Antioksidativni učinek kompleksnega delovanja vitamina E in etiltiosulfanilata v jetrih in ledvicah podgan v pogojih oksidativnega stresa, ki ga povzroči Chrome(VI).

Bogdan Kotik^1,*, Ruslana Iskra¹, Vira Lubunets²

Povzetek:Namen naše raziskave je bil raziskati učinkovitost in koristi kompleksnega učinka vitamina E in etiltiosulfanilata (ETS) na stanje pro/antioksidantnega sistema v jetrih inledvicepodgan v pogojih oksidativnega stresa, ki ga povzroča Cr(VI). Podgane smo razdelili v 8 skupin.

Skupine so prejele: I (kontrola) - fiziološko raztopino (150 ul) 7 dni; II – oljna raztopina (1 ml) 14 dni; III, IV, VII, VIII - K2Cr2O7 (2,5 mg Cr(VI)/kg telesne teže (tm)) za 7 (III, IV) in za 14 (VII, VIII); V - vitamin E (20 mg/kg tm) 14 dni; VI, VII, VIII - vitamin E v kompleksu z ETS (100 mg/kg telesne mase) 14 dni. Rezultati kažejo, da je K2Cr2O7 povzročil oksidativni stres, ki ga povzroči Cr(VI), zaradi aktivacije procesov lipidne peroksidacije (LP). Delovanje Cr(VI) 7 dni je povzročilo kompenzacijsko aktivacijo antioksidativnega obrambnega sistema (AOS) v obeh tkivih. Vendar pa je daljše delovanje Cr(VI) spremljalo zmanjšanje aktivnosti encima AOS in vsebnosti GSH. Kompleksni učinek vitamina E in ETS je zmanjšal intenzivnost oksidativnega stresa, ki ga povzroča Cr(VI) v obeh tkivih podgan. Naši rezultati kažejo na pozitivne antioksidativne lastnosti vitamina E in ETS v pogojih toksičnosti Cr(VI).

Ključne besede:podgane; antioksidativni sistem; oksidativni stres; vitamin E; etiltiosulfanilat; kalijev bikromat; peroksidacija.

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Kliknite za cistanche inurduza ledvice

1. Uvod

Aktivna uporaba kroma v industrijske in kmetijske namene je povzročila znatno kopičenje spojin, ki vsebujejo Cr, v okolju [1-3]. Kromove spojine so eno najpogostejših onesnaževal v vodnih in kopenskih ekosistemih [4-6]. Glavne industrije, ki zahtevajo aktivno uporabo spojin, ki vsebujejo Cr, so strojenje usnja, sredstva za zaščito lesa, industrijsko varjenje kovin, kromiranje, kromatiranje in proizvodnja železovega kromata [1]. Krom je naravna kovina, ki jo večinoma najdemo v dveh različnih oblikah: trivalentni krom (Cr(III)) in šestvalentni krom (Cr(VI)). Cr(III) je zadnja stopnja oksidacije kroma. Trivalentna oblika kroma je pogosta v vseh bioloških sistemih, termodinamično stabilna in ima močne lastnosti za tvorbo koordinacijskih spojin. Šestvalentna oblika (Cr(VI)) ima močne toksične in rakotvorne lastnosti in je običajno predstavljena kot kisik vsebujoče spojine kromatov (CrO42-) in dikromatov (Cr2O72-) ​​[1,7]. Visoka toksičnost Cr(VI) spojin je povezana z zmožnostjo enostavne absorpcije in hitrega transporta v celice skozi sulfatne kanale [8,9]. Nato se Cr(VI) po prodoru v celico v več stopnjah reducira v Cr(III). Med procesom redukcije Cr(VI) nastaja veliko število reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) [10,11]. Aktivacija tvorbe ROS vodi v razvoj oksidativnega stresa in poškodbe tkiva. Procese redukcije Cr(VI) spremljajo tudi citotoksičnost, genotoksičnost, rakotvornost in apoptoza prek regulatorne genske modulacije p53 [12- 15]. Sistem AOS je glavna ovira pri protiučinku oksidativnega stresa, ki ga povzroča Cr(VI) [9]. Encimske in neencimske komponente sistema AOS, kot sta flavoencimi, odvisni od GSH in NADPH, spodbujajo in pospešujejo redukcijo visoko toksičnega Cr(VI) v veliko manj toksičnega Cr(III). Po drugi strani encimi, kot so SOD, CAT, GP in neencimski GSH tripeptid, nevtralizirajo številne ROS, ki nastanejo med redukcijo Cr(VI) [16,17]. Vendar pa dolgotrajen oksidativni stres, ki ga povzroči Cr(VI), povzroči izčrpavanje sistemskih virov AOS in povzroči poškodbe celic, tkiv in oksidativnih organov zaradi povečanih prooksidativnih procesov [9,18]. Spojine, ki vsebujejo Cr(VI), kot je kalijev dikromat (K2Cr2O7), v odmerku 8 mg/kg telesne teže povzročajo akutno hepatotoksičnost pri podganah zaradi naraščajočih nekrotičnih in vnetnih procesov ter izčrpavanja virov AOS sistema v jetrnem tkivu živali [19]. ]. Enkratna subkutana injekcija K2Cr2O7 v odmerku 10 mg/kg prav tako povzroči oksidativni stres, ki ga povzroči Cr(VI), in poškodbo jetrnega tkiva podgan, čemur sledijo degenerativne spremembe v histoarhitekturi in dilatacija jetrnih sinusoidov. Podoben odmerek Cr(VI) povzroči degenerativne spremembe v tubulnih epitelijskih celicah, cistično dilatacijo tubulov, kongestijo krvnih žil, hialinske odlitke in dilatacijo Bowmanovega prostora vledvicepodgan [14]. Hepato- in nefrotoksičnost, ki jo povzroča K2Cr2O7, spremlja akutni oksidativni stres, ki ga povzroči Cr(VI). Toksičnost, ki jo povzroči Cr(VI), spodbuja zlasti nastanek ROS, hiperaktivacijo peroksidacijskih procesov, zaviranje aktivnosti antioksidativnih encimov, zmanjšanje celičnega GSH, pa tudi izčrpavanje neproteinskih sulfhidrilnih skupin in kopičenje Cr(VI) jetra inledvicepodgan in miši [14,20,21]. Menijo, da je vzdrževanje antioksidativnega statusa pomemben dejavnik za zmanjšanje in preprečevanje negativnih učinkov oksidativnega stresa, ki ga povzroča Cr(VI) [14,22,23]. Nevtralizacija Cr (VI) poteka z encimsko redukcijo v Cr (V) in kasnejšo transformacijo v soli, ki vsebujejo Cr, s sodelovanjem GR in NADPH. Neencimski antioksidanti, kot so vitamin E, askorbinska kislina, N-acetilcistein, česen v prahu in GSH, lahko zmanjšajo oksidativno škodo, ki jo povzroči K2Cr2O7 [24,25]. Vitamin E velja za najučinkovitejši v maščobi topen neencimski antioksidant, ki ščiti celično membrano pred radikalsko povzročeno peroksidacijo, spodbuja aktivacijo antioksidativnih encimov in zmanjšuje intenzivnost oksidativnega stresa, ki ga povzroča toksičnost s težkimi kovinami. Delovanje vitamina E v odmerku 100 oziroma 125 mg/kg telesne teže 2 oziroma 6 tednov zmanjša raven peroksidacijskih procesov, ki jih povzroča K2Cr2O7-, ter obnovi vsebnost GSH in aktivnost SOD v jetrih inledvicepodgan [14,19,22]. Vitamin E v odmerku 125 mg/kg telesne teže ima tudi antioksidativne in protivnetne lastnosti ter zmanjšuje intenzivnost toksičnosti, ki jo povzroča Cr(VI) v jetrih inledvicepodgan [22].

