Antioksidativni, antimelanogeni in proti gubam učinki Phellinus Vaninii

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

1. Uvod

Prosti radikaliin reaktivne kisikove vrste (ROS) so na splošno nestabilne in zelo reaktivne kemične vrste. V glavnem izvirajo iz encimskih in neencimskih presnovnih poti v celicah človeškega telesa prek mitohondrijskega elektronskega transportnega sistema dihanja, fagocitoze, sinteze prostaglandinov in sistema endoplazmatskega retikuluma [1]. Vendar prosti radikali in ROS nastajajo tudi zaradi izpostavljenosti eksogenim virom, vključno s težkimi kovinami, tobačnim dimom, kemikalijami in industrijskimi onesnaževalci [2]. Poročali so, da povzročajo različne bolezni, kot so staranje, bolezni srca in ožilja, bolezni dihal, sladkorna bolezen, revmatizem in bolezni jeter [3].

Ksantin oksidaza (XO) katalizira oksidacijo hipoksantina v ksantin in nadalje pretvori ksantin v sečno kislino. Za protin je značilna povišana koncentracija sečne kisline (hiperurikemija) v krvi, ki vodi do odlaganja kristalov sečne kisline v sklepih, kar povzroča boleča vnetja, in 5–30 odstotkov svetovnega prebivalstva trpi za protinom, kar velja za biti pomemben dejavnik tveganja za zdravje ljudi [4,5]. Za zdravljenje protina se običajno uporabljajo zaviralci XO, ki znižujejo koncentracijo sečne kisline v plazmi [6]. Čeprav se alopurinol, zaviralec XO, uporablja za zdravljenje protina, je bil nedavno razvit nov zaviralec XO, febuksostat. Vendar ima zdravilo veliko stranskih učinkov, vključno s hepatitisom, nefropatijo in alergijskimi reakcijami [7]. Tako se je nadaljevalo iskanje novih zaviralcev XO z dobrim terapevtskim delovanjem in manjšimi stranskimi učinki.

Tirozinaza je oksidativni encim, ki omejuje hitrost in je običajno prisoten v rastlinah, mikroorganizmih in živalih. Tirozinaza je vključena v sintetične poti melanina s hidroksilacijo L-tirozina v 3,4-dihidroksifenilalanin (DOPA) in pretvorbo DOPA v dopakinon [8]. Melanin proizvajajo melanociti melanosomov in ima pomembno vlogo pri obrambi povrhnjice pred škodljivimi učinki ultravijoličnega (UV) sevanja sončne svetlobe. Hiperpigmentacija kože, ki je posledica povečane aktivnosti sintetičnega encima melanina zaradi čezmerne izpostavljenosti UV-sevanju, lahko povzroči dermatološke motnje, vključno z melazmo, vitiligom in lentigom [9, 10]. V zadnjem času so zaviralci tirozinaze postali pomembni za preprečevanje težav s pigmentacijo in drugih zdravstvenih motenj, povezanih z melaninom. Ker veliko žensk raje posvetli svoje temne kožne madeže, sta se medicinska in kozmetična industrija osredotočili na zaviralce tirozinaze za zdravljenje hiperpigmentacije kože [11]. Za reševanje teh težav so bile kot sredstva za beljenje kože razvite organske spojine, ki izvirajo iz mikroorganizmov in rastlin, kot so kojična kislina, arbutin, azelainska kislina, gentizinska kislina in druge [12]. Učinkovitost belilnih spojin je določena z inhibicijo tirozinaze v brezceličnih sistemih ali z inhibicijo celične tirozinaze, novi viri inhibitorjev tirozina iz rastlin in mikroorganizmov pa se nenehno pregledujejo [13].

Staranje kože je biološko neizogiben proces živih organizmov, ki ga spodbujajo tako notranji kot zunanji dejavniki. Intrinzično staranje kože, imenovano tudi od starosti odvisno staranje ali kronološko staranje, povzročajo notranji fiziološki dejavniki telesa, medtem ko ekstrinzično staranje povzročajo številni zunanji dejavniki, vključno z izpostavljenostjo kože UV-sevanju, kajenjem cigaret, onesnaženim zrakom. , itd. Ti dejavniki lahko povzročijo gube, pigmentacijo in spremembe v debelini kože [14]. Koža je mehko zunanje tkivo, ki ga sestavljajo epidermalno, dermalno in podkožno tkivo. Najbolj zunanji del kože je zunajcelični matriks (ECM) in je sestavljen iz kolagena in elastina [15]. Kolagen zagotavlja elastičnost, moč in prožnost kože. Ohranja tudi strukturni okvir kože in igra ključno vlogo pri ohranjanju normalnih celičnih funkcij v morfogenezi kože [16]. Elastin je ključna beljakovina, ki je prisotna v vezivnem tkivu ECM in zagotavlja elastičnost kože. Kolagenaza, od cinka odvisna endopeptidaza, je sposobna razgraditi komponente ECM, zlasti kolagen tipa 1. Elastaza, encim proteaza, razgrajuje elastin in kolagen ter določa mehanske in strukturne lastnosti vezivnega tkiva ECM [17]. Zato je zaželeno razviti farmakološke zaviralce za preprečevanje staranja kože, kot sta povešanje kože in gubanje.

Gobe ​​se že tisočletja uporabljajo kot dober vir hrane in tradicionalna ljudska medicina v mnogih različnih državah. Njihova plodna telesa vsebujejo biološko aktivne presnovke z visoko medicinsko vrednostjo, vključno z b-glukani, polisaharidi, polifenoli, flavonoidi, terpenoidi in drugimi organskimi spojinami, ki zagotavljajo imunsko stimulativno, protitumorsko, anti-hiperglikemično, anti-hiper- holesterolemične, hepatoprotektivne in zaviralne aktivnosti [18–20].

