalno oskrbo živali Univerze Sangji (reg. št.2014-09). Podgane so bile 2 tedna pred začetkom poskusa aklimatizirane na laboratorijske razmere. Imeli so prost dostop do hrane in vode 4 tedne in jih vzdrževali v ciklu 12 ur svetlobe/12 ur teme pri stalni temperaturi 22 ± 2 stopinji in relativni vlažnosti 55 ± 9 odstotkov ves čas poskusa. Podgane so bile naključno razporejene v eno od 4 skupin (n=6): kontrolna skupina (Con, normalna prostata z raztopino nosilca: fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom (PBS) 200 μL, po）; skupina, ki jo povzroča BHP (BHP), Skupina, povzročena z BHP, zdravljena s finasteridom (5 mg/kg/dan, peroralno (Fina)); skupina, povzročena z BHP, zdravljena s CSE (200 mg/kg/dan; po). Podganam v kontrolni skupini so razrezali in nato zašili, ne da bi odstranili moda po anesteziji z zoletil@ 50 (20 mg/kg, ip); podgane v drugih skupinah so bile kastrirane. Po 3 dneh okrevanja so skupinam, induciranim z BPH, injicirali testosteron propionat (10 mg/kg /dan, ip, raztopljen v koruznem olju) sam ali skupaj s CSE ali finasteridom dnevno 4 tedne. Štiriindvajset ur po zadnjem dajanju so bile vse podgane žrtvovane po anesteziji z zoletil® 50 (20 mg/kg, ip). Vzorci krvi so bili odvzeti iz kavdalne votle vene, serum pa je bil ločen s centrifugiranjem in shranjen pri -80 stopinjah Celotna prostata je bila odstranjena in stehtana (Guo et al.2004).
Razmerje med težo prostate in telesno težo
Tkiva prostate so bila izrezana, izprana in takoj stehtana. Razmerje med težo prostate in telesno težo (razmerje PW/BW) je bilo izračunano, kot je opisano spodaj.
Razmerje PW/BW
= (vsaka teža prostate živali iz poskusne skupine/vsaka telesna teža živali iz poskusne skupine) x 100 Zaviranje rasti teže prostate
Po zaključku študije so bile prostate odstranjene in stehtane. Odstotek zaviranja rasti je bil izračunan na naslednji način:100-[(zdravljena skupina-kontrolna skupina)(skupina BPH-kontrolna skupina)×100]. Analiza serumske koncentracije dihidrotestosterona (DHT).
Serumske koncentracije DHT so bile določene s komercialnim testom ELISA (ALPCO Diagnostics, Salem, New Hampshire, ZDA). Preizkusi so bili izvedeni po navodilih proizvajalca.
Histološka analiza
Tkivo prostate v vsaki skupini je bilo fiksirano v 4-odstotni raztopini formalina, vdelano v parafin in nato razrezano na odseke po 4 pm. Odseke smo obarvali s hematoksilinom in eozinom (H&E) za histološko preiskavo. Slike so bile pridobljene z uporabo mikroskopa SZX10 (Olympus, Tokio, Japonska). Histološko analizo in debelino epitelijskega tkiva prostate (TETP) je izmeril profesionalni histolog iz Seulskega medicinskega znanstvenega inštituta (Seul, Koreja) z uporabo Programska oprema Leica Application Suite (LAS, različica 3.3.0) za objektivno oceno pri histološki analizi. Kvantitativna analiza verižne reakcije s polimerazo (PCR) v realnem času
