Lastnosti različnih vrst kurkume proti tirozinazi in izolacija aktivnih spojin iz kurkume Amada

Jesmin Akter1 ● Md. Zahorul Islam1,2 ● Md. Amzad Hossain1 ● Kensaku Takara1

1 Fakulteta za kmetijstvo, Univerza Ryukyus, Okinawa, Japonska

2 Oddelek za farmakologijo, Veterinarska fakulteta, Bangladeška kmetijska univerza, Mymensingh, Bangladeš

Za več informacij:Scotty.Wang@wecistanche.com

Povzetek

Kurkuma se tradicionalno uporablja kot kozmetika za kožo v nekaterih verskih in kulturnih priložnostih na indijski podcelini. V tej študiji smo primerjali inhibitorne lastnosti tirozinaze štirih kurkum spp., in sicer C. xanthorrhiza, C. aromatic, C. amada in C. zedoaria. Z biološkimi testi vodena izolacija in čiščenje inhibitorjev tirozinaze z uporabo kolone silikagela in tekočinske kromatografije visoke ločljivosti. Strukturno identifikacijo spojin smo izvedli z uporabo 1H NMR, 13C

NMR in tekočinska kromatografija-tandemska masna spektrometrija. C. amada je pokazala največjo inhibitorno aktivnost tirozinaze, z IC50 53,4 ug/mL. Zato je bil izbran za izolacijo in čiščenje inhibitorjev tirozinaze. Očiščene spojine so bile zederone (1), furanodienon (2), 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil){ {13}}(4-hidroksifenil) heptani (3), 3,5-dihidroksi-1-(3,4-dihidroksi fenil)-7-({{22 }}hidroksi-3-metoksifenil) heptani (4) in 1,5- epoksi 3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil) -7-(4-hidroksi-3-metoksifenil) heptani (5). Vrednosti IC50 za goboanti-tirozinazaaktivnost spojin 1, 2, 3, 4 in 5 je bila 108,2, 89,2, 92,3, 21,7 oziroma 41,3 µM. Te spojine so tudi zavirale znotrajcelično aktivnost tirozinaze in tako zmanjšale sintezo melanina v celicah melanoma B16F10. Spojina 4 je bila bistveno močnejšaanti-tirozinazakot pri arbutinu (zdravilo za pozitivno kontrolo). Med spojino 5 in arbutinom niso opazili pomembne razlike v inhibitornem učinku na tirozinazo. Naše ugotovitve močno kažejo, da je C. Amanda obetaven vir naravnih inhibitorjev tirozinaze za preprečevanje melanogeneze in bi se lahko uporabljala kot belilna kozmetika.

Ključna beseda: Curcuma amada ● Aktivne spojine ● NMR ● Antitirozinaza ● Antimelanogeno

Cližite Cistanche za anti-tirozinazo

Uvod

Melanin je črni pigment v laseh in koži in je bistven za zaščito kože pred UV sevanjem. Pigment proizvajajo melanocitne celice, ki so prisotne v bazalni plasti dermisa skozi fiziološki proces, imenovan melanogeneza. Vendar pa nenormalna proizvodnja melanina povzroča dermatološke motnje, kot so pege, melazma, lentigini, starostne pege, efelidi in povnetna hiperpigmentacija [1]. V živilski industriji hiperpigmentacija sadja in zelenjave vodi do znatnih izgub prehranske kakovosti in tržne vrednosti [2]. Melanogenezo je mogoče nadzorovati z zaviranjem aktivnosti tirozinaze, encima, ki omejuje hitrost sinteze melanina pri sesalcih, rastlinah, mikroorganizmih in glivah [3]. Zato zaviranje aktivnosti tirozinaze preprečuje hiperpigmentacijo in vodi do beljenja kože. Prav tako nadzira kakovost zelenjave in sadja z uravnavanjem neželenega porjavenja zelenjave in hrane. Večina sredstev za posvetlitev kože, kot so hidrokinon, azelaična kislina, kojična kislina in arbutin, so močni zaviralci tirozinaze. Vendar pa imajo različne neželene učinke, kot so citotoksičnost, ohronoza, vitiligo, draženje, luščenje kože in rdečina [4]. Poleg tega imata kojična kislina in -arbutin slabo stabilnost formulacije in sposobnost prodiranja skozi kožo ter nizko učinkovitost in vivo [5]. Nekatere organske in anorganske soli živega srebra imajo antimelanogene učinke in se uporabljajo v sredstvih za beljenje kože. Vendar pa lahko spojine živega srebra zaradi kožne absorpcije povzročijo toksične učinke, kot so razbarvanje kože, poškodbe ledvic, alergijska reakcija in brazgotinjenje [6]. Zato je potrebna preiskava manj strupenih in učinkovitejših zaviralcev tirozinaze. Kurkuma (družina: Zingiberaceae; rod: Curcuma), tradicionalna zdravilna rastlina, ki raste pretežno v tropskih in subtropskih predelih Azije in Afrike, ima širok spekter farmakoloških funkcij. Na indijski podcelini se že tisočletja tradicionalno uporablja v predporočnih obredih kot sredstvo za posvetlitev kože. Kurkuma naj bi izboljšala polt kože z zmanjšanjem rasti dlak na obrazu, aken in staranja kože [7, 8]. Zato so izdelki za nego kože s kurkumo komercialno dostopni na trgu [9]. Ugotovljenih je bilo več kot 70 vrst/sort kurkume z različnimi kemijskimi in farmakološkimi lastnostmi. Vendar pa primanjkuje znanstvenih informacij o antimelanogenih lastnostih različnih vrst kurkume in morebitnih aktivnih sestavinah, ki so v kurkumi. Kurkuminoidi so glavne aktivne spojine, odgovorne za večino bioloških aktivnosti kurkume. Kurkuminoidi imajo potencial v kozmetiki kotantioksidant, protivnetno,in sredstvo za posvetlitev kože [7, 8]. Vendar pa smo v prejšnji študiji ugotovili znatne razlike v vsebnosti kurkuminoidov v kurkumi in nekatere vrste (C. amada, C. zedoaria) sploh niso vsebovale kurkumina [10]. Poročali smo tudi o protiglivičnem sredstvu,antioksidantin vazodilatacijske aktivnosti različnih vrst in sort kurkume [10–13]. Zato je bil namen te študije oceniti učinke različnih vrst kurkume, in sicer C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada in C. zedoaria, na encim tirozinazo in identificirati specifične kemične spojine, odgovorne zaanti-tirozinazadejavnost. Ocenili smo tudi inhibitorno aktivnost tirozinaze in antimelanogene učinke prečiščenih aktivnih spojin na sintezo melanina v celicah melanoma B16F10.