Phellinus vaninii, splošno znan kot "sanghuang", spada med Basidiomycota, Aphyllophorales, Hymenochaetacae in je razširjen v vzhodni Aziji in Rusiji [21]. Več vrst gob iz rodu Phellinus, vključno s Ph. baumi, Ph. gilvus, Ph. linteus, Ph. merrillii in Ph. pini, so proučevali glede njihovega potencialnega medicinskega antioksidanta, antidiabetika, antihiperlipidemikov, protimikrobno in protitumorsko delovanje [22,23].

Čeprav je Ph. vaninii na voljo v Koreji, obstaja le nekaj poročil o njegovih zdravilnih učinkih [24]. Zato je bil namen te študije oceniti antioksidativne, anti-ksantin-oksidazne, anti-melanogene in proti gubam učinke metanola in vroče vode izvlečkov plodov Ph. vaninii.

2. Materiali in metode

2.1. Kemikalije in reagenti

Butiliran hidroksitoluen (BHT), 1,1-difenil-2- pikril-hidrazi (DPPH), dimetil sulfoksid, (DMSO) ksantin oksidaza, tirozinaza, L-3,4-dihidroksifen -lalanin (DOPA), ksantin oksidaza, alopurinol, kojična kislina, arbutin, kolagenaza in prašičja pankreasna elastaza so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, ZDA), vse druge kemikalije in topila, ki se uporabljajo za študijski poskusi so bili analitične stopnje.

2.2. Ekstrakt gob

Plodna telesa Ph. vaninii so bila pridobljena z Inštituta za raziskovanje gob Gyeonggi Agricultural Technology Institute v Koreji. Plodna telesa so bila posušena na zraku (45 stopinj 48 ur) in fino zdrobljena. Za pripravo metanolnega ekstrakta (ME) smo 20 g praška v 400 ml 80-odstotnega metanola hranili v orbitalnem stresalniku (125 vrt/min) 24 ur pri 25 stopinjah. Raztopino smo filtrirali skozi filtrirni papir. Za pridobitev toplovodnega ekstrakta (HE) smo enako količino praška kuhali 3 ure s 400 ml deionizirane destilirane vode in filtrirali skozi filtrirni papir. Nato smo preostali ostanek dvakrat ekstrahirali s 400 ml 80-odstotnega metanola ali vroče vode, kot je opisano zgoraj. Nato smo združene ekstrakte uparili do suhega pri 40 stopinjah in preostalo vodo odstranili z liofilizatorjem.

Izvleček Cistanche

2.3. Skupna vsebnost fenolov in flavonoidov

Skupna vsebnost fenolov v ME in HE je bila določena z rahlo modifikacijo Folin-Ciocalteu testa [25]. 1 ml alikvota ME in HE smo dodali k 1 ml 10-odstotne raztopine Folin-Ciocalteu. Raztopino smo vrtinčili in pustili 3 minute pri 25 stopinjah. Nato 3 ml 2-odstotnega natrijevega karbonataDodali smo raztopino (Na2CO3) in vzdrževali 2 uri pri 25 C. Absorbanco smo izmerili s spektrometrom pri 760 nm. Celotna vsebnost fenolov je bila izražena kot mg ekvivalentov galne kisline (GAE).

Celotna vsebnost flavonoidov je bila izmerjena z rahlo spremenjenim kolorimetričnim testom z aluminijevim kloridom (AlCl3) [26]. Alikvot (1 ml) ME in HE smo raztopili v 1 ml deionizirane vode. To raztopino (1 mL) smo dodali 3.0 mL 95-odstotnega alkohola, 0.2 mL 10-odstotnega aluminijevega klorida, 0,2 mL kalijevega acetata (1M), in 5,6 ml deionizirane vode. Nato smo reakcijsko mešanico inkubirali pri 25 stopinjah 40 minut in izmerili absorbanco s spektrometrom pri 415 nm. Celotna vsebnost flavonoidov je bila izražena kot mg ekvivalentov kvercetina (QE).

2.4. Test viabilnosti celic

2.4.1. Kultura celic

Celična linija mišjega melanoma B16-F10 je bila pridobljena iz korejske banke celičnih linij Korejske fundacije za raziskave celičnih linij, Seul, Koreja. Celice so bile kultivirane v Dulbeccovem modificiranem Eagle's Media (DMEM), dopolnjenem z 10 odstotki toplotno inaktiviranega fetalnega govejega seruma (FBS) in 1 odstotkom penicilin-streptomicina pri 37 stopinjah v vlažnem inkubatorju s 5 odstotki atmosferskega CO2.

2.4.2. Viabilnost celic

Učinek ME in HE na viabilnost celic B{{0}}F10 celic je bil ocenjen z MTT testom [27]. Celice (5 104) smo gojili v 24-plošči z vdolbinicami in inkubirali 24 ur pri 37 stopinjah. Nato smo celice obdelali z različnimi koncentracijami ME in HE (25–750 mg/mL) in jih inkubirali 48 ur. Nato je bila vsaka vdolbinica dopolnjena z 200 ml raztopine MTT (0, 5 mg / ml) in inkubirana 4 ure v temi. Nastale obarvane kristale formazana smo raztopili v 200 ml DMSO in izmerili absorbanco z bralnikom mikroplošč pri 570 nm.

2.5. Antioksidativni test

2.5.1. Dejavnost odstranjevanja DPPH

Učinek odstranjevanja radikalov ME in HE iz plodov Ph. vaninii je bil določen z uporabo DPPH testa [28] z manjšimi modifikacijami. Na kratko, 1 ml različnih koncentracij ME in HE (0.125–2.0 mg/mL) smo zmešali z 1 ml DPPH (0.1 mM) v metanolu. Zmes stresamo in pustimo 30 minut pri 25 stopinjah. Absorbanco smo izmerili s spektrofotometrom pri 517 nm. Učinek odstranjevanja radikalov DPPH je bil izračunan po naslednji formuli:

Odstotek aktivnosti lovljenja radikalov DPPH=[ (Absc—Abss) / Absc ] × 100,

kjer Absc predstavlja absorbanco kontrole nosilca in Abss predstavlja absorbanco vzorca. BHT je bil uporabljen kot referenčni standard.

