Aptamer aplikacije v nevroznanosti 2. del

Drugi nevrotransmiter, serotonin, igra vlogo pri dejavnostih nevromodulacije, ki vplivajo na spanje, agresijo, apetit in spolno aktivnost. Proizvaja se v različnih delih telesa, kot so možgani, hrbtenjača, trombociti in črevesje [81–84].

Serotonin je nevrotransmiter, ki ima pomembno vlogo pri fizičnem in duševnem zdravju človeka. V človeškem telesu serotonin uravnava razpoloženje, nadzira apetit in spanje ter spodbuja občutke telesnega užitka in dobrega počutja. Vendar ima serotonin pomembno vlogo tudi pri vplivu na spomin.

Raziskave so pokazale, da lahko serotonin spodbuja izboljšanje spomina z uravnavanjem signalizacije med nevroni. Ko so ljudje pozitivno stimulirani, telo sprosti serotonin, ki pomaga krepiti povezave med nevroni in izboljša učinkovitost spomina. Serotonin lahko tudi naredi ljudi bolj ustvarjalne, izboljša mentalno agilnost in jih spodbudi k hitrejšemu učenju in razmišljanju.

Poleg tega lahko serotonin pomaga zmanjšati simptome tesnobe in depresije, težave z razpoloženjem, ki lahko negativno vplivajo na koncentracijo in spomin ljudi. Veselo razpoloženje in duševno stanje lahko pogosto spodbujata ljudi, da prepoznajo in se naučijo novih stvari.

Če povzamemo, ima serotonin nepogrešljivo vlogo pri učenju našega fizičnega in duševnega zdravja ter spominu. Lahko povečamo sproščanje serotonina in [izboljšamo spomin] tako, da spremenimo svoje prehranjevalne navade, količino vadbe, metode učenja itd., gojimo pozitivno in zdravo miselnost ter se nenehno izzivamo, da nenehno spodbujamo izboljšanje spomina. Vidimo lahko, da moramo izboljšati spomin, in Cistanche deserticola lahko bistveno izboljša spomin, saj ima Cistanche deserticola antioksidativne, protivnetne in anti-aging učinke, ki lahko pomagajo zmanjšati oksidacijo in vnetne reakcije v možganih, s čimer ščitijo zdravje živčnega sistema. Poleg tega lahko Cistanche deserticola spodbuja tudi rast in popravilo živčnih celic ter tako izboljša povezljivost in delovanje nevronskih mrež. Ti učinki lahko pomagajo izboljšati spomin, učenje in hitrost razmišljanja ter lahko tudi preprečijo razvoj kognitivnih motenj in nevrodegenerativnih bolezni.

Kliknite poznajte dodatke za povečanje spomina

Neravnovesja ravni perifernega serotonina so povezana z več boleznimi, vključno s hipertenzijo, boleznijo ledvic in depresijo. Zato je uporaba serotonina za napoved stanja bolezni in za začetek ustreznega zdravljenja klinično pomembna.

Plazmonični test za serotonin je bil razvit s konjugatom aptamer-AuNP, katerega agregacija je spremenjena v prisotnosti serotonina. Spremembo agregacije delcev je mogoče izmeriti kot premik največje valovne dolžine absorpcije.

Test je pokazal specifičen odziv na serotonin in ni dal statistično pomembnega signala z njegovimi metaboliti, 5-hidroksiindolocetno kislino (5-HIAA), epinefrinom ali noradrenalinom, ko je bil vsak testiran pri 1 µM.

Fetalni goveji serum, kot posnemalec človeškega seruma, tudi ni sprožil nobenega signala [85]. Pred kratkim so bile razvite nevrosonde implantabilnega aptamerja s tranzistorjem polja (FET) za spremljanje ravni serotonina v možganskem tkivu. Ultratanke In2O3 površine nanometrskih FET-jev so bile spremenjene z aptameri in te nevrosonde so omogočile fM meje zaznavanja serotonina in vivo z minimalnim biološkim obraščanjem [86].

Z dodatnimi nevro sondami bodo možni prostorsko-časovni posnetki nevralne aktivnosti, tako da bo mogoče možganske funkcije razumeti na veliko globlji ravni. Epinefrin je kateholaminski nevrotransmiter s širokim spektrom fizioloških funkcij, pri katerih lahko nenormalne ravni povzročijo zdravstvene težave, kot so aritmija, miokardni infarkt, krvni zvišanje tlaka in pljučni edem.