Rezultati in razprava

Med štirimi različnimi vrstami kurkume je MeOH izvleček C. amada pokazal največji inhibitorni učinek na gobovo tirozinazo z vrednostjo IC50 53,4 ± 2,7, sledijo pa mu C. xanthorrhiza, C. aromatic in C. zedoaria (slika 1a). Kurkumin je glavna aktivna sestavina kurkume (Curcuma longa) in ima širok spekter bioloških aktivnosti, vključno z delovanjem proti raku, protivnetnim, protibakterijskim, protiglivičnim in antioksidativnim. Pokazal je 75-krat močnejše delovanje proti tirozinazi kot arbutin in kojična kislina [14]. Vendar pa smo v prejšnji študiji poročali, da obstajajo znatne razlike v vsebnosti kurkumina v različnih vrstah kurkume [10].

Kurkumin je bil prisoten v C. xanthorrhiza in C. aromatic, vendar ga ni bilo v C. zedoaria in C. amada [10]. Zanimive ugotovitve te študije so, da je brez kurkumina C. amada pokazala močno zaviralno aktivnost na tirozinazo. Ta rezultat kaže, da mora obstajati nekaj aktivnih spojin C. amada, ki se pripisujejo njenemu močnemu učinku proti tirozinazi. Antitirozinazno delovanje C. xanthorrhiza in C. aromatica je lahko posledica njune vsebnosti kurkumina. Vendar pa nismo mogli izključiti možnosti prisotnosti drugih spojin. MeOH ekstrakt C. amada je bil frakcioniran z vodo, n-heksanom in EtOAc. Med temi tremi frakcijami je EtOAc pokazal znatno močnejši inhibitorni učinek kot voda in n-heksan (slika 1b). Zato smo del EtOAc vzeli za nadaljnjo frakcioniranje. Antitirozinazne aktivnosti šestih frakcij [n-heksan:EtOAc; 100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) in 0:100 (F6)] iz EtOAc dela C. amada so primerjali. Med temi šestimi frakcijami sta F6 in F3 pokazali bistveno višjo aktivnost proti tirozinazi kot druge (slika 1c). Nato smo identificirali kemijske strukture petih spojin iz frakcij F3 in F6 glede na njihove 1H NMR in 13C NMR spektre. Najvišji podatki so bili naslednji:

Spojina 1:

Brezbarven kristal v obliki igle; UV λmax: nm 234, 285. ESI-MS (plus) m/z: 247,3 [M plus H] plus, 229,4 [M plus H-H2O] plus. 1H-NMR (CD3OD): 5 7,22 (1H, s, H-12), 5,59 (1H, br d, J=12 Hz, H{{20}}) , 3,99 (1H, s, H-5), 3,85 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,69 (1H, d, J=16 Hz, H-9b), 2,57 (1H, dddd, J=13, 13, 12, 4 Hz, H-2a), 2,26 (1H, m, H{{46) }}a), 2,20 (1H, m, H{{50}}b), 2,09 (3H, s, H-13), 1,57 (3H, s, H-15), 1,32 (1H, ddd, J=13, 13, 4 Hz, H-3b), 1,28 (3H, s, H-14). 13C-NMR (CD3OD): 5 194,2(C-6) 160,2(C-8), 139,7(C12), 132,8 (C-1), 132,0(C-10) ), 124,3(C-11), 123,0(C-7), 67,8(C-5), 65,2(C-4), 42,5(C-9 ), 39,0(C-3), 25,4(C-2), 15,7 (C-15), 15,4(C-14), 10,7(C-13 ) (dodatni podatki). Iz primerjave teh podatkov s podatki, navedenimi v literaturi [15, 16], je bila snov identificirana kot zederone (slika 2). Je seskviterpen, predhodno izoliran iz C. amada in C. zedoaria in o katerem so poročali zaradi njegovih analgetičnih, protivnetnih, protiglivičnih in citotoksičnih učinkov [12, 17–20].