Etiltiosulfanilat spada v razred tiosulfonatnih spojin. Tiosulfonati so sintetični analogi naravnih biološko aktivnih organožveplovih spojin, pridobljenih iz česna, čebule, brokolija in cvetače. Tiosulfonati so stabilnejši od svojih naravnih analogov, imajo širok spekter bioloških lastnosti in so nizko toksični. Številni raziskovalci so v zadnjih letih preučevali protirakave, protivnetne, protiglivične, protimikrobne in imunomodulatorne lastnosti tiosulfonatov. Vendar pa ni dovolj študij o antioksidativnih lastnostih tiosulfonatov. Znano je, da lahko tiosulfonati modulirajo transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri aktivaciji genov sistema AOS [26,27]. Antioksidativni učinek teh spojin se kaže v zmožnosti zmanjšanja intenzivnosti izčrpavanja bazena GSH in tvorbe reaktivnih snovi s tiobarbiturno kislino (TBARS) v podganjih jetrih v pogojih oksidativnega stresa [28]. Zelo malo je znanega o antioksidativnih lastnostih tiosulfonatov pri toksičnem delovanju težkih kovin. Vendar pa so naravne organožveplove spojine pokazale pozitiven antioksidativni učinek proti oksidativnemu stresu, ki ga povzroča Cr(VI) [23, 29-31]. Naše prejšnje študije tudi kažejo, da ima etiltiosulfanilat antioksidativne lastnosti in delno odpravlja negativne učinke oksidativnega stresa, ki ga povzroča K2Cr2O7-, v tkivu jeter podgan [32].

Zato smo glede na pozitivne antioksidativne lastnosti vitamina E, pa tudi tiosulfonatov in njihovih naravnih analogov, namen naše študije raziskati učinkovitost in koristi kompleksnega učinka vitamina E in etiltiosulfanilata na stanje pro/antioksidantnega sistema v jetrih. inledvicepodgan v pogojih oksidativnega stresa, ki ga povzroča Cr(VI).

2. Materiali in metode

Poglavje »Materiali in metode« je bilo pripravljeno po analogiji z našo prejšnjo publikacijo [32].

2.1. Eksperimentalna zasnova.

Pri našem delu smo uporabili 40 podganjih samcev Wistar, težkih 130- 140g. Oblikovali smo 8 skupin živali (5 podgan na skupino): 1 kontrolno skupino in 7 poskusnih skupin. Vse podgane so bile nameščene v standardnih pogojih in so prejemale standardno krmo in pitno vodo ad libitum.

Intaktne kontrolne podgane v skupini I so prejele eno intraperitonealno injekcijo fiziološke raztopine (150 µl) enkrat na dan 7 dni. Živalim poskusnih skupin III in IV smo intraperitonealno dajali K2Cr2O7, raztopljen v 150 µl fiziološke raztopine (koncentracija Cr(VI) 2,5 mg/kg telesne teže) 7 oziroma 14 dni.

Skupina II je prejela intragastrično 1000 µl raztopine sončničnega olja (blagovna znamka «Oleina»; DSTU 4492: ISO 14024) enkrat na dan 14 dni in takoj zatem so fiziološko raztopino (150 µl) dajali intraperitonealno enkrat na dan 7 dni.

Skupina V: vsakodnevno intragastrično injiciranje oljne raztopine vitamina E v odmerku 20 mg/kg telesne teže 14 dni in takoj za tem fiziološko raztopino (150 µl) intraperitonealno enkrat na dan 7 dni.

Skupina VI: vsakodnevno intragastrično injiciranje kompleksa oljne raztopine vitamina E [20 mg/kg telesne teže] in etiltiosulfanilata (ETS) [100 mg/kg telesne teže] 14 dni in takoj zatem dnevno intraperitonealno injiciranje 150 µl fiziološke raztopine 7 dni.

Skupina VII/Skupina VIII: 14 dni so prejemali intragastrično kompleksno oljno raztopino vitamina E [20 mg/kg telesne teže] in ETS [100 mg/kg telesne teže] in takoj zatem prejemali intraperitonealno dnevno K2Cr2O7 v odmerku 2,5 mg. Cr(VI)/kg telesne teže na dan 7 dni/14 dni.

Vse manipulacije z živalmi pri našem delu so bile v skladu z določili Evropske konvencije o zaščiti vretenčarjev, ki se uporabljajo v poskusne in druge znanstvene namene (Strasbourg, 1986) in »Skupnih etičnih načel za poskuse na živalih« (Ukrajina, 2001). Dovoljenje za izvedbo raziskave je bilo pridobljeno s strani Odbora za bioetiko Inštituta za biologijo živali NAAS v Lvovu (Protokol št. 80).

Delo je preučevalo učinke na novo sintetizirane spojine ETS (etil 4- aminobenzenetiosulfonat) v kompleksu z vitaminom E na telo podgan. ETS je bil sintetiziran na oddelku za tehnologijo biološko aktivnih spojin, farmacijo in biotehnologijo Nacionalne univerze "Lviv Polytechnic" v skladu s protokolom, ki je podrobno opisan v članku [33, 34].