Za opazovanje teh povezanih bolezenskih stanj je pomembno kvantificirati kroženje epinefrina. S tem namenom je bila razvita kolorimetrična detekcijska metoda, ki temelji na interakciji epinefrina z aptamerno funkcionaliziranim Au-NP. Sistem je cenejši in bolj specifičen od drugih tehnik za kvantifikacijo epinefrina, na primer s tekočinsko kromatografijo in spektrofotometrijo.

Poleg tega je bila z UV-vidno spektroskopijo določena meja zaznave 0,9 nM, kar je najnižja meja zaznave, zabeležena za epinefrin s katero koli kolorimetrično metodo. Analogi epinefrina, 3,4-dihidroksifenilocetne kisline (DOPAC), triptofana, askorbinske kisline, dopamina, tirozina in homovanilne kisline, so pokazali zelo malo ali nič odziva, kar kaže na visoko specifičnost aptasenzorja [87].

Sprememba ravni posameznega nevrotransmiterja lahko kaže na katero koli od več bolezni, zaradi česar je zelo malo verjetno, da bi lahko diagnozo bolezni postavili na podlagi meritve posameznega nevrotransmiterja. Zato bo zmožnost večine aptasenzorjev, da se vključijo v multipleksno platformo, povzročila diagnostična orodja, bolj primerna za klinike, in s potencialom za podporo natančnejše identifikacije bolezni.

2.3. Odkrivanje biomarkerjev
Biomarker je katera koli snov, struktura ali proces v telesu, ki povzroči izid ali nakazuje prisotnost določene bolezni. Mnogi biomarkerji so snovi, ki jih je mogoče izmeriti v biotekočinah, kot so kri, slina in urin.

Glavna težava pri karakterizaciji biomarkerjev za nevrološke bolezni je krvno-možganska pregrada (BBB), skozi katero številne molekule, vključno s številnimi proteini, ne morejo preiti. Čeprav so beljakovine prevladujoči biomarkerji za nekatere bolezni, je večja verjetnost, da bodo majhni peptidi, kot je nevropeptid Y ali fragmenti beljakovin, prešli skozi BBB in jih zaznali v obtoku.

Metaboliti so še ena pomembna skupina biomarkerjev za nevrološke motnje. NeoVentures Biotechnology Inc. je razvil pristop k izbiri aptamerjev, imenovan FRELEX, ki omogoča izbiro aptamerjev na podlagi tekmovanja med kratkim oligonukleotidom, pritrjenim na površino, in tarčo. Tako kot za celični SELEX in druge oblike SELEX s preklapljanjem strukture je mogoče ta protokol izvesti z vzorcem, ki vsebuje mešanico komponent brez predhodnega poznavanja tarče(-ov), za katero(-e) bodo izbrani aptamerji.

S temi oblikami SELEX se izvedejo nasprotni izbori z določenimi podskupinami komponent, da se spodbudi izbor aptamerjev, ki izpolnjujejo želene specifičnosti. Z uporabo FRELEX so bili aptamerji izbrani proti serumu transgenih miši, ki so čezmerno izražale človeški protein tau.

Za usmerjanje selekcije aptamerja proti človeškemu tau in posledicam prekomerne ekspresije tau je bil v protiselekciji uporabljen serum miši divjega tipa. Skupina je identificirala obogatena zaporedja aptamerjev z uporabo NGS in karakterizirala nekatere aptamerje za transgene miši v pozni fazi in miši divjega tipa s primerjavo njihovih relativnih številčnosti.

Domnevali so, da razlika v številčnosti odraža posamezno koncentracijo epitopov (povečanih kot odziv na čezmerno izražanje tau), s katerimi lahko aptamerji interagirajo [29].

3. Diagnostične in terapevtske aplikacije

Nevrodegenerativne bolezni (ND) vključujejo degeneracijo nevronov v možganih, kar povzroči izgubo struktur in funkcij centralnega živčnega sistema. ND je lahko posledica staranja, genetskih in okoljskih dejavnikov.

Demenca je ena najpogostejših s starostjo povezanih bolezni, kot je Alzheimerjeva bolezen (AD). Parkinsonova bolezen (PD) je lahko posledica genetskih mutacij in/ali okoljskih toksinov. Amiotrofična lateralna skleroza (ALS), multipla skleroza (MS), Huntingtonova bolezen (HD) in prionske bolezni so druge pogoste bolezni z genetskimi povezavami.

Na žalost za te bolezni ni na voljo niti učinkovitih zdravil niti strategij zgodnjega odkrivanja. Tako kot široko uporabljena protitelesa so aptamerji postali privlačna sredstva za uporabo pri razvoju novih biosenzorjev za zgodnjo diagnozo NB in ​​zdravljenje teh bolezni [88].