Spojina 2:

Brezbarvno olje; UV λmax: nm 243, 280. ESIMS (plus) m/z: 231.0 [M plus H] plus, 223,3 [M plus H-H2O] plus. 1H-NMR (CD3OD): 5 7,16 (1H, s, H-12), 5,83 (1H, s, H-5), 5,21 (1H, dd, J=12 Hz , 5 Hz, H-1), 3,73 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,63 (1H, d, J=16 Hz, H -9b), 2,45 (1H, ddd, J=15 Hz, 11 Hz, 4 Hz, H-3a), 2,31 (1H, m, H-2a ), 2,20 (1H, dddd, J=12 Hz, 12 Hz, 12 Hz, 4 Hz, H-2b), 2,06 (3H, s, H{{57} }), 1,92 (3H, s, H-14), 1,89 (1H, m, H-3b), 1,25 (3H, s, H-15). 13C-NMR (CD3OD): 5 191,8 (C-6), 158,6 (C-8), 147,6 (C-4), 140,0 (C-12), 136,1 ( C-10), 133,3 (C-5), 132,0 (C-1), 124,6 (C-11), 123,1 (C-7), 42,4 ( C-9), 41,4 (C-3), 27,3 (C-2), 19,3 (C-14), 15,9 (C-2), 9,9 ( C-13) (dodatni podatki). Iz primerjave teh podatkov s podatki iz literature [21] je bila snov identificirana kot furanodienon (slika 2). Izolirana je bila iz Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. bivši kavelj. f [22], Curcuma zedoaria [19], Curcuma amada [12] in Curcuma wenyujin [23]. Je furanozekviterpenoid, ki deluje proti glivicam [12], protivnetno [19], proti raku [24], protibakterijsko in antioksidativno [22].

spojina 3:

rumenkasto olje; UV λ max: nm 275. ESIMS (plus) m/z: 383,3 [M plus Na] plus, 361,3 [M plus H] plus, 343,2 [M plus H-H2O] plus. 1H-NMR (CD3OD): 5 6,99 (2H, dd, J=9, 2 Hz, H-2´´, -6´´), 6,67 (2H, d, J=9 Hz, H-3´´, -5´´), 6,52 (2H, s, H-2´, -6´), 4,63 (1H , br b, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1H, m, H-3), 3,89 (1H, m, H-5), 3,85 ( 3H, s, 5'-OCH3), 2,63 (2H, m, H-7), 1,82 (1H, m, H-2a), 1,78 (1H, m, H{{6{ {107}}}a), 1,73 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{{72}) }b), 1,53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): 5 156,3 (C-4´´), 149,5 (C-5´), 146,4 (C-3´), 134,5 (C-4 ´), 134,44 (C-1´), 134,41 (C-1´´), 130,4 (C-2´´, -6´´), 116,1 (C{ {104}}´´, -5´´), 108,0 (C-2´), 102,8 (C-6´), 75,2 (C-1), 72,6 ( C-5), 65,6 (C3), 56,6 (5´-OCH3), 41,1 (C-2), 39,5 (C-4), 39,2 (C-6) 31.8 (C-7) (dodatni podatki). Iz primerjave teh podatkov s podatki, navedenimi v literaturi [25], je bila snov identificirana kot 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi{ {145}} metoksifenil)-7-(4-hidroksifenil) heptani (slika 2). Izolirali so ga iz korenin Zingiber officinale in proučevali njihove antioksidativne lastnosti [25].

Spojina 4:

Viskozni sirup; UV λ max: nm 281. ESIMS (plus) m/z: 385,3 [M plus Na] plus, 363,3 [M plus H] plus, 345,2 [M plus H-H2O] plus. 1H-NMR (CD3OD): 5 6,75 (1H, d, J=2 Hz, H-2´), 6,68 (1H, d, J=8 Hz, H{{21 }}´), 6,64 (1H, J=8 Hz, H-5´´), 6,61 (1H, J=2 Hz, H-2´´), 6,60 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6,49 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´´), 3,80 (3H, s, 3´-OCH3), 3,73 (2H, m, H-3, -5), 2.64-2.47 (4H, m, H{{59) }}a, -1b, -7a, -7b), 1.71-1.65 (4H, m, H-2a, {{ 68}b, -6a, -6b), 1,61 (2H, m, H-4a, -4b). 13C-NMR (CD3OD): 5 148,8 (C-3´), 146,1 (C-3´´), 145,4 (C-4´), 144,2 (C-4 ´´), 135,24 (C-1´ ali C-1´´), 135,22 (C-1´ ali C-1´´), 121,8 (C{{101 }}´), 120,6 (C-6´´), 116,5 (C-2´´), 116,3 (C-5´´), 116,1 (C-5´ ), 113,2 (C-2´), 70,94 (C-3 ali C-5), 70,92 (C-3 ali C-5), 56,4 (3 ´-OCH3), 44,9 (C-4), 40,8 (C-2, -6), 32,3 (C-1), 32,1 (C-7) (Dodatni podatki). Iz primerjave teh podatkov s podatki iz literature [26, 27] je bila snov identificirana kot olje 3,5-dihidroksi-1-(3,4-dihidroksifenil){{150 }} (4-hidroksi-3-metoksifenil) heptani (slika 2). Izolirali so ga iz korenike Tacca chantrieri [26] in Curcumalonga L. [27]. So diarilheptanoidi, ki kažejo citotoksično [26] in protitumorsko [27] delovanje.