2.5.2. Zaviranje lipidne peroksidacije

Inhibicijska aktivnost ME in HE na peroksidacijo lipidov iz plodov Ph. vaninii je bila ocenjena z uporabo predhodno opisane metode [29] z manjšimi spremembami. Na kratko, v epruveto smo dodali 250mL homogenata jajčnega rumenjaka (10 odstotkov v destilirani vodi), 50mL vsakega ME in HE ter 200mL destilirane vode . Dodali smo petindvajset mililitrov FeSO4 (0,07 M) in inkubirali 30 minut pri 25 C. Nato 750 ml 20-odstotne ocetne kisline (pH 3,5) in 750 ml 0,8-odstotne tiobarbiturne kisline (TB) v 1,1-odstotnem natrijevem dodecilu. dodali smo sulfat (SDS) s 25 ml 20-odstotne trikloroocetne kisline (TCA) in mešanico vrtinčili in inkubirali v vodni kopeli 60 minut pri 100 C. Po ohlajanju na 25 C smo dodali 3,0 ml 1- V vsako epruveto smo dodali butanol in jih centrifugirali 10 minut pri 3000 obratih na minuto. Absorbanco raztopine smo izmerili s spektrofotometrom pri 532 nm. Zaviralni učinek peroksidacije lipidov je bil izračunan po naslednji formuli:

Inhibicija lipidne peroksidacije (odstotki)=[(Absc – Abss)/Absc] × 100,

kjer Absc predstavlja absorbanco kontrolnega nosilca in Abss predstavlja absorbanco preskusnega vzorca. BHT je bil uporabljen kot referenčni standard.

2.5.3. Aktivnost lovljenja hidroksilnih radikalov

Učinek ME in HE na lovljenje hidroksilnih radikalov iz plodov Ph. vaninii je bil izmerjen z uporabo objavljene metode [30] z manjšimi modifikacijami. Na kratko, 0.5mL različnih koncentracij ME in HE (0.125–2.0mg/mL) smo inkubirali v raztopini, ki je vsebovala 10{ {34}}mL 2,8 mM 2-deoksiriboze v fosfatnem pufru (10 mM, pH 7,4), 200 mL FeCl3 (200 mikroM)-EDTA (1,04 mikroM) (1:1 v/v), 100 mL H2O2 (1,0 mM) in 100 ml askorbinske kisline (1,0 mM). Količino razgradnje deoksiriboze smo izmerili po dodatku 1,0 ml 1 % TBA, čemur je sledila inkubacija pri 100 C 20 minut. Absorbanco smo izmerili na spektrofotometru pri 532 nm. Zaviralni učinek odstranjevanja hidroksilnih radikalov je bil izračunan po naslednji formuli:

Čiščenje hidroksilnih radikalov (odstotki)=[(Absc – Abss) / Absc] × 100

kjer Absc predstavlja absorbanco kontrolnega nosilca in Abss predstavlja absorbanco preskusnega vzorca. BHT je bil uporabljen kot referenčni standard.

2.6. Inhibicija ksantin oksidaze

Zaviralna aktivnost ksantin oksidaze (XO) ME in HE iz plodov Ph. vaninii je bila izmerjena z uporabo ksantina kot substrata po objavljeni metodi z manjšimi modifikacijami [31]. Alikvot 1 ml različnih koncentracij ME in HE (0.5–8.0 mg/mL) je bil dodan 2,9 mL fosfatnega pufra (pH 7,5) in 0 .1 ml raztopine encima ksantin oksidaze (0.1 enot/mL v fosfatnem pufru pH 7,5) in predhodno inkubiramo pri 25 C 15 minut. Nato smo sprožili reakcijo z dodatkom 2 mL raztopine substrata (150 mM ksantina v pufru). Zmes smo inkubirali 30 minut pri 25 °C in reakcijo zaključili z dodatkom 1 mL 1 N HCl. Absorbanco smo izmerili s spektrofotometrom pri 290 nm. Kot referenčni standard je bil uporabljen alopurinol. Zaviranje ksantin oksidaze je bilo izračunano po naslednji formuli:

Inhibicija ksantin oksidaze (odstotek)=[(A–B)–(C–D) / (A–B)] × 100,

kjer je A aktivnost encima brez ekstrakta, B je kontrola A brez ekstrakta in encima; C je aktivnost ekstrakta z XO, D je aktivnost ekstrakta brez XO.

2.7. Antimelanogeni učinki

2.7.1. In vitro inhibicija tirozinaze

Inhibicijska aktivnost gobjih izvlečkov na tirozinazo je bila določena z uporabo objavljene metode [32] z rahlo spremembo. Na kratko, reakcijske mešanice smo pripravili z dodatkom 40mL tirozinaze (31 enot/mL) k 40mL različnih koncentracij ME in HE (0. 125–2,0 mg/ml), 40 ml 1,5 mM L-tirozina in 80 ml 0,1 M fosfatnega pufra (pH 6,8). Nato smo mešanico inkubirali 10 minut pri 37 C. Absorbanco smo izmerili z čitalcem mikroplošč pri 475 nm. Zaviranje tirozinaze je bilo izračunano po naslednji formuli:

Inhibicija tirozinaze (odstotki)=[(Absc – Abss) / Absc] × 100,

kjer Absc predstavlja absorbanco kontrolnega nosilca in Abss predstavlja absorbanco preskusnega vzorca. BHT je bil uporabljen kot referenčni standard.

Cistanche je zaviralec tirozinaze.

2.7.2. In vitro inhibicija avtooksidacije DOPA

Inhibicijska aktivnost L-DOPA avtooksidacije ekstraktov gob je bila določena z nekoliko spremenjeno metodo [33]. Na kratko, reakcijske zmesi smo pripravili z dodatkom 40mL tirozinaze (31 enot/mL) k 4{{10}} mL različnih koncentracij ME in HE (0,125– 2,0 mg/mL) in predhodno inkubirali 10 minut pri 37 C. Nato smo reakcijo sprožili z dodatkom 40 mL 2,5 mM raztopine L-DOPA (v fosfatnem pufru) in 80 mL fosfatnega pufra (0,1 M, pH). 6.8) in inkubiramo 10 minut pri 37 C v temi. Absorbanco smo izmerili z čitalcem mikroplošč pri 475 nm. Odstotek inhibicije avtooksidacije L-DOPA je bil izračunan po naslednji formuli:

Inhibicija avtooksidacije DOPA (odstotki)=[(Absc – Abss)/Absc] × 100,

kjer Absc predstavlja absorbanco kontrolnega nosilca in Abss predstavlja absorbanco preskusnega vzorca. Kojična kislina je bila uporabljena kot referenčni standard.