Po dekapitaciji živali, ki je potekala pod tiopentalno anestezijo, jeledviceso bili zbrani. Vsi postopki naledviceso bile izvedene pri 4 stopinjah. Material za raziskavo so bili homogenati ledvic podgan, ki smo jih pripravili na 0.05 M Tris-HCl pufru s pH 7,4 v razmerju 1 g tkiva in 9 ml pufra (1:9, masa/volumen). ) in nato centrifugiramo 15 minut pri 1000 g. Po centrifugiranju v dobljenih supernatantih smo določili vsebnost GSH, stopnjo produktov peroksidacije in aktivnost antioksidativnih encimov.

2.1.1. Skupine živali.

Skupine živali smo primerjali po naslednji shemi (Slika 1). Skupina I je intaktna kontrola v primerjavi s poskusnima skupinama III in IV, ki nista prejeli oljne raztopine. Skupina II je kontrolna v primerjavi s poskusnimi skupinami V, VI, VII in VIII, ki so prejemale oljno raztopino. Zabeležili smo odstotek (odstotek) spremembe indikatorjev za III in IV eksperimentalne skupine glede na skupino I (intaktna kontrola). Zabeležili smo tudi odstotek spremembe indikatorjev za V, VI, VII in VIII poskusne skupine glede na skupino II (kontrola olja). Na zadnji stopnji smo analizirali odstotno spremembo kazalcev III/IV poskusnih skupin glede na skupino I (intaktna kontrola) in jo primerjali z odstotno spremembo kazalcev VII/VIII poskusnih skupin glede na skupino II (oljna kontrola).

2.2. Obravnavati.

2.1.1. Koncentracija LHP.

Merjenje ravni LHP (lipidnih hidroperoksidov) je bilo izvedeno v nasprotju z metodama obarjanja proteinov s trikloroocetno kislino in lipidov z etanolom

ekstrakcija [35]. Amonijev tiocianat sodeluje z lipidnimi etanolnimi ekstrakti in sproži barvno reakcijo. Zapis absorpcije obarvanega produkta je bil izveden spektrofotometrično (λ 480 nm). Nivo LHP (SU/g tkiva) smo izračunali kot razliko med kontrolnim in poskusnim vzorcem.

2.2.2 Koncentracija TBARS.

Vrednotenje koncentracije TBARS (reaktivne snovi s tiobarbiturno kislino) temelji na principu interakcije malondialdehida in tiobarbiturne kisline v pogojih kislosti in visoke temperature [35]. Rezultat interakcije malondialdehida in tiobarbiturne kisline je barvna reakcija. Zapis absorbance barvnega produkta je bil izveden spektrofotometrično (λ 535 nm in λ 580 nm) in raven TBARS je bila izračunana kot nmol MDA/g tkiva.

2.2.3. Dejavnost GP.

Merjenje encimske aktivnosti GP (glutation peroksidaze) se izvede v prisotnosti GSH pred in po dodajanju terciarnega butil hidroperoksida [35]. Ocenjevanje

delovanje GP temelji na principu stopnje oksidacije GSH. SH-skupine molekule GSH se oksidirajo v prisotnosti 2-nitrobenzojske kisline. Dinitrofenilni anion nastane kot posledica oksidacije GSH. Beleženje absorpcije obarvanega produkta je bilo izvedeno spektrofotometrično (λ 412 nm) in aktivnost GP izračunana v nmol GSH/min. × mg beljakovin.

2.2.4. Dejavnost GR.

Merjenje encimske aktivnosti GR (glutation reduktaze) je bilo izvedeno v prisotnosti oksidiranega glutationa in NADPH [35]. Vrednotenje aktivnosti GR temelji na principu stopnje redukcije oksidiranega glutationa. Zapis absorbance je bil izveden spektrofotometrično (λ 340 nm) 1 minuto pri 37 stopinjah. Hitrost zmanjševanja ekstinkcije je pokazatelj intenzivnosti reakcije. GR aktivnost smo izračunali v µmol NADPH/min. × mg beljakovin.

2.2.5. Koncentracija GSH.

Vrednotenje ravni GSH (reducirani glutation) temelji na principu tvorbe dinitrofenil aniona (obarvan produkt) po vezavi 2-nitrobenzojske kisline na SH-skupino molekule GSH [36]. Vrednost koncentracije GSH je odvisna od intenzivnosti barvne reakcije. Zapis absorbance obarvanega produkta je bil izveden spektrofotometrično (λ 412 nm) in vsebnost GSH je bila izračunana kot mmol GSH/g tkiva.

2.2.6. Dejavnost SOD.

Merjenje encimske aktivnosti SOD (superoksid dismutaze) je bilo izvedeno v prisotnosti NADH in fenazin metosulfata [36]. Vrednotenje aktivnosti SOD temelji na principu redukcije nitromodrega tetrazolija. Intenzivnost inhibicije procesa redukcije nitromodrega tetrazolija kaže na intenzivnost aktivnosti encima. Zapis absorbance je bil izveden spektrofotometrično (λ 540 nm) in aktivnost SOD izračunana v standardnih enotah na 1 mg beljakovin.

2.2.7. Dejavnost CAT.

Merjenje encimske aktivnosti CAT (katalaze) je bilo izvedeno v prisotnosti molibdenovih soli, ki medsebojno delujejo z vodikovim peroksidom [36]. Kot rezultat reakcije je nastal obarvan produkt. Zapis absorbance obarvanega produkta je bil izveden spektrofotometrično (λ 410 nm) in CAT aktivnost je bila izračunana v mmol/minuto × 1 mg proteina.

2.2.8. Koncentracija beljakovin.

Koncentracijo skupnih beljakovin v tkivnih homogenatih smo izmerili po metodi Lowry [37] z uporabo kompletov "Simko LTD" (Ukrajina, Lviv). Merjenje vseh vrednosti absorbance je bilo izvedeno na spektrofotometru, "Unico" 1205 (ZDA).

2.3. Statistična analiza.

Vsi eksperimentalni podatki so bili statistično analizirani s programsko opremo Microsoft Excel z uporabo enosmerne analize variance (ANOVA) in Tukey-Kramerjevega testa. Vse eksperimentalne vrednosti so bile izračunane kot srednje vrednosti (M) ± standardna napaka (SEM) in so veljale za statistično značilne pri P <>

3. Rezultati in razprava

Razdelek »Rezultati in razprave« je bil pripravljen po analogiji z našo prejšnjo objavo [32].