Spojina 5:

Brezbarvno olje; UV λ max nm: 279. ESI-MS (plus) m/z: 413,3 [M plus Na] plus, 391,3 [M plus H] plus, 373,3 [M plus HH2O] plus. 1H-NMR (CD3OD): 5 6,76 (1H, s, H-2´´), 6,67 (1H, d, J=8 Hz, H{{20}} ´´), 6,21 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6,53 (2H, s, H-2´, -6´´ ), 4,63 (1H, br d, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1H, m, H-3), 3,83 (3H, s, 5´-OCH3) 3,78 (3H, s, 3-OCH3), 2,65 (2H, m, H-7), 1,84 (1H, m, H-2a), 1,79 (1H, m, H-6a), 1,74 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{{ 75}}b), 1,53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): 5 149,5 (C-5´), 148,8 (C-3´´), 146,4 (C-3´), 145,4 (C-4 ´´), 135,3 (C-1´), 135,2 (C-1´´), 134,4 (C-4´), 121,9 (C-6´´), 116,1 (C-5´´), 113,4 (C-2´´), 108,0 (C-2´), 102,7 (C-6´), 75,2 (C{ {121}}), 72,5 (C-5), 65,6 (C-3), 56,6 (5´-OCH3), 56,3 (3'´-OCH3), 41,2 (C{{140} }), 39,4 (C-4), 39,3 (C-6), 32,2 (C-7) (dodatni podatki). Iz primerjave teh podatkov s podatki, navedenimi v literaturi [20], je bila snov identificirana kot 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi{ {157}}metoksifenil)- 7-(4-hidroksi-3-metoksifenil) heptani (slika 2) in ni podatkov o njihovi biološki aktivnosti. Spojine 3, 4 in 5 smo prvič izolirali iz C. amada. Vse spojine so pokazale inhibitorno aktivnost proti gobji tirozinazi

Pet spojin, in sicer zederone, furanodienon, 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil)- 7-( 4-hidroksifenil) heptani, 3,5-dihidroksi-1-(3,4-dishihidroksifenil)-7-(4-hidroksi-3- metoksifenil) heptani in 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil)- 7-(4- hidroksi-3-metoksifenil) heptane, smo izolirali iz frakcij F3 in F6. Izolirane spojine so pokazale aktivnost proti tirozinazi v odvisnosti od koncentracije. Med petimi spojinami je spojina 4 pokazala znatno močnejšo aktivnost proti tirozinazi kot arbutin. Med spojino 5 in arbutinom ni bilo pomembnih razlik v učinkih proti tirozinazi (slika 3). Učinke izolirane spojine na celično sposobnost preživetja so proučevali na celicah mišjega melanoma B16F10. Celice smo 48 ur obdelali s 50, 100, 200 in 400 μM koncentracijami spojine. Izolirane spojine niso pokazale citotoksičnih učinkov do 200 μM, kljub temu pa so pri koncentraciji 400 μM v vseh primerih opazili približno petdeset odstotkov celičnih smrti (slika 4). Tako so bile koncentracije do 200 μM uporabljene za oceno njihovih intracelularnih antitirozinaznih in antimelanogenih učinkov.

Za določitev antimelanogenih in antitirozinaznih aktivnosti izoliranih spojin so ocenili njihove učinke na vsebnost melanina in aktivnost tirozinaze v celicah melanoma B16F10. Kot je prikazano v tabeli 1, so naše izolirane spojine odvisno od odmerka inhibirale znotrajcelično vsebnost melanina in aktivnost tirozinaze. Spojina 4 je bila bistveno močnejša od pozitivnega kontrolnega zdravila arbutina tako pri inhibitornih učinkih na melanin kot tirozinazo. Med spojino 5 in arbutinom niso opazili pomembne razlike. Ker celična tirozinaza poveča proizvodnjo melanina, je zmanjšanje aktivnosti tirozinaze učinkovita strategija za razvoj antimelanogenih sredstev. Za to smo ovrednotili inhibitorne lastnosti intracelularne aktivnosti tirozinaze in melanogeneze v celicah melanoma B16F10. Podobno kot ugotovitve o inhibitornem delovanju tirozinaze v gobah, izolirane spojine zavirajo znotrajcelično aktivnost tirozinaze in melanogenezo na način, ki je odvisen od odmerka. Antitirozinazni učinki izoliranih spojin so povzročili njihove antimelanogene lastnosti. Vrstni red protitirozinazne in antimelanogene aktivnosti teh spojin je bil spojina 4 > arbutin > 5 > 2 > 3 > 1. Izračunana vrednost IC50 spojine 4 je bila znatno nižja od vrednosti arbutina. Učinkovitost spojine 4 je bila 1.9- do 5-krat večja od učinkovitosti drugih štirih spojin. Spojina 5 je pokazala tudi močno aktivnost proti tirozinazi, ki je bila primerljiva z aktivnostjo arbutina. Naši rezultati so pokazali, da bi lahko spojini 4 in 5 uporabili kot potencialne naravne zaviralce tirozinaze in kozmetiko za beljenje kože. Predlagano je, da je oksidativni stres vključen v osnovni mehanizem prekomerne proizvodnje melanina [28]. Zato je bila vloga antioksidanta raziskana pri številnih kožnih boleznih, vključno s fotokarcinogenezo ali melanomom [9]. Mi in drugi smo že poročali o antioksidativnih lastnostih C. amada [13, 29], ki bi lahko bile odgovorne za antimelanogene učinke izoliranih spojin. V tej študiji smo odkrili zaviralne učinke izoliranih spojin na intracelularno sintezo melanina in aktivnost tirozinaze, ki jo povzroča -MSH. Tako lahko naše izolirane spojine uporabimo kot sredstva v funkcionalni kozmetiki za razvoj učinkovitih tretmajev za beljenje kože.