2.7.3. Aktivnost celične tirozinaze

Aktivnost celične tirozinaze v celicah B{{0}}F10 je bila izmerjena z uporabo rahle modifikacije objavljene metode [34]. Celice (5 105 celic/jamico) smo gojili v 96-ploščah z jamicami. Po obdelavi z različnimi koncentracijami vzorcev (25–500 mg/mL) 24 ur smo celice melanoma sprali s PBS in lizirali z 0,1 M fosfatnim pufrom (pH 6,8), ki je vseboval 1 odstotek Tritona X-100. Celice smo hranili na ledu 10 minut in lizate centrifugirali pri 10,000 g 10 minut. Nato smo določili vsebnost beljakovin v supernatantu z metodo Braford, z govejim serumskim albuminom (BSA) kot standardom. Za merjenje aktivnosti tirozinaze smo v vsako vdolbino 96-plošče z vdolbinicami dodali 100 ml raztopine celičnega lizata in 100 ml 2,5 mM L-DOPA (v istem fosfatnem pufru). Po 1-urni inkubaciji pri 37 °C smo absorbanco izmerili pri 475 nm z uporabo bralnika mikroplošč. Aktivnost celične tirozinaze smo izračunali po naslednji formuli:

Aktivnost celične tirozinaze (odstotki)=(Abss/Absc) × 100,

kjer Abss predstavlja absorbanco vzorca in Absc predstavlja absorbanco kontrole. Arbutin je bil uporabljen kot referenčni standard.

2.7.4. Celična sinteza melanina

Merjenje vsebnosti melanina v celicah melanoma B{{0}}F10, obdelanih z različnimi koncentracijami izvlečkov gob, je bilo izvedeno z uporabo metode, ki so jo objavili Hosoi et al. [35]. Celice (4 × 104 celic/jamico) smo gojili v 96-plošči z jamicami v DMEM. Po 24 urah inkubacije smo celice 72 ur obdelali z ME in HE (25–500 mg/mL), ki sta vsebovali 0,4 mM melanocite stimulirajočega hormona (MSH). Celice smo pobrali z dodatkom 300 ml Tritona 100 (1 odstotek, PBS), centrifugirali 5 minut pri 3000 obratih na minuto in odstranili supernatant. Nato smo celičnim peletom dodali 100 mL 1N NaOH in 200 mL DMSO (10 odstotkov) in jih hranili 1 uro pri 60 C. Absorbanco raztopine smo izmerili z uporabo čitalnika mikroplošč pri 405 nm. Ugotavljali smo vpliv ME in HE na sintezo melanina. Arbutin je bil uporabljen kot referenčni standard.

Cistanche zavira melanin.

2.8. Učinki proti gubam

2.8.1. Zaviranje elastaze

Učinek ME in HE na zaviranje elastaze je bil ocenjen s prej opisanimi metodami [36]. Elastazo trebušne slinavke prašičev (PE–EC. 3.4.21.36) smo raztopili v sterilni vodi, da smo dobili osnovno raztopino 3,33 mg/mL. Substrat, N-sukcinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (AAAPVN), je bil raztopljen v 0.2M Tris-HCl pufru (pH 8.0). Reakcija je bila izvedena v 96-mikroplošči z vdolbinicami. Vsaka vdolbinica je vsebovala 120mL 0.2M Tris-HCl pufra, 50mL ekstrakta gobe (0,125–2,0 mg/mL) v Tris-HCl pufru, 30 mL PE in 50 mL 1,6 mM AAAPVN. Testni ekstrakt je bil predhodno inkubiran pri 25 °C 15 minut pred dodajanjem substrata. Absorpcijo smo izmerili z čitalcem mikroplošč pri 402 nm. Odstotek inhibicije esteraze je bil izračunan na naslednji način:

Inhibicija esteraze (v odstotkih)=[(Absc – Abss)/Absc] × 100,

kjer Absc predstavlja absorbanco kontrolnega nosilca in Abss predstavlja absorbanco preskusnega vzorca. EGCG je bil uporabljen kot referenčni standard, medtem ko je bila destilirana voda uporabljena kot negativna kontrola.

2.8.2. Zaviranje kolagenaze

Zaviralni učinek ME in HE iz plodov Ph. vaninii na kolagenazo je bil raziskan z uporabo predhodno opisanih metod [37] z nekaterimi modifikacijami. Kolagenazo iz Clostridium histolyticum (ChC–EC.3.4.23.3) smo raztopili v 50mM 1,44 U/mL tricin pufra (pH 7,8). Substrat, 4-fenilazobenziloksikarbonil-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg trifluoroacetatna sol (PZ-peptid), smo raztopili v 2,5 mM tricin pufru. Petindvajset mikrolitrov izvlečkov gob (0.125 do 2,0 mg/mL) smo inkubirali z 20 ml encima v 155 ml pufra 15 minut pri 37 °C, preden smo dodali 50 ml PZ-peptida za sprožitev reakcijo 60 minut pri 37 °C. Reakcijo ustavimo z dodatkom 1 mL citronske kisline (3 %). Nato smo dodali 5 mL etil acetata in raztopino močno pretresli ter pustili stati 10 minut. Absorbanco supernatanta smo izmerili pri 320 nm z uporabo bralnika mikroplošč. Kot referenčni standard je bil uporabljen EGCG. Zaviranje kolagenaze je bilo izračunano po naslednji formuli:

Inhibicija kolagenaze (odstotki)=[(Absc – Abss)/Absc] × 100,

kjer Absc predstavlja absorbanco kontrolnega nosilca in Abss predstavlja absorbanco preskusnega vzorca. Kot referenčni standard je bil uporabljen EGCG.