3.1. Označevalci oksidativnega stresa.

Ugotovili smo, da intraperitonealno dajanje kalijevega dikromata 7 in 14 dni vodi do povečanja vsebnosti markerjev oksidativnega stresa v tkivu jeter in ledvic podganjih samcev. Izpostavljenost K2Cr2O7 v odmerku 2,5 mg Cr(VI)/kg telesne teže 7 (III skupina) in 14 dni (IV skupina) je povzročila pomembno povečanje vsebnosti TBARS v jetrih živali v primerjavi s skupino I (kontrola) z 69 oziroma 75 odstotkov (tabela 1). Raven TBARS je bila tudi pomembno povišana v ledvičnem tkivu podgan III in IV poskusne skupine glede na kontrolo za 41 oziroma 46 odstotkov. Podoben odmerek Cr(VI) je povzročil znatno povečanje koncentracije LHP v jetrih podgan v poskusnih skupinah III in IV v primerjavi s skupino I za 112 oziroma 127 odstotkov. Raven LHP se je pomembno povečala tudi v tkivu ledvic podgan po 7 (III skupina) in 14 dneh (IV skupina) delovanja Cr(VI) v primerjavi s kontrolno skupino za 39 oziroma 56 odstotkov.

Vzrok za povečanje intenzivnosti peroksidacijskega procesa v jetrih in ledvicah podgan je hiperaktivacija nastajanja hidroksilnih in superoksidnih radikalov, ki jo povzroči Cr(VI). Cr(VI)-inducirana tvorba ROS povzroči poškodbe strukture lipidnih komponent celične membrane in posledično izzove povečanje vsebnosti TBARS [19,20,38]. Vmesni produkti redukcije Cr(VI) vstopijo v Fentonove podobne reakcije, medsebojno delujejo z vodikovim peroksidom in sprožijo hidroksilne radikale [19]. Po literaturi Cr(VI) poveča intenzivnost nastajanja superoksidnih radikalov z aktiviranjem encimskih kompleksov NADPH-oksidaze [39] in ksantin-ksantin-oksidaze [40].

Intragastrično dajanje vitamina E (skupina V) in vitamina E v kompleksu z ETS (skupina VI) v 14 dneh je povzročilo znatno zmanjšanje vsebnosti TBARS v jetrih živali glede na skupino II za 13 oziroma 16 odstotkov (tabela 1). Rahlo znižanje ravni TBARS so zabeležili tudi v tkivu ledvic podgan V in VI poskusne skupine v primerjavi s skupino II za 5 oziroma 3 odstotke. Vsebnost LHP se je v V in VI poskusnih skupinah v jetrih podgan bistveno zmanjšala v primerjavi s skupino II za 12 oziroma 16 odstotkov. Prišlo je tudi do pomembnega zmanjšanja ravni LHP v ledvičnem tkivu podgan podobnih eksperimentalnih skupin glede na skupino II za 10 oziroma 8 odstotkov.

Vsebnost TBARS v jetrih podgan je ostala na ravni indikatorjev skupine II po 14 dneh kompleksne predobdelave z vitaminom E in ETS z naslednjim aktinom Cr(VI) 7 dni (skupina VII). Predhodni kompleksni vpliv vitamina E in ETS z naslednjim delovanjem Cr(VI) 14 dni je privedel do povečane ravni TBARS v jetrnem tkivu skupine VIII v primerjavi s skupino II za 23 odstotkov. Vendar je bilo povečanje vsebnosti TBARS v jetrnem tkivu živali skupine VIII (23 odstotkov) v primerjavi s skupino II za 52 odstotkov nižje od odstotnega povečanja vsebnosti TBARS v jetrih podgan skupine IV (75 odstotkov) v primerjavi s skupino I. .

Koncentracija TBARS se je povečala v tkivu ledvic podgan po 14 dneh kompleksne predobdelave z vitaminom E in ETS z naslednjim delovanjem Cr(VI) za 7 (VII skupina) in 14 dni (VIII skupina) v primerjavi s skupino II za 21 in 31 odstotkov oz. Vendar pa je bila intenzivnost povečanja vsebnosti TBARS v ledvicah podgan skupin VII (21 odstotkov) in VIII (31 odstotkov) glede na skupino II za 25 in 21 odstotkov nižja od odstotnega povečanja ravni TBARS v homogenatih ledvic skupin. III (46 odstotkov) in IV (52 odstotkov) v primerjavi s skupino I.

Kompleksna predobdelava z vitaminom E in ETS z naslednjim aktinom Cr(VI) 7 dni (skupina VII) in 14 dni (skupina VIII) je povzročila povečanje vsebnosti LHP v jetrnem tkivu podgan v primerjavi s skupino II za 17 in 52 odstotkov. , oz. Vendar je bilo povečanje ravni LHP v jetrih podgan skupin VII (17 odstotkov) in VIII (52 odstotkov) glede na skupino II za 97 in 75 odstotkov nižje od odstotnega povečanja vsebnosti LHP v homogenatih jeter skupine III (114 odstotkov). ) in IV (127 odstotkov ) v primerjavi s skupino I.

Koncentracija LHP se je povečala v ledvicah živali iz skupin VII in VIII glede na skupino II za 16 oziroma 31 odstotkov.

Vendar je bilo povečanje vsebnosti LHP v ledvicah podgan skupin VII (16 odstotkov) in VIII (31 odstotkov) v primerjavi s skupino II za 23 oziroma 25 odstotkov nižje od odstotnega povečanja ravni LHP v ledvičnem tkivu skupine III (39 odstotkov). ) in IV (56 odstotkov ) glede na skupino I.