Zaključek

Močno predlagamo, da ima lahko C. amada pomembno vlogo kot učinkovit zaviralec tirozinaze. C. amada in njene bioaktivne spojine bi se lahko uporabljale v kozmetični industriji kot naravna belila, živilska industrija kot sredstva proti porjavenju in v medicini za zdravljenje hiperpigmentacije. Kljub temu so potrebne nadaljnje študije za raziskovanje antimelanogenih učinkov izoliranih spojin na živalskih modelih.

Materiali in metode

Kemikalije

Tirozinazo iz gob in arbutin smo kupili pri Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, ZDA). L-tirozin je bil iz Wako pure chemical industries Ltd. (Osaka, Japonska). Metanol (MeOH), etil acetat (EtOAc) in n-heksan so bili kupljeni pri Nacalai Tesque (Kyoto, Japonska). Kupljena sta bila silikagel (63–200 μm, Kanto Chemical Co. Tokyo, Japonska) in MeOH-d4 (CD3OD, Merck KGaA, Nemčija).

Priprava rastlinskega materiala Štiri različne vrste kurkume, in sicer C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada in C. zedoaria, so gojili na polju sivih tal (grobi pesek 3,6 odstotka, droben pesek 30,9 odstotka). , mulj 24,3 odstotka, glina 32,8 odstotka, pH 7,4, NO{{10}}N 0,07 odstotka, NH4-N 0,08 odstotka, P 4,6 ng/g, K 42,9 ng/g) pri Subtropical Field Science Center, Univerza Ryukyus, Okinawa, Japonska. Povprečna mesečna temperatura, vlažnost in padavine v obdobju gojenja so bile 17–29 stopinj, 61–83 odstotkov oziroma 22–369 mm. Zagotovljene so bile običajne agronomske prakse, vključno z gnojilom in namakanjem. Korenike smo nabirali, ko so vsi poganjki te vrste popolnoma oveneli. Korenike smo oprali, narezali in sušili v pečici z vročim zrakom pri 50 stopinjah 72 ur.

Ekstrakcija vzorcev

Ekstrakcije smo izvedli z raztapljanjem različnega prahu kurkume (300 g) v MeOH (3 L) pri sobni temperaturi (25 stopinj) in atmosferskem tlaku ter hranili dva dni z neprekinjenim magnetnim mešanjem, da se prepreči oksidacija z zrakom in zaščiti pred sončno svetlobo. V topilu topne spojine smo filtrirali s filtrirnim papirjem (št. 2, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha Ltd., Tokio, Japonska). Uporabljenemu rastlinskemu materialu smo dodali sveža topila (MeOH) in postopek trikrat ponovili. Filtrirane raztopine, ki so vsebovale rastlinske spojine, smo posušili z rotacijskim uparjalnikom pod znižanim tlakom pri 40 stopinjah. Dobitek vseh ekstraktov smo hranili v hladilniku pri 4 stopinjah za eksperimentalne analize.

Test inhibicije tirozinaze

Inhibicijska aktivnost tirozinaze je bila določena po prejšnji metodi [30] z merjenjem koncentracije kroma DOPA, ki nastane z delovanjem encima tirozinaze na substrat tirozina. Na kratko, testni vzorec smo raztopili v 80 odstotkih MeOH, da smo dobili različne koncentracije (25, 50 in 100 µg/mL). 96-Ploščo z vdolbinicami smo namestili v naslednjem vrstnem redu: 120 μL fosfatnega pufra (20 mM, pH 6,8), 20 μL vzorca in 20 μL gobje tirozinaze (500 U/mL v 20 mM fosfatu). medpomnilnik). Po inkubaciji 15 minut pri 25 stopinjah smo reakcijo sprožili z dodatkom 20 μL 0,85 mM raztopine L-tirozina in jo nato inkubirali 10 minut pri 25 stopinjah. Aktivnost tirozinaze smo določili z merjenjem absorbance pri 470 nm z uporabo čitalnika mikroplošč (Biotek Powerwave XS2 spektrofotometer). Arbutin je bil uporabljen kot pozitivna kontrola, medtem ko je bil 80-odstotni MeOH uporabljen kot negativna kontrola. Odstotek inhibicije tirozinaze je bil izračunan na naslednji način:

kjer je C absorbanca negativne kontrole, B absorbanca slepega vzorca in S absorbanca preskusnega vzorca.