2.9. Statistična analiza

Vsi podatki so bili izraženi kot povprečja ± standardne deviacije (SD) in za statistično analizo je bil uporabljen SPSS V.13 (SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA). Za primerjavo povprečij med skupinami smo uporabili enosmerno analizo variance, ki ji je sledil Duncanov test večkratnega razpona. Razlike med sredstvi pri 5 odstotkih (str<.05) level="" were="" considered="" statistically="">

3. Rezultati in razprava

3.1. Skupna vsebnost fenolov in flavonoidov

Skupne vsebnosti fenolov in flavonoidov v ME in HE so predstavljene v tabeli 1. Rezultati so pokazali, da so bile skupne vsebnosti fenolov in flavonoidov v ME 31,67 mg GAE/g oziroma 6,83 mg QE/g, medtem ko so bile vsebnosti HE 16,33 mg. GAE/g oziroma 4,50 mg QE/g. Vamanu in Nita [38] sta poročala, da je bila skupna vsebnost fenolov metanolnih in toplovodnih ekstraktov iz plodov Boletus edulis 18,96 mg GAE/g oziroma 17,22 mg GAE/g, medtem ko je vsebnost flavonoidov v metanolnem ekstraktu iz Boletus aestivalis plodov Leccinum carpini pa 1,53 mg CE/g oziroma 1,48 mg CE/g [39]. Naši rezultati kažejo, da je bila skupna vsebnost fenolov in flavonoidov v izvlečkih gob višja od vsebnosti zgoraj omenjenih gob in je morda prispevala k izboljšanju antioksidantov povezanega anti-ksantin oksidaze, antimelanogenega in kožnega -aktivnosti proti gubam.

3.2. Viabilnost celic

Da bi ugotovili, ali so izvlečki iz sadnih teles Ph. vaninii pokazali citotoksični učinek na celice mišjega melanoma B16- F10, so bile celice 72 ur obdelane z različnimi koncentracijami ME in HE, viabilnost celic pa je bila določena z MTT esej. Sposobnost preživetja celic, obdelanih z ME in HE, je bila od 99,74 do 85,33 odstotka oziroma od 100,67 do 88,33 odstotka pri 50 do 750 mg/mL (slika 1). Viabilnost celic se je zmanjšala z naraščajočimi koncentracijami gobjih izvlečkov. Ker je bila sposobnost preživetja celic, zdravljenih s 500 mg/mL ME in HE, več kot 90,33 odstotka oziroma 91 odstotkov, vrednosti IC50 ME in HE pa 4410 mg/mL oziroma 5385 mg/mL, ME in HE nista bili citotoksičen za celice melanoma B16-F10 pri testiranih koncentracijah. Zato so bile izvedene aktivnosti celične sinteze tirozinaze in melanina celic melanoma B16-F10, obdelanih z različnimi koncentracijami izvlečkov gob.

3.3. Antioksidativno delovanje

3.3.1. DPPH učinek odstranjevanja radikalov

Učinki ME in HE na odstranjevanje radikalov DPPH iz plodov Ph. vaninii so se povečali z naraščajočimi koncentracijami ekstrakta. Aktivnosti odstranjevanja radikalov ME in HE pri {{0}},125–2.0 mg/mL so se gibale od 75,83 odstotka do 95,17 odstotka oziroma od 73,33 odstotka do 94,33 odstotka in BHT , pozitivna kontrola, je pokazala dobro čistilno aktivnost (96,19–96,97 odstotka) (slika 2(A)). Čeprav je bila aktivnost odstranjevanja DPPH pri ME in HE nižja od BHT pri koncentracijah v razponu od 0.125 do 0.5 mg/mL, je odstotek inhibicije, opažen pri ME in HE pri 1.{{ 24}}–2,0 mg/ml je bil statistično nepomemben v primerjavi z BHT. Ti rezultati kažejo, da so metanolni in vroči vodni ekstrakti dobro lovili radikale pri višjih testiranih koncentracijah.

Poročali so, da se aktivnost čiščenja DPPH metanolnega izvlečka iz plodov Pleurotus pulmonarius giblje med 25,67 odstotka in 92,73 odstotka pri 0.125 do 2.0mg/mL [40] . Mau et al. [41] so ugotovili, da se učinki metanolnih izvlečkov iz gob Tricholoma giganteum, Grifola frondosa in Hericium erinaceus gibljejo od 63,2 odstotka do 67,8 odstotka pri koncentraciji 6,4 mg/mL. Zato naši eksperimentalni rezultati kažejo, da lahko DPPH lovilna aktivnost ME in HE (0.125–2,0 mg/mL) iz plodov Ph. vaninii zagotovi ustrezno obrambo pred poškodbami zaradi prostih radikalov in ROS.

Slika 2.Antioksidativne aktivnosti izvlečkov metanola in vroče vode iz plodovPhellinus vaninii.