Podatki iz literature poročajo, da ima vitamin E značilne učinkovite antioksidativne lastnosti, zavira procese peroksidacije lipidov in zmanjšuje ravni ROS in vitro in in vivo [22]. Peroralno dajanje vitamina E zmanjša hepatotoksičnost, ki jo povzroča Cr(VI), in zmanjša vsebnost TBARS v jetrih podgan [19]. Vzrok za zmanjšanje intenzivnosti peroksidacijskih procesov v jetrnem tkivu podgan je lahko tudi antioksidativna lastnost druge skupine sulfa, ki je strukturna komponenta molekule ETS [32,42,43]. Ta funkcionalna skupina ima lastnosti za zmanjšanje vsebnosti LHP [41]. S-alkiltiosulfonati, ki so sintetični strukturni analogi ETS, zavirajo aktivnost sistema ksantin-ksantin oksidaze in nastajanje ROS [27]. Vitamin E je pomembna sestavina citoplazme in celične membrane. Antioksidativni učinek vitamina E preprečuje aktivacijo verižnih reakcij avtooksidacije lipidov zaradi nevtralizacije peroksilnih in alkoksidnih radikalov. Peroksilni radikali tudi hitreje reagirajo z vitaminom E kot z lipidi celične membrane [14].

Tako toksični učinek Cr(VI) povzroči zvišanje vsebnosti TBARS in LHP v jetrnem in ledvičnem tkivu živali. Vendar pa predhodni učinek vitamina E z ETS zmanjša intenzivnost peroksidacijskih procesov v jetrih in ledvicah podgan pod delovanjem oksidativnega stresa, ki ga povzroča Cr(VI).

3.2. Glutation antioksidativni sistem.

Aktivnost GP v jetrnem tkivu podgan pod vplivom Cr(VI) se je povečala 7 (III skupina) in 14 dni (IV skupina) v primerjavi s skupino I za 55 oziroma 15 odstotkov (tabela 2).

Intraperitonealno dajanje kalijevega dikromata 7 dni (skupina III) je povzročilo povečanje vsebnosti celičnega GSH v jetrnem tkivu podgan za 12 odstotkov v primerjavi s kontrolo (skupina I). Raven GSH se ni razlikovala od kontrolnih vrednosti v ledvicah živali skupine III (K2Cr2O7 14 dni). Vendar pa je prišlo do zmanjšanja GSH v jetrih in ledvicah podgan po 14 dneh delovanja Cr(VI) (skupina IV) glede na skupino I za 34 odstotkov oziroma 36 odstotkov. Po drugi strani pa je lahko visoka občutljivost ledvičnega tkiva na toksičnost, ki jo povzroča Cr(VI), razlog za inaktivacijo GP v ledvicah živali skupine IV [1, 16].

Avtorji tudi domnevajo, da se mehanizem inaktivacije GP pod pogojem toksičnosti Cr(VI) izvaja z vezavo Cr(VI) na aktivno mesto encima in neposrednim izpodrivanjem kofaktorjev-kovin iz aktivnega mesta [25].

Aktivnost GR se v jetrih živali skupine III glede na kontrolo ni spremenila. Toda 14-dnevna izpostavljenost Cr(VI) je povzročila zmanjšanje aktivnosti GR v jetrnem tkivu podgan živali za 17 odstotkov v primerjavi s skupino I. Inhibicijo aktivnosti GR so opazili tudi v tkivu ledvic živali po 7 (III. skupina) in 14 (skupina IV) dni injiciranja K2Cr2O7 v primerjavi s skupino I za 45 oziroma 43 odstotkov.

Predvidevamo, da je Cr(VI)-inducirano zmanjšanje vsebnosti GSH lahko razlog za supresijo GR v obeh tkivih podgan [44-46]. Molekule GSH zagotavljajo neposredno nevtralizacijo prostih radikalov, igrajo ključno vlogo v mehanizmih antioksidativne zaščite celic [47] in so vključene v procese redukcije Cr(VI) [19]. Zato je lahko znižanje vsebnosti GSH v jetrih podgan, prizadetih s Cr(VI), posledica intenzivne uporabe molekul GSH v procesih nevtralizacije ROS in prostih radikalov v pogojih oksidativnega stresa, ki ga povzroča K2Cr2O7-.

Literaturni podatki opisujejo tudi neposredni mehanizem inhibicije aktivnosti GR zaradi specifične vezave težke kovine na redoks par tiol/tiolat in histidinski ostanek v katalitskem središču reducirane oblike encima. Nato vezan kovinski ion povzroči spremembe v upogibu izoaloksazinskega obroča FAD in hidrofobnosti njegovega mikrookolja. Posledično je encimska aktivnost GR inhibirana [48].

Dajanje vitamina E (skupina V) in vitamina E v kompleksu z ETS (skupina VI) je povzročilo povečanje ravni GSH v jetrih podgan glede na skupino II za 15 oziroma 21 odstotkov. Predhodni kompleksni vpliv vitamina E in ETS z naslednjim delovanjem Cr(VI) za 7 (skupina VII) in 14 dni (skupina VIII) je povzročil zvišanje vsebnosti GSH v jetrnem tkivu v primerjavi s skupino II za 21 in 23 odstotkov. , oz.

Statistično značilne razlike v spremembah vsebnosti GSH v živalskih tkivih po dajanju vitamina E in vitamina E v kompleksu z ETS nismo našli. Opazili smo le težnjo po povečanju ravni GSH v ledvicah živali po zdravljenju 14 dni z vitaminom E in vitaminom E v kompleksu z ETS.

Glede na literaturo ima vitamin E hepato- in nefroprotektivne lastnosti proti toksičnosti, ki jo povzroča Cr(VI), obnavlja vsebnost GSH in podpira aktivnost encimov AOS [14, 19]. Avtorji tudi poročajo, da so tiosulfonati odgovorni za od Nrf2- odvisno aktivacijo antioksidantno odzivnih elementov (ARE), ki inducirajo aktivacijo encimov antioksidativnega obrambnega sistema in lovljenje prostih radikalov. S tiosulfonatom posredovana aktivacija ARE stimulira aktivnost genov, ki kodirajo -GCS. Morda so podobni mehanizmi vključeni v povečanje vsebnosti GSH pod delovanjem ETS [26]. Podatki iz literature tudi kažejo, da stimulacija ARE inducira ekspresijo genov GR in GS. Ti encimi igrajo ključno vlogo pri sintezi in redukciji molekul GSH [49].

Molekule tiosulfonata imajo tudi sposobnost pretvorbe v mono-, di- in trisulfide. Možno je, da so produkti transformacije tiosulfonatov, ki vsebujejo žveplo, lahko vključeni v biosintezo novih molekul GSH [29].

Kompleksna predobdelava z vitaminom E in ETS z naslednjim aktinom Cr(VI) 7 dni (skupina VII) in 14 dni (skupina VIII) je pokazala le težnjo po obnovitvi aktivnosti GP in GR v jetrih podgan. Vendar v tem primeru nismo ugotovili statistično pomembne razlike.