Izolacija bioaktivnih spojin iz surovega ekstrakta Curcuma amada

Če upoštevamo rezultate štirih izvlečkov kurkume, je C. amada pokazala znatno večjo aktivnost proti tirozinazi kot drugi. Zato je bilo izvedeno biološko vodeno čiščenje aktivnih spojin iz surovega ekstrakta C. amada. Za identifikacijo spojin proti tirozinazi je bilo izvedeno frakcioniranje iz surovega ekstrakta C. amada, kot je opisano na sliki 5. Surovi ekstrakt je bil razredčen z destilirano vodo in nato ekstrahiran z n-heksanom, čemur je sledil EtOAc. Enake količine vsakega topila in raztopine surovega ekstrakta smo nato zmešali s stresanjem 3 minute v liju ločniku. Vse frakcije smo koncentrirali do suhega z rotacijskim uparjalnikom pri 40 stopinjah. Anti-tirozinazne aktivnosti teh treh frakcij smo določili po zgornjem postopku. Ker je frakcija EtOAc pokazala najvišjo aktivnost proti tirozinazi, je bila izbrana za izolacijo in čiščenje bioaktivne spojine. Aktivno EtOAc frakcijo smo uparili do suhega in podvrgli kromatografiji na koloni silikagela (75 g) (30 × 3 cm). Elucija je bila izvedena z uporabo n-heksana in EtOAc z naraščajočimi količinami EtOAc [100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) in 0:100 (F6)]. Aktivnost proti tirozinazi teh šestih frakcij je bila izvedena v skladu z zgornjim postopkom, večina aktivnosti pa je bila ugotovljena v F3 in F6. Frakciji F3 in F6 smo očistili s C18 HPLC z reverzno fazo (COSMOSIL 5C18-AR-II; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japonska), opremljeno z vodo in acetonitrilom kot mobilno fazo s pretokom 2,5 ml min−1, zaznano pri 280 nm.

Trije vrhovi iz F3, eluirani pri 9,55, 13,66 in 16,47 min, in štirje vrhovi iz F6, eluirani pri 11,56, 12,20, 12,75 in 15.03 min kot brezbarvne bele snovi, od tega inhibitorne aktivnost je bila zaznana v petih frakcijah vrhov, eluiranih pri 9,55 in 16,47 min iz F3 ter 11,56, 12,75 in 15.03 min (dodatni podatki) iz F6 (slika 5). Izolirane spojine (~10 mg) smo raztopili v MeOH-d4 in nato podvrgli spektralni analizi. Spektri jedrske magnetne resonance (NMR) so bili posneti na BRUKER NMR spektrometrih (500 MHz za 1 H in 125 MHz za 13 C) pri sobni temperaturi. Kemični premiki (δ) so bili zabeleženi kot deli na milijon (ppm) glede na tetrametilsilan (TMS) kot interni standard. Poskusi z masno spektrometrijo so bili izvedeni na Watersovem masnem spektrometru z uporabo sonde za ionizacijo z elektrosprejem (ESI − MS) pod naslednjimi instrumentalnimi pogoji: Kolona: COSMOSIL 5C18-AR-II, (2 × 150) mm. Topilo A: voda (0,1 odstotka mravljinčne kisline), topilo B: acetonitril, pretok: 4 mL/min, prostornina vbrizga: 100 µL, čas delovanja: 35 minut, časovni program za F3: 75 odstotkov B (0 min) → 75 odstotki B (20 min) → 100 odstotkov B (20,1 min) → 100 odstotkov B (27 min) → 75 odstotkov B (27,1 min) → 75 odstotkov B (35 min). Časovni program za F6: 45 odstotkov B (0 min) → 45 odstotkov B (14 min) → 100 odstotkov B (14,1 min) → 100 odstotkov B (20 min) → 45 odstotkov B (20,1 min) → 45 odstotkov B (25 min). Način črpalke: binarni gradient. Podrobnosti pečice: CTO-20AC, temperatura 40 stopinj. Način ionizacije MS: ES (plus), kapilarna napetost: 4,0 kV, napetost stožca: 20 V, temperatura vira: 120 stopinj, temperatura desolvatacije: 350 stopinj, pretok plina v stožcu: 100 L/h, pretok plina za desolvatacijo: 800 L /h (dodatni podatki).

Antitirozinazno delovanje izoliranih spojin

Izolirane spojine smo raztopili v MeOH pri koncentracijah 5, 10, 30, 50, 100 in 200 μM za vsako spojino. Aktivnost proti tirozinazi je bila določena z uporabo prej opisanega postopka.