3.3.2. Zaviranje lipidne peroksidacije

Zaviralna aktivnost lipidne peroksidacije ME in HE iz plodov P. vaninii je bila od 44,99 do 66.08 odstotkov in od 41,26 do 64.00 odstotkov pri {{1{{16} }}}.125-2.0mg/mL (slika 2(B)), kar kaže, da so naraščajoče koncentracije gobjih izvlečkov povečale inhibicijo peroksidacije lipidov. Vendar je bil učinek BHT na zaviranje lipidne peroksidacije 90,30 odstotka pri 2,0 mg/mL, kar je bilo bistveno višje (p<.001) than="" those="" of="" me="" and="" he.="" the="" ic50="" values="" of="" me="" against="" lipid="" peroxidation="" from="" wild="" and="" cultivated="" mushrooms="" including="" pleurotus="" ostreatus,="" termitomyces="" robustus,="" pleurotus="" sajor-caju,="" and="" auricularia="" auricula="" were="" 0.15,="" 0.43,="" 0.75,="" and="" 1.51mg/ml,="" respectively="" [42].="" the="" inhibi-="" tory="" effects="" of="" hot="" water="" extracts="" on="" lipid="" peroxida-="" tion="" of="" 14="" different="" edible="" and="" medicinal="" mushroom="" species="" collected="" from="" malaysia="" ranged="" from="" 33.33%="" to="" 57.18%="" at="" the="" concentration="" of="" 10="" mg/ml="" [43].="" in="" this="" study,="" the="" lipid="" peroxidation="" inhibitory="" activity="" of="" me="" and="" he="" from="" ph.="" vaninii="" ranged="" from="" 65.87%="" to="" 78%="" at="" 2.0mg/ml="" and="" their="" ic50="" values="" were="" 0.19="" mg/ml="" and="" 0.17="" mg/ml,="" respectively.="" these="" results="" suggest="" that="" me="" and="" he="" from="" ph.="" vaninii="" fruiting="" bodies="" possessed="" good="" inhibitory="" activity="" toward="" lipid="" peroxidation="" compared="" to="" the="" mushrooms="" described="" above.="" therefore,="" p.="" vaninii="" fruiting="" bodies="" could="" be="" a="" valuable="" antioxidant="">

3.3.3. Učinek lovilca hidroksilnih radikalov

Učinki ločevanja hidroksilnih radikalov ME in HE iz Ph. vaninii so bili v razponu od 75,60 do 98,19 odstotka in 65,21 do 97,55 odstotka pri 0.125 do 2.0 mg/ml koncentracije. medtem ko so se vrednosti BHT gibale od 79,89 do 92,66 odstotka (slika 2(C)). Vendar sta bili vrednosti IC50 ME in HE iz Ph. vaninii 0.115 mg/ml oziroma 0.119, medtem ko je IC5{{4{{46} }}} vrednost BHT je bila 0,111 mg/mL, kar kaže, da so bili učinki ME in HE na lovljenje hidroksilnih radikalov nekoliko nižji od učinkov BHT. Tako sta imela ME in HE iz Ph. vaninii razmeroma dobre in primerljive aktivnosti odstranjevanja hidroksilnih radikalov pri testiranih koncentracijah. Večje aktivnosti lovljenja hidroksilnih radikalov, ugotovljene v ME in HE v tem poskusu, so pokazale, da so ekstrakti učinkovito preprečili razgradnjo 2-deoksiriboze z odstranitvijo hidroksilnih radikalov v preskusni raztopini. Poročali so, da ima metanolni izvleček iz sadnih teles Pleurotus pulmonarius 95,13-odstotni učinek lovljenja hidroksilnih radikalov pri 2,0 mg/mL [40], kar je nižje od tistih pri ME (98,18 odstotka) in HE (97,55 odstotka) iz Ph. vaninii v preskušani koncentraciji. Poročali so, da je učinek metanolnega izvlečka iz sadnih teles gob Hypsizigus ulmarius na lovljenje hidroksilnih kislin 76,67 odstotka pri 1,0 mg/mL [44], medtem ko je bil učinek ME in HE 83.00 odstotkov in 77,17 odstotkov pri 0,25 mg/ml. Naši rezultati skupaj kažejo, da je bil učinek ME in HE iz Ph. vaninii na lovljenje hidroksilnih radikalov boljši kot pri zgoraj omenjenih izvlečkih gob. Zato sta ME in HE iz Ph. vaninii močna lovilca hidroksilnih radikalov, ki ju je mogoče uporabiti za preprečevanje težav, povezanih z ROS.

3.4. Inhibicija ksantin oksidaze

Inhibitorne aktivnosti ME in HE iz Ph. vaninii ksantin oksidaze so se povečale z naraščajočimi koncentracijami. Zaviranje ksantin oksidaze ME in HE pri {{0}},5 do 8.0mg/mL je bilo v razponu od 61,15 odstotka do 88,99 odstotka oziroma od 34,13 odstotka do 84,56 odstotka. Vendar pa je alopurinol, referenčni standard, pokazal odlično zaviralno aktivnost XO od 89,73 do 97,23 odstotka pri enakih testiranih koncentracijah (slika 3). Čeprav sta ME in HE pokazala zmerno inhibitorno aktivnost XO pri nižjih koncentracijah, so izvlečki gob znatno zavirali XO pri višjih koncentracijah. Poročali so, da inhibicija XO z metanolom in ekstrakti vroče vode iz plodnih teles Ph. /mL [45], kar kaže, da je bil inhibitorni učinek ME in HE proti XO primerljiv s tistimi Ph. gilvus.

Flavonoidi, razred polifenolnih spojin, so najpogostejši sekundarni presnovki rastlin in gliv in so poročali, da imajo inhibitorno aktivnost ksantin oksidaze [46]. Zato so lahko višje koncentracije fenolov in flavonoidov, odkrite v ME in HE, prispevale k zaviranju ksantin oksidaze.

3.5. Učinek beljenja kože

3.5.1. In vitro inhibicija tirozinaze

Zaviralne aktivnosti ME in HE na tirozinazo iz plodov Ph. vaninii so se gibale od 55,83 do 96,16 odstotka in od 30.29 do 92,74 odstotka pri 0.125–2.{{ 17}} mg/mL (slika 4(A)) in se je povečeval z naraščajočimi koncentracijami. Vendar je kojična kislina, referenčni standard, pokazala odlično inhibitorno aktivnost tirozinaze med 98,74 in 99,61 odstotka pri {{2{{30}}}}.125–2,0 mg/mL. Rezultati kažejo, da je ME pokazal dober učinek, medtem ko je HE pokazal zmeren učinek pri testiranih koncentracijah. Alam et al. [47] so poročali, da je zaviranje tirozinaze z ekstrakti metanola in vroče vode iz plodov P. salmoneostramineus v razponu od 20,90 odstotka do 63,29 odstotka in od 15,25 odstotka do 49,25 odstotka pri 0,125–1,0 mg/mL, kar kaže, da je zaviranje aktivnosti Ph. vaninii na tirozinazo so bile višje kot pri plodnih telesih P. salmoneostramineus.