Zlasti delovanje vitamina E (skupina V) in v kombinaciji z ETS (skupina VI) 14 dni je povzročilo aktivacijo GP v tkivu ledvic živali glede na skupino II za 19 oziroma 22 odstotkov. Predhodni kompleksni učinek vitamina E in ETS z naslednjim delovanjem Cr(VI) 7 dni je povzročil povečanje aktivnosti GP za 38 odstotkov v ledvicah podgan skupine VII v primerjavi s skupino II (tabela 2). Vendar pa je bilo povečanje aktivnosti GP v ledvicah podgan skupine VII (38 odstotkov) v primerjavi s skupino II za 47 odstotkov nižje od odstotka hiperaktivacije GP v tkivu ledvic podgan skupine III (85 odstotkov) glede na skupino I.

Po drugi strani pa je bila aktivnost GP v ledvičnem tkivu podgan po predhodnem vplivu vitamina E v kompleksu z ETS 14 dni zatrta za 16 odstotkov z naslednjim delovanjem Cr(VI) 14 dni (skupina VIII) v primerjavi s skupino II. Vendar pa je bilo zmanjšanje aktivnosti GP v ledvičnem tkivu živali skupine VIII (16 odstotkov) v primerjavi s skupino II za 11 odstotkov nižje od odstotka inaktivacije GP v ledvicah podgan skupine III (27 odstotkov) glede na skupino I. Rahlo povečanje aktivnosti GR (8 odstotkov) so opazili po 14 dneh kompleksne izpostavljenosti vitaminu E in ETS v tkivu ledvic živali skupine VI glede na skupino II.

Predhodni kompleksni vpliv vitamina E in ETS z naslednjim delovanjem Cr (VI) 7 (skupina VII) in 14 dni (skupina VIII) je povzročil zmanjšanje aktivnosti GR v ledvicah podgan glede na skupino II za 17 in 36 odstotkov, oz.

Vendar pa je bila intenzivnost zmanjšanja aktivnosti GR v ledvičnem tkivu podgan skupin VII (17 odstotkov) in VIII (36 odstotkov) glede na skupino II za 28 in 7 odstotkov nižja od odstotka inaktivacije aktivnosti GR v homogenatih ledvic skupine III. (45 odstotkov) in IV (43 odstotkov) v primerjavi s skupino I.

Domnevamo, da je delna stabilizacija aktivnosti GP in zmanjšanje intenzivnosti supresije GR v podganjih ledvicah pod delovanjem Cr(VI) posredovana z antioksidativnim učinkom vitamina E in kompleksa ETS. Rezultati zgoraj opisanih študij so pokazali, da je predhodna izpostavljenost vitaminu E in ETS oslabila intenzivnost procesov LP, ki jih povzroča Cr(VI) v ledvicah podgan. Glede na literaturo močno povečanje vsebnosti TBARS, LHP in produktov peroksidacije beljakovin spremlja motnja v aktivnosti encimov AOS, povezanih z GSH [50]. Možno je, da kompleksni antioksidativni učinek vitamina E in ETS stabilizira encimsko aktivnost GP in GR z zmanjšanjem vsebnosti LHP in TBARS v ledvičnem tkivu živali.

Tako intraperitonealno injiciranje K2Cr2O7 7 dni povzroči rahlo kompenzacijsko aktivacijo GP in povečanje vsebnosti GSH v jetrih podgan. Rahlo GP stimulacijo opazimo tudi po 14 dneh delovanja Cr(VI). Vendar pa 14-dnevna izpostavljenost K2Cr2O7 povzroči izčrpanje jetrnega bazena GSH in zaviranje aktivnosti GR. Zmanjšanje vsebnosti GSH, ki ga povzroči Cr (VI), se odpravi v jetrnem tkivu s kompleksno intragastrično predhodno obdelavo vitamina E in ETS. Delovanje Cr(VI) 7 dni vodi do kompenzacijske aktivacije GP in supresije GR v ledvicah podgan. Po drugi strani pa 14-dnevna izpostavljenost K2Cr2O7 povzroči inaktivacijo GP, GR in zmanjšanje vsebnosti GSH v ledvicah. Predhodni kompleksni vpliv vitamina E in ETS zmanjša intenzivnost inaktivacije GR in stabilizira aktivnost GP v tkivu ledvic podgan v pogojih oksidativnega stresa, ki ga povzroči K2Cr2O7-.

3.3. Antioksidativni encimi.

Intraperitonealna injekcija kalijevega dikromata za 7 in 14 dni je povzročila zmanjšanje aktivnosti SOD v jetrnem tkivu živali skupin III in IV glede na skupino I za 17 oziroma 33 odstotkov (tabela 3). Aktivacijo SOD so opazili po 7 dneh zdravljenja s Cr(VI) v tkivu ledvic podgan skupine III (21 odstotkov), vendar je 14 dni delovanja Cr(VI) povzročilo supresijo encimske aktivnosti SOD v ledvicah živali skupine IV (18 odstotkov). ) v primerjavi s skupino I.

Aktivnost CAT se je po 7 dneh izpostavljenosti Cr(VI) povečala za 11 odstotkov, vendar je 14 dni dajanja K2Cr2O7 spremljalo zmanjšanje aktivnosti CAT za 13 odstotkov v podganjem jetrnem tkivu skupine IV glede na skupino I. Cr(VI ) toksičnost za 7 dni je povzročila aktivacijo CAT (za 15 odstotkov), vendar je toksičnost K2Cr2O7 za 14 dni povzročila zmanjšanje encimske aktivnosti CAT v ledvičnem tkivu živali skupine IV v primerjavi s skupino I.

Avtorji poročajo, da je razlog za aktivacijo SOD (jetra in ledvice) in CAT (jetra) v tkivih podgan skupine III lahko prekomerna ekspresija antioksidantnega gena ali kompenzacijski mehanizmi sistema AOS proti oksidativnemu stresu, ki ga povzroča Cr(VI) [51]. ,52].