Intracelularna inhibicija tirozinaze in melanogeneze z izoliranimi spojinami

Kultura celic

Celice melanoma B16F10 smo gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM), dopolnjenem z 10 odstotki toplotno inaktiviranega fetalnega govejega seruma (FBS) in 1 odstotkom penicilina (10,000 U/mL)/streptomicina (100 ug/mL) pri 37 stopinjah v vlažnem ozračju, ki vsebuje 5 odstotkov CO2.

Viabilnost celic

Celice B16F10 so bile nanesene z gostoto 5 × 104 celic/vdolbinico v 96-ploščo z vdolbinicami. Po 24 urah smo celice izpostavili različnim koncentracijam izolirane spojine in jih inkubirali dodatnih 48 ur pri 37 stopinjah. Po inkubaciji je bila viabilnost celic določena s testom MTS. Dodali smo 20 mikrolitrov raztopine MTS in inkubirali 60 minut. Po inkubaciji smo določili absorbanco celic pri 490 nm z uporabo bralnika mikroplošč (Benchmark Plus).

Antitirozinazne in antimelanogene aktivnosti izoliranih spojin

Določanje celične vsebnosti melanina in testi aktivnosti tirozinaze so bili izvedeni, kot je opisano prej [31], z majhnimi spremembami. Celice melanoma B16F10 so bile nanesene z gostoto 5 × 104 celic/vdolbinico v 96-ploščo z vdolbinicami. Po 24 urah smo celice izpostavili različnim koncentracijam izolirane spojine ali arbutina. Po 1 uri smo dodali 100 nM -melanocite stimulirajočega hormona (-MSH) in celice inkubirali dodatnih 48 ur pri 37 stopinjah. Za študijo aktivnosti proti tirozinazi so bile celice nato sprane z ledeno mrzlim fosfatnim pufrom in lizirane s fosfatnim pufrom (pH 6,8), ki je vseboval 1 odstotek Triton-X (90 μL/jamico). Plošče so bile zamrznjene pri -80 stopinjah 30 minut. Po odtajanju in mešanju smo v vsako vdolbinico dodali 10 μl 1-odstotnega L-DOPA. Po inkubaciji pri 37 stopinjah 2 uri smo absorbanco izmerili pri 490 nm. Za test vsebnosti melanina smo celice dvakrat sprali s fosfatnim pufrom in nato raztopili v 100 μL NaOH (1 N), ki je vseboval 10 odstotkov DMSO. Vzorci so bili inkubirani pri 80 stopinjah 1 uro in mešani, da se je raztopil melanin. Optična gostota mešanega homogenata je bila izmerjena pri 490 nm.

Statistična analiza

Rezultati so izraženi kot povprečje ± SEM. Statistične razlike med obema srednjima vrednostma so bile ovrednotene s Studentovim t-testom. Večkratne primerjave so bile izvedene z uporabo enosmerne analize variance, ki ji je sledil Bonferronijev test. Razlike so veljale za pomembne pri P <>

To je naš izdelek proti utrujenosti! Kliknite na sliko za več informacij!

Reference

1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem GH. Hipopigmentirana sredstva: posodobljen pregled bioloških, kemičnih in kliničnih vidikov. Pigment Cell Res. 2006; 19: 550–71.

2. Loizzo MR, Tundis R, Menichini F. Naravni in sintetični inhibitorji tirozinaze kot sredstva proti porjavenju: posodobitev. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2012; 11: 378–98.

3. Lin YS, Chen HJ, Huang JP, Lee PC, Tsai CR, Hsu TF, et al. Kinetika inhibitorne aktivnosti tirozinaze z uporabo ekstraktov listov Viti's vinifera. Biomed Res Int. 2017: 5232680.

4. Manini P, Napolitano A, Westerhof W, Riley PA, d' Ischia M. Reaktivni orto-kinon, ki nastane z oksidacijo monobenzona, kataliziranega s tirozinazo, sredstva za depigmentacijo kože: reakcije samospajanja in tiolne konjugacije ter možne posledice za melanocite toksičnost. Chem Res Toxicol. 2009; 13: 1398–405.

5. Couteau C, Coiffard L. Pregled sredstev za beljenje kože: zdravila in kozmetični izdelki. Kozmetika. 2016; 3:27.

6. Al-Saleh I, Shinwari N, El-Doush I, Billedo G, Al-Amodi M, Khogali F. Primerjava ravni živega srebra v različnih tkivih albino in pigmentiranih miši, zdravljenih z dvema različnima znamkama živosrebrnih krem ​​za posvetlitev kože. Biokovine: Int J vloga Met ioni Biol, Biochem, Med. 2004; 17: 167–75.

7. Gopinath H, Karthikeyan K. Kurkuma: začimba, kozmetika in zdravilo. Indijski J Dermatol Venereol Leprol. 2018; 84: 16–21.

8. Vaughn AR, Branum A, Sivamani RK. Učinki kurkume (Curcuma longa) na zdravje kože: sistematičen pregled kliničnih dokazov. Phytother Res. 2016; 30: 1243–64.

9. Baliga MS, Katiyar SK. Kemoprevencija fotokarcinogeneze z izbranimi prehranskimi rastlinami. Photochem Photobio Sci. 2006; 5: 243–53.