3.1. Alzheimerjeva bolezen

AD je najpogostejša oblika demence kot s starostjo povezana progresivna možganska motnja, ki ima za posledico duševne pomanjkljivosti. Za njegovo patologijo je značilno združevanje amiloida (A), ki izhaja iz amiloidnega prekurzorskega proteina (APP) in se sproži v možganski regiji hipokampusa.

Čeprav so znanstveniki domnevali, da je nevrotoksičnost, ki jo povzroči A, povezana z netopnimi A plaki (AP) in fibrili (AF), nedavni dokazi kažejo, da so topni A oligomeri (AO) prav tako povezani z nastopom AD.
Zato je bil AO opredeljen kot privlačen biomarker za zgodnjo diagnozo AD, A in tau pa veljata za pomembne terapevtske tarče za zdravljenje AD [89].

3.1.1. AD Diagnostika

Zgodnje opisani aptamerji proti AO so imeli nizke afinitete in specifičnosti, vendar so bile poznejše študije uspešnejše pri identifikaciji aptamerjev, ki so selektivno prepoznali fibrile 40-ostanka A (A 40), ne pa tudi polimerov A 40 [90].

Vendar pa aptamerji niso imeli visoke specifičnosti za fibrile A 40 v primerjavi z fibrili več drugih amiloidogenih proteinov, ki so bili testirani. Aptamer DNA, izbran za interakcijo z -sinukleinskim (-syn) oligomerom z afiniteto 68-nM, se je prav tako pokazalo, da veže AO z afiniteto 25-nM [91]. Leta 2019 je bil z uporabo istih aptamerjev, ki so jih pridobili Tsukakoshi et al., razvit elektrokemični aptasenzor brez oznak za bolj specifično prepoznavanje AO [92].

Aptamer sam sestavi elektrode iz zlate palice prek interakcije s tiolom (-S), sistem pa ima mejo zaznavanja 30 ppm, ki jo določa EIS. To je bil prvi aptasenzor, ki je bil uspešno uporabljen za spremljanje agregacije proteina A na podlagi EIS, kar je bilo mogoče zaradi visoke selektivnosti aptamerja med vrstami A. Z enostavno izdelavo in učinkovito regeneracijo je ta aptasenzor lahko obetavno diagnostično orodje za zgodnje odkrivanje AD in za prikaz kopičenja beljakovin A [92].

Aptasenzor za odkrivanje oligomerov A je bil razvit z uporabo aptamera -syn DNA [91] v kompleksu z metilen modrim (MB) in pritrjenega na nanoporozni anodikalluminij. Visok absorpcijski koeficient MB za belo svetlobo je povzročil nizko intenzivnost odbite bele svetlobe.

V prisotnosti oligomerov A je kompleks aptamer/MB disociiral in povečanje odbite svetlobe je bilo zaznano z interferometrično refleksijsko spektroskopijo (IRS) [93]. Aptasenzor je imel mejo zaznavanja 8 pM in dober odziv na oligomere A v območju koncentracije od 0.5 do 50 nM. Nevrofibrilarni pentlji (NFT) so patološki znaki AD.

Tvorba NFT se začne v hipokampusu in obseg tvorbe NFT je povezan z resnostjo demence pri AD. Hiperfosforilacija proteina tau, povezanega z mikrotubulami, spodbuja njegovo sposobnost rekrutiranja in organiziranja normalnega tau v filamente, ki postanejo NFT. Tako je hiperfosforilacija tau predlagana kot eden od glavnih vzrokov za AD.

Poleg njegove normalne vloge pri pospeševanju sestavljanja mikrotubulov in stabilizaciji sestavljenih mikrotubulov so tau opazili z neravnovesno kapilarno elektroforezo (CE), da veže tri naključno izbrane oligonukleotide ssDNA, od katerih je eden, ssDNA1, vezan na tau381 z visoko afiniteto (Kd {{ 3}} nM) [94].

Aptamer/protitelesni sendvič test je bil razvit z uporabo ssDNA1 za odkrivanje femtomolarnih koncentracij proteina tau v človeški plazmi s površinsko plazmonsko resonanco (SPR) [95].

V drugi študiji so bili aptamerji DNA izbrani proti celotnemu proteinu tau s 441 aminokislinami (tau441) s tehniko hitre selekcije, ki temelji na delitvi kapilarne elektroforeze s tremi krogi selekcije, opravljenimi v enem dnevu. SPR je ovrednotil pet aptamerjev, izbranih iz rezultatov sekvenciranja visoke prepustnosti, glede na njihovo sposobnost prepoznavanja tau.