Fenolne spojine so spojine aromatskih kislin, ki vsebujejo fenolne obroče in karboksilno kislino. Flavonoidi so skupina polifenolnih spojin. Najdemo jih v številnih rastlinskih in gobjih vrstah. Polifenoli veljajo za substrate za tirozinazo in so največja skupina zaviralcev tirozinaze. Poročali so, da več polifenolov zavira tirozinazo z vezavo na aktivno mesto encima tirozinaze, kar povzroči ireverzibilno inaktivacijo encima s substratom podobno interakcijo [48]. Nekateri flavonoidi so prav tako dokazali zaviralni učinek na tirozinazo s kelacijo bakrovih ionov v tirozinazi [49].

Zato je lahko zaviralni učinek ME in HE na tirozinazo posledica polifenolnih spojin in flavonoidov, ki so prisotni v izvlečkih gob. Antioksidativni učinek ME in HE lahko prispeva tudi k zaviranju aktivnosti tirozinaze.

3.5.2. Zaviranje avtooksidacije DOPA

L-DOPA je eden od prekurzorjev melanina med melanogenezo. L-DOPA se sintetizira iz L-tirozina s tirozinazo hidroksilazo. Tirozinaza lahko tudi pretvori L-DOPA v dopakinon, kar sčasoma povzroči melanin. In vitro, L-DOPA inhibitorne aktivnosti P. vaninii za avtooksidacijo so povzete na sliki 4(B). Inhibicija avtooksidacije L-DOPA z ME in HE je znašala od 38,25 do 78,46 odstotka in od 29,68 do 44,77 odstotka pri 0.125 do 2.0mg/mL, v tem zaporedju. , medtem ko je kojična kislina pokazala odlično inhibitorno aktivnost L-DOPA od 86.14 do 98,72 odstotka pri testirani koncentraciji. Rezultati so pokazali, da ME in HE zmerno zavirata avtooksidacijo L-DOPA. Vendar sta ME in HE pokazala manj inhibitorne aktivnosti na avtooksidacijo L-DOPA, ko je bila L-DOPA uporabljena kot substrat, kot če je bila L-tirozinaza uporabljena kot substrat tirozinaze. Ker tirozinaza uporablja dve različni vezavni mesti za tirozin hidroksilazo in L-DOPA oksidazo, naši eksperimentalni rezultati kažejo, da je selektivna učinkovitost tirozinaze na dveh različnih substratih med melanogenezo.

3.5.3. Aktivnost celične tirozinaze

Znotrajcelično aktivnost tirozinaze smo določili po obdelavi celic z različnimi koncentracijami ME in HE iz sadnih teles Ph. vaninii. Učinek ME in HE na aktivnost tirozinaze celic melanoma B10-F10 je znašal od 96,94 do 61,14 odstotka oziroma od 98,12 do 84,16 odstotka pri 25–500 ug/ml, medtem ko je arbutin pokazal tirozinazno aktivnost 98,52 do 58,12 odstotka pri testirani koncentraciji (slika 5(A)), kar kaže, da je bila inhibicija tirozinaze arbutina višja kot pri ME in HE. Rezultati so tudi pokazali, da je bila aktivnost tirozinaze ME višja od aktivnosti HE in da so povečane koncentracije ME in HE povzročile zmanjšano znotrajcelično aktivnost tirozinaze. Čeprav so bili in vitro inhibitorni učinki ME in HE na tirozinazo pri 500 ug/mL 84,39 odstotka oziroma 45,64 odstotka, je bila inhibicija celične tirozinaze v celicah melanoma B16-F10 38.86 odstotkov oziroma 15,24 odstotka, pri isti testirani koncentraciji, kar kaže, da faktorji gobjega ekstrakta, odgovorni za zaviranje tirozinaze, niso mogli učinkovito prodreti v celice. Huang et al. [50] so poročali, da je bila aktivnost celične tirozinaze metanolnega izvlečka iz plodov Agaricus brasiliensis 95,75 odstotka – 67,12 odstotka pri 100–500 ug/ml v celicah melanoma B16-F10, kar nakazuje, da je aktivnost celične tirozinaze Ph. vaninii so bile malo višje kot pri A. brasiliensis pri isti testirani koncentraciji.

Da bi ocenili, ali sta zmanjšana znotrajcelična aktivnost tirozinaze in zmanjšana proizvodnja melanina, opažena v celicah melanoma B16-F10, posledica citotoksičnosti izvlečkov gob, je bil izveden test MTT. V testu MTT so celice melanoma B16-F10, zdravljene z ME in HE, pokazale viabilnost celic od 105 odstotkov do 90,33 odstotkov oziroma od 107 odstotkov do 91 odstotkov pri 50–500 mg/mL, kar kaže, da so izvlečki gob niso bili toksični za celice melanoma B16-F10 pri testiranih koncentracijah (slika 1).

3.5.4. Aktivnost sinteze melanina

Da bi potrdili, ali so dobre inhibitorne aktivnosti celične tirozinaze, odkrite v prejšnjem poskusu, povezane z inhibicijo sinteze melanina v celicah melanoma B16-F10, so dodatno raziskali proizvodnjo melanina v celicah melanoma. Sinteza melanina celic melanoma B16-F10, zdravljenih z ME in HE, je znašala od 71,18 do 27,61 odstotka oziroma od 78,54 do 50,53 odstotka pri 25–500 mg/mL, medtem ko je sinteza melanina z arbutinom znašala od 73,50 odstotka do 35,16 odstotka pri testirani koncentraciji (slika 5(B)). Rezultati študije kažejo, da je bila inhibicija sinteze melanina z arbutinom višja kot pri HE, vendar manjša kot pri ME. Povečane koncentracije izvlečkov gob so povzročile zmanjšano sintezo melanina v celicah melanoma B16-F10. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija sinteze melanina v celicah melanoma B16-F10 z ME bistveno višja kot pri arbutinu, medtem ko je bila inhibicija proizvodnje melanina z HE bistveno manjša kot pri arbutinu. Cha in Kim [51] sta dokazala, da ima fermentirani izvleček Cordyceps militaris 66–47-odstotno sintetično aktivnost melanina pri 1,0–3,0 mg/mL v celicah melanoma B16-F10, kar kaže na zaviralno aktivnost sinteze melanina izvlečkov sadnih teles Ph. vaninii so bile višje kot pri fermentiranem izvlečku Cordyceps militaris. Zato so rezultati študije pokazali, da izvlečki gob ne samo in vitro zavirajo aktivnost tirozinaze in avtooksidacijo L-DOPA, ampak tudi zmanjšajo aktivnost tirozinaze in proizvodnjo melanina v celicah melanoma B16- F10. Naše ugotovitve skupaj kažejo, da se lahko ME in HE iz plodnih teles Ph. vaninii obravnavata kot potencialna nova antimelanogena vira zaščite pred pigmentacijo kože pred ultravijoličnim sevanjem sončne svetlobe.