10. Akter J, Hossain MA, Sano A, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Protiglivično delovanje različnih vrst in sevov kurkume (Curcuma spp.) Proti Fusarium Solani Sensu Lato. Pharm Chem J. 2018; 52: 292–7.

11. Akter J, Islam MZ, Hossain MA, Kawabata S, Takara K, Nguyen H, et al. Od endotelija neodvisna in od kalcijevih kanalov odvisna sprostitev prašičje cerebralne arterije z različnimi vrstami in sevi kurkume. J Tradit Complement Med. 2018; 9: 297–303.

12. Akter J, Takara K, Islam MZ, Hossain MA, Sano A, Hou DX. Izolacija in strukturna pojasnitev protiglivičnih spojin iz Curcuma amada. Azijski Pac J Trop Med. 2019; 12: 123–9.

13. Akter J, Hossain MA, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Antioksidativna aktivnost različnih vrst in sort kurkume (Curcuma spp): izolacija aktivnih spojin. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharm. 2019; 215: 9–17.

14. Khunlad P, Tundulawessa Y, Supasiri T, Chutrtong W. Zaviralna aktivnost tirozinaze kurkuminoidov iz prahu kurkume (Curcuma longa Linn.). J JZU Sci. 2008; 24: 125–39.

15. Giang PM, Son PT. Izolacija seskviterpenoidov iz korenike vietnamske kurkume aromatične Salisb. J Chem. 2000; 38: 96–9.

16. Asem SD, Laitonjan SW. Raziskava razmerja med strukturo in nelinearnostjo zederona iz korenike Curcuma caeca Roxb. Ind J Chem. 2012; 51: 1738–42.

17. Faiz Hossain C, Al-Amin M, Rahman KM, Sarker A, Alam MM, Chowdhury MH, et al. Analgetično načelo iz Curcuma amada. J Etnofarmakol. 2015; 163: 273–7.

18. Ahmed Hamdi OA, Syed Abdul Rahman SN, Awang K, Abdul Wahab N, Looi CY, Thomas NF, Abd Malek SN. Citotoksične sestavine iz korenin Curcuma zedoaria. Sci World J. 2014; 2014: 321943.

19. Makabe H, Maru N, Kuwabara A, Kamo T, Hirota M. Protivnetni seskviterpeni iz Curcuma zedoaria. Nat Prod Res. 2006; 20: 680–5.

20. Kikuzaki H, Nakatani N. Ciklični diarilheptanoidi iz korenin Zingiber officinale. Fitokemija. 1996; 43: 273–7.

21. Dekebo A, Dagne E, Sterner O. Furanosesquiterpenes iz Commiphora sphaerocarpa in sorodni nečistoči prave mire. Fitoterapija. 2002; 73: 48–55.

22. Joshi SC, Mathela CS. Antioksidativne in antibakterijske aktivnosti eteričnega olja listov in njegovih sestavin furanodienona in curzerenona iz Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. bivši kavelj. f. Pharmacogn Res. 2012; 4: 80–4.

23. Yang FQ, Li SP, Zhao J, Lao SC, Wang YT. Optimizacija pogojev GC-MS na podlagi ločljivosti in stabilnosti analitov za hkratno določanje devetih seskviterpenoidov v treh vrstah korenike kurkume. J Pharm Biomed Anal. 2007; 43: 73–82.

24. Li YW, Zhu GY, Shen XL, Chu JH, Yu ZL, Fong WF. Furanodienon zavira celično proliferacijo in preživetje z zaviranjem signalizacije ER v celicah MCF-7 človeškega raka dojke. J Cell Biochem. 2011; 112: 217–24.

25. Tao QF, Xu Y, Lam RY, Schneider B, Dou H, Leung PS, et al. Diarilheptanoidi in monoterpenoid iz korenin Zingiber officinale: antioksidativne in citoprotektivne lastnosti. J Nat Prod. 2008;71:12–17.

26. Yokosuka A, Mimaki Y, Sakagami H, Sashida Y. Novi diarilheptanoidi in diarilheptanoidni glukozidi iz korenin Tacca chantrieri in njihova citotoksična aktivnost. J Nat Prod. 2002; 65: 283–9.

27. Jiang JL, Jin XL, Zhang H, Su X, Qiao B, Yuan YJ. Identifikacija protitumorskih sestavin v kurkuminoidih iz Curcuma longa L. na podlagi razmerja med sestavo in aktivnostjo. J Pharm Biomed Anal. 2012; 70: 664–70.

28. Marrot L, Meunier JR. Fotopoškodbe DNK kože in njihove biološke posledice. J Am Acad Dermatol. 2008; 58: 139–48.

29. Policegoudra RS, Abiraj K, Channe Gowda D, Aradhya SM. Izolacija in karakterizacija antioksidativne in antibakterijske spojine iz korenike mango ingverja (Curcuma amada Roxb.). J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2007; 852: 40–8.

30. Tadtong S, Viriyaroj A, Vorarat S, Nimkuntat S, Suksamrarn S. Antitirozinaza in antibakterijske aktivnosti ekstrakta perikarpa mangostina. J Health Res. 2009; 23: 99–102.

31. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein zavira melanogenezo z aktivacijo signalne poti ERK. Int J Mol Med. 2010; 25: 923–7.