Analitični potencial aptamera z večjo afiniteto je bil dokazan s testom anizotropije homogene faze fluorescence. Ta aptamer z visoko afiniteto je v tem testu vezal protein tau441 in krajše izooblike tau352, tau381 in tau383 z mejami detekcije 28 nM, 6,3 nM, 3,2 nM in 22 nM [96].

3.1.2. AD terapevtika

Kot eno od potencialnih terapij so bili izbrani RNA aptameri za zaviranje agregacije A 40. Med selekcijo je bil oligomer A konjugiran z nanodelci zlata (A -AuNP) in dva aptamerja sta bila identificirana kot kandidata za aptamer po SELEX-u.

Otroci od 10–20 nM. Ti aptamerji so zavirali nastajanje plaka in fibril A, kot je razkrila transmisijska elektronska mikroskopija in encimsko imunski test A 40 (ELISA) [97].

Vabni peptid (DP) alkoholne dehidrogenaze (ABAD), ki medsebojno deluje z A, antagonizira citotoksičnost peptida A. Zaporedje ABAD-DP je bilo vstavljeno med dva tiola, ki tvorita disulfidno vez v tioredoksinu (TRX), da se ustvari TRX1-ABAD-DP-TRX2peptidni aptamer. Njegovo stabilno izražanje v celicah NIH 3T3 z uporabo adeno-povezanih virusov je bilo potrjeno z imunofluorescentnim barvanjem.

Izraženi aptamer bi lahko vezal peptid A in izboljšal sposobnost preživetja celic. Ta preiskava je potrdila učinkovito inhibicijo citotoksičnega učinka peptida A s peptidnimi aptameri [98]. Tau proteini se običajno povezujejo z mikrotubulami in jih stabilizirajo, vendar lahko njihova hiperfosforilacija povzroči nastanek proteinskih agregatov, imenovanih "tauopatija", ki je strupen.

DNA aptamer Tau-1, ki je bil izbran proti človeškemu tau441, zavira oligomerizacijo Tau1 in vitro [99]. Ta inhibicija je bila potrjena tudi v študijah celične kulture z uporabo celic HEK293 [100]. Beta-sekretaza (BACE1) ima vlogo pri proizvodnji A in inhibicija izražanja BACE1 je pri miših smrtna. Zdravljenje AD lahko vključuje modulacijo BACE1.

Vendar pa je zaradi njegovega velikega aktivnega mesta BACE1 zahtevna tarča za inhibitorje majhnih molekul. Da bi se temu izognili, so lahko aptameri nukleinske kisline nova orodja za zaviranje aktivnosti BACE1. Ta encim ima citoplazmatski rep, B1-CT, ki služi kot priklopno mesto za proteine, kot je bakrov spremljevalec za superoksid dismutazo-1 (CCS) in beljakovino vezave faktorja ribozilacije (GGA1) ADP.

Fiziološka vloga B1-CT je večinoma neznana. RNA aptamer, ki je bil usmerjen na B1-CT, vezan na membransko proksimalno polovico konca C BACE1, je preprečil rekrutacijo CCS, medtem ko je omogočil vezavo GGA1 na BACE1 in uravnavanje transporta BACE1 v reciklirane endosome [101].

Za specifično ciljanje na BACE1 sta bila ustvarjena aptamera DNA, BI1 in BI2, proti BACE1, ki sta zavirala BACE1, ne pa niti alfa- niti gama-sekretaze. Z uporabo stabilno transfektirane celične linije HEK293 so izrazili prekurzor amiloidnega proteina (APP) in z in vitro testom fluorescenčnega resonančnega prenosa energije (FRET) pokazali, da je bila raven A znižana in da je bila celična pomanjkljivost rešena v primarni kultivirani liniji nevronskih celic [102]. Učinkovitost aptamerja smo dodatno izboljšali z dodatkom holesteriltetraetilen glikola (TEG).

3.2. Parkinsonova bolezen

Parkinsonova bolezen (PD) je druga najpogostejša nevrodegenerativna bolezen, ki prizadene približno sedem milijonov ljudi po vsem svetu. Čeprav je napredujoča bolezen, za katero so značilne motorične in nemotorične značilnosti, ima pomembne klinične učinke na bolnike zaradi izgube mobilnosti in nadzora nad mišicami.

Za PD je značilna izguba striatnih dopaminergičnih nevronov in izguba nevronov na nedopaminergičnih področjih. Izguba nevronov je na splošno povezana z značilno tvorbo Lewyjevega telesca. Tako se prisotnost Lewyjevih teles, ki vsebujejo -syn oligomere v možganih, šteje za možen terapevtski in diagnostični cilj za PD.