Tudi analiza literaturnih podatkov kaže, da je Cr(VI) močan zaviralec encimske aktivnosti SOD. Morda lahko ti podatki pojasnijo inhibicijo aktivnosti SOD po daljšem toksičnem aktinu Cr(VI) v tkivih podgan skupine IV (Cr(VI) 14 dni). Toksično delovanje Cr(VI) vodi do zaviranja encimske aktivnosti SOD in motenj molekularne strukture SOD zaradi intenziviranja peroksidacijskih procesov [53]. Težke kovine, vključno s Cr(VI), imajo sposobnost inaktivacije encimov AOS po neposredni vezavi na aktivno mesto ustreznih encimov [54]. Ko je inaktivacija SOD potlačena, dismutacija procesira O2- v H2O2. Posledično sta lahko stimulacija tvorbe O2-, ki jo povzroča Cr(VI), in zaviranje procesov uporabe O2- vzrok za inaktivacijo encima AOS, vključno s CAT [55].

Zlasti vitamin E (skupina V) in v kombinaciji z ETS (skupina VI) je stimuliral aktivnost CAT v jetrnem tkivu živali glede na skupino I za 15 oziroma 33 odstotkov. Prav tako je bila verjetna aktivacija CAT v ledvicah podgan V in VI poskusne skupine v primerjavi s skupino II za 23 oziroma 28 odstotkov (tabela 3).

Kompleksna predobdelava z vitaminom E in ETS z naslednjim aktinom Cr(VI) 7 dni (skupina VII) in 14 dni (skupina VIII) je povzročila povečanje aktivnosti CAT v jetrnem tkivu podgan glede na skupino II za 17 in 9 odstotkov, oz. Aktivacijo CAT so opazili tudi pri podganjih ledvicah skupine VII (13 odstotkov) glede na skupino II. Vendar pa je encimska aktivnost CAT v ledvičnem tkivu živali skupine VIII ostala na ravni kazalcev skupine II.

Literaturni podatki poročajo, da vitamin E preprečuje zmanjšanje encimske aktivnosti SOD, CAT in drugih encimov AOS v tkivih miši in podgan v pogojih oksidativnega stresa [56,57]. Vitamin E tudi zmanjša oksidativni stres, ki ga povzroči Cr(VI) v testisih podgan zaradi obnavljanja aktivnosti SOD in CAT ter zmanjšanja intenzivnosti procesov LP [58].

Tiosulfonati sodelujejo pri Nrf2-odvisni aktivaciji genske stimulacije AOS [26]. Stimulacija Nrf2 vodi do povečane ekspresije genov, ki kodirajo CAT [59]. Alicin, eden od naravnih analogov tiosulfonatov, sodeluje pri aktiviranju genov, odgovornih za izražanje SOD, CAT in Nrf2 [60]. Možno je, da so zgornje antioksidativne lastnosti vitamina E, tiosulfonatov in njihovih naravnih analogov lahko razlog za obnovitev encimske aktivnosti CAT pod delovanjem oksidativnega stresa, ki ga povzroči Cr(VI).

4. Sklepi

O antioksidativnih lastnostih tiosulfonatov je malo znanega. Obstaja tudi dovolj podatkov, ki opisujejo zaščitne lastnosti tiosulfonatov proti toksičnosti, ki jo povzročajo težke kovine v tkivih živalskega organizma. Naše prejšnje študije kažejo, da je predobdelava z ETS lahko učinkovita pri odpravljanju toksičnosti jeter, ki jo povzroča Cr(VI) pri podganjih organizmih. Predvidevamo, da so nadaljnje študije antioksidativnih lastnosti ETS v kombinaciji z antioksidativnimi spojinami in celičnimi reducenti pomembne za boljše razumevanje vloge tiosulfonatov v mehanizmih preprečevanja oksidativnega stresa, ki ga povzročajo težke kovine.

Posplošitev dobljenih rezultatov kaže, da delovanje K2Cr2O7 vodi do hepato- in nefrotoksičnosti, ki jo povzroča Cr(VI), zaradi intenziviranja procesov LP in povečanja tvorbe LHP in TBARS v tkivih obeh živali. Sistem AOS vključuje kompenzacijske mehanizme za preprečevanje oksidativnega stresa, ki ga povzroča Cr(VI). Te mehanizme spremlja aktivacija SOD, CAT in GP v ledvičnem tkivu, pa tudi stimulacija CAT, GP in kopičenje GSH v jetrih podgan po 7 dneh izpostavljenosti Cr(VI). Daljše 14-dnevno delovanje Cr(VI) pa vodi do izčrpanja virov AOS sistema zaradi inaktivacije antioksidativnih encimov (SOD, CAT, GR, GP) in izčrpanja GSH bazena v tkivih jeter in ledvic živali. Kompleks vitamina E in ETS izkazuje antioksidativni učinek proti toksičnosti, ki jo povzroča Cr(VI). Intragastrična predobdelava tega kompleksa 14 dni se kaže v zmanjšanju procesov LP, ki jih povzroča Cr(VI) v jetrih in ledvicah podgan. Predhodni vpliv vitamina E in ETS prav tako preprečuje izčrpavanje CAT in GSH v jetrih, kot tudi odpravlja intenzivnost inaktivacije CAT, stabilizira aktivnost GP in GR v ledvičnem tkivu živali pod pogojem K2Cr2O7-inducirane oksidacije. stres. Zlasti vitamin E in v kompleksu z ETS zavira zvišanje LHP in stimulira CAT v obeh tkivih podgan. Antioksidativni učinek teh spojin vodi tudi do kopičenja GSH v jetrih in aktivacije ledvičnega GP.

Dobljeni rezultati kažejo, da je predobdelava vitamina E in ETS delno stabilizirala s Cr(VI) povzročeno motnjo v mehanizmih delovanja antioksidativnega obrambnega sistema v podganjih ledvicah. Poleg tega lahko rezultati naše študije postanejo del ozadja za ustvarjanje učinkovitih metod preprečevanja in popravljanja antioksidativnih in prooksidativnih stanj v ledvicah, prizadetih zaradi delovanja oksidativnega stresa, ki ga povzroča Сr(VI).

1 Oddelek za biokemijo Adaptacija in ontogeneza živali; Inštitut za biologijo živali NAAS; Lvov; Ukrajina

2 Katedra za tehnologijo biološko aktivnih spojin; Farmacija in biotehnologija Nacionalne politehnične univerze v Lvivu; Ukrajina

Reference

1. Sahar, Holandija; Sherif, MS Izboljšalni učinki olja grozdnih pečk na nefrotoksičnost, ki jo povzroča krom, in oksidativni stres pri podganah. Slovenski veterinarski zbornik raziskav 2020, 57, 123- 131.