Tkivo prostate vsake živali smo homogenizirali in celotno RNK izolirali z uporabo reagenta Easy-Blue@ (Intron Biotech-nology Inc., Gyeongi-do, Republika Koreja) v skladu z navodili proizvajalca. Celotno RNA smo kvantificirali z uporabo spektrofotometrskega sistema Epoch@micro-volume (BioTek Instruments, Inc. Winooski, Vermont, ZDA). Celotno RNA iz jeter in visceralnega maščobnega tkiva smo pretvorili v cDNA z uporabo visokozmogljivega kompleta za reverzno transkripcijo cDNA (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, ZDA). Pomnoževanje PCR je bilo izvedeno z uporabo SYBR green (Applied Biosystems). ). Oligonukleotidni primerji za 5o-reduktazo tipa 1, izdelani iz podgan, so bili GGAAGG TTT CAT GGCCTT CG (naprej) in TCG AGG GCA GCT GTA TG (obratno), 5o-reduktazni primerji tipa 2, zasnovani iz podgan, so bili ATG GGG ACC CTG ATC CTG TG (naprej) in CGA CAC CACAAA GGA AGG CA (nazaj) in primerji GAPDH, uporabljeni kot hišni gen in oblikovani iz podgan, so bili TGA TTC TAC CCA CGG CAA GT (naprej) in AGC ATC ACC CCA TTT GAT GT (obratno). Reverzna transkripcija je bila izvedena z uporabo termociklerja (Gene Amp⑧ PCR system 9700, Applied Biosystems), rezultati pa so bili izraženi kot razmerje med optimalno gostoto in GAPDH. Western blot analiza
Tkivo prostateiz vsake živali smo homogenizirali v komercialnem pufru za lizo PRO-PREP⑧ (Intron Biotechnology Inc.) in inkubirali 25 minut na ledu, da induciramo celično lizo. Tkivne izvlečke smo 20 minut centrifugirali pri 16 000g (4 stopinje) in supernatant prenesli v čisto epruveto. Koncentracija beljakovin je bila odvrnjena in je pokazala značilne histološke spremembe, vključno z odebeljenim žleznim epitelijem, vakuolizirano citoplazmo, usmerjeno proti lumnu žleze, in zmanjšano površino lumina žleze (slika 3A). Dajanje CSE za 4 tedne je zatrlo te tipične hiperplastične vzorce, ki predstavljajo histološko spremembo iz normalnega tkiva prostate v hiperplazijo prostate. Na kratko, histološki pregled skupin, zdravljenih s finasteridom in CSE, je pokazal jasen trend izboljšanja hiperplazije prostate. Poleg tega, kot je prikazano na sliki 3B, je analiza TETP pokazala, da je bilo najbolj odebeljeno epitelno tkivo opaženo pri podganah, povzročenih z BHP, v primerjavi s tistimi v kateri koli drugi študijski skupini, skupine, zdravljene s finasteridom in CSE, pa so pokazale znatno zmanjšanje debeline prostate .
Da bi ocenili proliferacijo epitelijskih celic prostate, smo pregledali izražanje proteina PCNA v tkivu prostate podgan, ki jih povzroča BPH. Kot je prikazano na sliki 3C, je western blot analiza pokazala povečanje ekspresije proteina PCNA v skupini, ki je bila povzročena z BHP, v primerjavi z ravnmi PCNA v kontrolni skupini. V primerjavi s skupino, ki je bila inducirana z BHP, pa sta skupini, zdravljeni s finasteridom in CSE, pokazali zmanjšano izražanje proteina PCNA, kar kaže na njihove učinke proti proliferaciji pri BHP.
Slika 2. Učinek dajanja izvlečka Cistanche Tubulosa (CSE) na proizvodnjo serumskega dilhidrotestosterona (DHT) in ravni 5a-reduktaze tipa 1 in tipa 2 mRNA v tkivih prostate modelov podgan, povzročenih z benigno hiperplazijo prostate (BPH). (A) Serumske koncentracije DHT so bile določene s testom ELISA. (B) Ekspresija mRNA 5a-reduktaze tipa 1 in tipa 2 v tkivu prostate je bila analizirana s kvantitativno PCR v realnem času. Prikazani podatki predstavljajo povprečje ± SEM 6 podgan na skupino." str<><0.001 vs.con=""><0.001 vs.bph="">