3.2.1. Diagnostika PD

Prvi aptamer, "M5-15", izbran proti -syn, ni bil specifičen za oligomere in se je lahko vezal tudi na -syn monomere [103]. Pokazalo se je, da aptameri DNA, nato izbrani, medsebojno delujejo z -syn oligomeri in ne z -syn monomeri, vendar so vezali oligomere A 1–40.

Raziskovalci so raziskali tudi specifičnost aptamerja za -syn oligomere v primerjavi z drugimi proteini s strukturami, ki so pretežno -sheet, kot je propelerna struktura -sheet pirolokinolin kinin glukoza dehidrogenaze (PQQH), in dokazali, da aptamer ni vezal PQQH [91]. Poročali so, da so aptasenzorji sposobni kvantificirati sinoligomere.

Kolorimetrični aptasenzor, ki uporablja aptamer DNA proti -sinoligomeru, je bil adsorbiran na nanodelce zlata (AuNP), kar je preprečilo agregacijo nanodelcev, ki jo povzroča sol. Njegova vezava na -syn oligomer preprečuje absorpcijo aptamerja na površino AuNP, kar omogoča, da se agregacija AuNP sproži pri visokih koncentracijah soli in povzroči spremembo barve.

Za ta sistem so poročali z LoD 10 nM. Vendar pa je serum (celo pri 2 %) prispeval k absorpciji spojin v območju spremembe barve v testu in motil od soli odvisno agregacijo aptamer-Au-NP.

Aptasenzorji, ki uporabljajo EIS in SPR, so bili bolj občutljivi, z LoDs 1 pM oziroma 8 pM [104]. Aptasenzor EIS je bil zelo specifičen za oligomere namesto monomerov in nanj ni vplivala prisotnost seruma [104]. Izpopolnjena zasnova za elektrokemični aptasenzor za odkrivanje -syn oligomera je vključevala hibrid, ki ga tvori komplementarna sekvenca -syn oligomernega aptamerja, povezanega s površino zlata preko tiolne vezi, in je vključevala terminalno deoksinukleotidil transferazo (TdT) in dTTP za razširitev 30-koncev aptamerja in njegovega dopolni z dodatnim polipom.

Razširjena ssDNA je vezala metilensko modro in spodbujala njegovo povezavo z zlato površino ter tako ustvarila elektrokemični signal. Poleg tega je sistem vseboval eksonukleazo I (Exo I), ki je specifična za ssDNA. Ko je bil aptamer odstranjen iz binarnega kompleksa z njegovim komplementom z njegovo vezavo na -syn oligomer, so bile komplementarne verige prebavljene z Exo I, kar je preprečilo kopičenje metilen modrega na zlati površini in tako zmanjšalo elektrokemični signal.

Meja detekcije je bila 10 PM (S/N=3) in izkoristek signala v prisotnosti 10 % in nižjih koncentracij seruma je bil zelo sprejemljivih 95,3–107 % [105]. Vendar je zaradi njegove zapletenosti in vključitve encimov manj verjetno, da bo ta sistem stabilen za shranjevanje in ponovljiv na terenu. Kombinacija kapilarne elektroforeze in masne spektrometrije (CE-MS) z ekstrakcijo v trdni fazi (SPE) za predhodno koncentriranje tarče z mikrokartušo, modificirano z aptamerjem, v velikem obsegu vbrizganih vzorcev je 100-krat zmanjšala mejo zaznave v primerjavi s sistemi CE-MS.

V tem novem sistemu je vzorec očiščen, prostornina pa zmanjšana za izboljšano analizo z uporabo mikro kartuše, ki selektivno zadrži tarčo. Ugotovljeno je bilo, da je sorbent z afiniteto za aptamer (AA) v kartuši boljša alternativa protitelesom imunoafinitetni (IA) sorbent kot elektroliti v ozadju, potrebni za izpiranje sistema, tudi denaturirajo protitelesa.

Razvoj AA-SPE-CE-MS je bil dosežen s spreminjanjem mikro kartuše z M5-15 DNA aptamerjem. Sistem je pokazal LoD 2,8 nM in imel linearno območje zaznavanja med 7 in 140 nM -syn v vzorcu krvi.

Poleg tega je bila identifikacija prostih in N-acetiliranih -syn proteooblik mogoča zaradi zelo natančnega množičnega zaznavanja in ločljivosti MS. Končno je bilo ugotovljeno, da je mikrokartuša stabilna tudi s kislim BGE in jo je bilo mogoče uporabiti za približno 20 analiz z majhno možnostjo napačne kvantifikacije tarče [106].

For more information:1950477648nn@gmail.com