2. Husain, N.; Mahmood, R. Tavrin zmanjša poškodbe celic in DNK, ki jih povzroči Cr(VI): študija in vitro z uporabo človeških eritrocitov in limfocitov. Aminokisline 2020, 52, 35-53.

3. Tian-Guang, Z.; Ya-Li, Z.; Lei, Li.; Dong-Hai, Z. Antagonistični učinki nano-selena na poškodbo jeter pitovnih piščancev, ki jih povzroči zastrupitev s Cr(VI) na poti AMPK. Environmental Science and Pollution Research International 2020, 27, 41585-41595.

4. Farag, AI; El-Sherry, ES Hepatotoksičnost, povzročena s kromom, in potencialni zaščitni učinek selena pri odraslih samcih albino podgan: histološka, ​​imunohistokemijska in molekularna študija. Med. J. Univerza v Kairu 2020, 88, 187- 196.

5. Shih-Chang, F.; Jui-Ming, L.; Kuan-I, L.; Feng-Cheng, T.; Kai-Min, F.; Ching-Yao, Y.; Chin-Chuan, S.; Hsin-Hung, C.; Ren-Jun, H.; Ya-Wen, C.Cr(VI) inducira ROS-posredovano mitohondrijsko odvisno apoptozo v nevronskih celicah preko aktivacije signalne poti Akt/ERK/AMPK. Toksikologija in vitro 2020, 65, 1- 16.

6. Fedala, A.; Adjroud, O.; Abid-Essefi, S.; Timoumi, R. Zaščitni učinki selena in cinka proti motnjam ščitnice, ki jih povzroča kalijev dikromat, oksidativnemu stresu in poškodbam DNA pri brejih podganah Wistar. Environ Sci Pollut Res Int 2021

7. On, X.; Li, P. Onesnaženje površinske vode na lesni planoti Srednje Kitajske s posebnim poudarkom na šestvalentnem kromu (Cr6 plus): pojav, viri in zdravstvena tveganja. Izpostavljenost in zdravje 2020, 12, 1- 17, https://doi.org/10.1007/s12403-020-00344-x.

8. Chen, YQ; Murphy, A.; Sonce H.; Costa M. Molekularni in epigenetski mehanizmi karcinogeneze, ki jo povzroča Cr (VI). Toksikologija in uporabna farmakologija 2019, 377, 1-9,

https://doi.org/10.1016/j.taap.2019.114636.

9. Machado, AB; Caprara, JF; Diehl de Franceschi, I.; Linden, R.; Berlese, DB; Feksa, LR Učinki kronične izpostavljenosti šestvalentnemu kromu v vodi na parametre oksidativnega stresa pri podganah Wistar. Acta Scientiarum Biološke znanosti 2019, 41, 1- 10.

10. Fatma, M.; Raghda, A.; Mohamed, M. Hepatoprotektivni potencial eteričnega olja Rosmarinus officinalis proti heksavalentnemu kromu, ki ga povzroča hematotoksičnost, biokemične, histološke in imunohistokemične spremembe pri samcih podgan. Znanost o okolju in raziskave onesnaževanja 2021, 28, 17445– 17456.

11. Wang, Y.; Wang, X.; Wang, L.; Cheng, G.; Zhang, M.; Xing, Y.; Zhao, X.; Liu, Y.; Liu, J. Mitofagija, povzročena s poškodbo mitohondrijske funkcije pri piščančjih ledvicah, izpostavljenih Cr(VI). Raziskave bioloških elementov v sledovih 2021, 199, 703-711.

12. Zheng, X.; Li, S.; Li, J.; Lv, Y.; Wang, X.; Wu, P.; Yang, Q.; Tang, Y.; Liu, Y.; Zhang, Z. Šestvalentni krom inducira ledvično apoptozo in avtofagijo z motnjami ravnovesja mitohondrijske dinamike pri podganah. Ekotoksikologija in okoljska varnost 2020, 204, 1-9.

13. Yang, D.; Yang, Q.; Fu, N.; Li, S.; Han, B.; Liu, Y.; Tang, Y.; Guo, X.; Lv, Z.; Zhang, Z. Heksavalentni krom inducira srčno disfunkcijo prek Sesn2-posredovane okvare mitohondrijske funkcije in oskrbe z energijo. Kemosfera 2021, 264, 1- 10.

14. Balakrishnan, R.; Satish Kumar, CS; Rani, MU; Srikanth, MK; Boobalan, G.; Reddy, AG Ocena zaščitne vloge -tokoferola pri hepatotoksičnosti in nefrotoksičnosti, ki jo povzročajo prosti radikali, zaradi kroma pri podganah. Indian Journal of Pharmacology 2013, 45, 490-495.

15. Zhang, Y.; Bian, H.; Ma, Y.; Xiao, Y.; Xiao, F. Prekomerna mitofagija, ki jo povzroči Cr (VI), prispeva k izgubi mitohondrijev in citotoksičnosti v hepatocitih L02. Biochemical Journal 2020, 477, 2607-2619.

16. Saidi, M.; Aouacheri, O.; Saka, S.; Tebboub, I.; Ailene, L. Nefron-zaščitni učinki kurkume na oksidativne poškodbe in oksidativni stres pri podganah pri subkronični zastrupitvi s kromom. Int. J. Biosci 2019, 15, 241-250.

17. Li, J.; Zheng, X.; Ma, X.; Xu, X.; Du, Y.; Lv, Q.; Li, X.; Wu, Y.; Sonce, H.; Yu, L.; Zhang, Z. Melatonin ščiti pred srčno poškodbo, ki jo povzroča krom (VI), z aktiviranjem poti AMPK/Nrf2. Časopis za

Anorganska biokemija 2019, 197, 1- 10.

18. Science Direct.

19. Shati, AA Izboljšalni učinek vitamina E na hepatotoksičnost, ki jo povzroča kalijev dikromat pri podganah. Journal of King Saud University - Science 2014, 6, 181- 189.

20. Khalaf, AA; Hassanen, EI; Ibrahim, MA; Tohamy, AF; Aboseada, MA; Hassan, HM; Zaki, AR

Rožmarinska kislina zmanjša s kromom povzročeno oksidativno poškodbo jeter in ledvic ter poškodbo DNK pri podganah. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology 2020, 34, 1- 12.