3.6. Dejavnost kože proti gubam

3.6.1. Zaviranje elastaze

Elastaza, proteaza, je odgovorna za razgradnjo elastina, ki se nahaja v ECM.

Elastaze lahko cepijo elastin, pa tudi druge substrate, kot so kolagen, fibronektin in ECM proteini. Vendar pa je v naravnih razmerah aktivnost elastaze bistvena za razgradnjo tujih beljakovin po poškodbi [52]. Za upočasnitev staranja kože, kot so gube, povešenost in pege, je treba preprečiti razgradnjo proteinov, povezanih z ECM, in s tem zaščititi izgubo elastičnosti kože. Stopnja zaviranja esteraze ME in HE iz plodov Ph. vaninii je bila od 37,23 odstotka do 71,24 odstotka in od 28,99 odstotka do 64,65 odstotka pri 0.125–2.0 mg/ml, medtem ko je EGCG pokazal zaviranje esteraze od 17,93 do 45,31 odstotka pri testirani koncentraciji (slika 6(A)). Stopnja inhibicije elastaze ME in HE se lahko šteje za odlično v primerjavi z EGCG. Kim et al. [53] je poročal, da je izvleček micelija Tricholoma matsutake pokazal, da je inhibitorna aktivnost elastaze za 81,4 odstotka pri 100mg/mL, kar kaže, da so inhibitorni učinki ME in HE iz Ph. vaninii na elastaze nižje kot pri ekstraktu T. matsutake. Choi in Lee [54] sta dokazala inhibicijo elastaze z metanolom in ekstrakti vroče vode iz plodov Coriolus versicolor v razponu od 21,5 odstotka do 35,47 odstotka in od 17,57 odstotka do 25.86 odstotkov pri 1,0 do 3,0 mg/mL. , kar kaže na to, da je bila inhibicija elastaze pri ME in HE višja kot pri plodnih telesih C. versicolor. Rezultati kažejo, da imajo izvlečki gob potencial proti gubam, da preprečijo razgradnjo elastina in kolagena.

3.6.2. Zaviranje kolagenaze

Kolagenaze so metaloproteinaze, ki lahko cepijo različne molekule v celicah in ECM, kot so kolagen, elastin, fibronektin, želatina in laminin. Kolagenaza, uporabljena v tem poskusu, bakterijska kolagenaza (Clostridium histolyticum, ChC), prav tako razgradi ECM [55]. Zato je bila za testiranje antikolagenazne aktivnosti gobjih izvlečkov uporabljena bakterijska kolagenaza. Zaviralne aktivnosti ME in HE na kolagenazo iz plodov Ph. vaninii so se gibale od 41.04 odstotkov do 63.02 odstotkov in od 26,40 odstotkov do 47,33 odstotkov pri 0.125–2,0 mg/ml (slika 6(B)), medtem ko je EGCG zaviral kolagenazo od 17,93 do 45,31 odstotka pri testirani koncentraciji. Rezultati kažejo, da je bil ME odličen inhibitor, medtem ko je HE pokazal zmerne inhibitorne učinke pri testiranih koncentracijah. Cheon et al. [56] so poročali, da je zaviranje kolagenaze z etanolom in ekstrakti vroče vode iz sadnih teles Phellinus linteus v razponu od 3,4 odstotka do 6,8 odstotka oziroma od 33,4 odstotka do 89,6 odstotka pri 0,05–1,0 mg/mL, kar kaže na zaviranje kolagenaze s ME iz Ph. vaninii je bil višji od tistega iz vročevodnega ekstrakta plodnih teles Ph. linteus. Ker sta ME in HE pokazala dobro inhibicijo kolagenaze, lahko izvlečki zaščitijo ECM in kolagen pred razgradnjo, ki jo povzroči fotostaranje. Čeprav je bila večina inhibitornih aktivnosti na elastazo in kolagenazo dokazanih v rastlinah, vključno z belim čajem, zelenim čajem, lubjem murve in plodovi ginka [57,58], je to prvo poročilo o inhibitornih aktivnostih na elastazo in kolagenazo iz izvlečkov sadnih teles. iz Ph. vaninii in lahko predstavlja nov vir sredstva proti gubam.

Skratka, izvlečki sadnih teles iz Ph. vaninii so pokazali dobre antioksidativne, anti-ksantin-oksidazne, tirozinazne, sintezne melanina, elastaze in inhibitorne aktivnosti kolagenaze. Zaviralne aktivnosti ksantin oksidaze, tirozinaze in sinteze melanina bi lahko uporabili kot naravne vire za nadzor protina in povzročiteljev pigmentacije kože, zaviranje elastaze in kolagenaze pa bi lahko bilo dober vir za zdravljenje motenj, povezanih s kožnimi gubami. Nadaljnje raziskave so potrebne za določitev dejavnikov, ki zagotavljajo delovanje proti ksantin oksidazi, proti tirozinazi in proti gubam v izvlečkih iz plodov Ph. vaninii.

Cistanche je sestavina za beljenje kože.

Za več informacij kliknite na sliko.