Poti, odvisne in neodvisne od receptorjev arilnih ogljikovodikov, posredujejo učinke kurkumina proti staranju

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Povzetek:Receptor arilnega ogljikovodika (AhR) je z ligandom aktiviran transkripcijski faktor, katerega aktivnost je mogoče modulirati s polifenoli, kot je kurkumin. AhR in kurkumin imata evolucijsko ohranjene učinke na staranje. Tu smo raziskali, ali in kako AhR posreduje učinke kurkumina proti staranju med vrstami. Z uporabo kombinacije analiz in vivo, in vitro in in silico smo dokazali, da ima kurkumin od AhR odvisne ali neodvisne učinke na kontekstno specifičen način. Ugotovili smo, da pri Caenorhabditis elegans AhR posreduje s kurkuminom povzročeno podaljšanje življenjske dobe, najverjetneje prek od liganda neodvisnega inhibitornega mehanizma, povezanega z njegovo antioksidativno aktivnostjo. Kurkumin je pokazal tudi od AhR neodvisne aktivnosti proti staranju, kot je zaščita pred proteini, ki so nagnjeni k agregaciji, in oksidativni stres pri C.elegans ter spodbujanje migracijske sposobnosti človeških primarnih endotelijskih celic. Ti od AhR neodvisni učinki so v veliki meri posredovani s potjo Nrf2/SKN-1.

Za več informacij kliknite tukaj

Ključne besede:arilni ogljikovodikov receptor; kurkumin; oksidativni stres; Caenorhabditis elegans; miši; endotelne celice; in vivo; in vitro; in silico

1. Uvod

Receptor arilnega ogljikovodika (AhR) je povsod prisoten z ligandom aktiviran transkripcijski faktor, opredeljen kot determinanta toksikološkega odziva na 23,7,8-tetraklorodibenzo-p-dioksin (TCDD) pri sesalcih [1]. Signalne poti AhR so dobro opisane v celicah sesalcev. Na kratko, neligandni AhR je lokaliziran v citoplazmi in stabiliziran z različnimi kofaktorji, kot je 90-kDa protein toplotnega šoka (Hsp90), protein, ki interagira z AHR (AIP), in spremljevalec p23. Vezava na eksogene (npr. TCDD) ali endogene (npr. kinurenin) ligande spodbuja translokacijo tega kompleksa v jedro, kjer AhR disociira od svojih kofaktorjev in se sestavi v heterodimer z jedrnim translokatorjem AHR (ARNT). Nastali kompleks AHR/ARNT se veže na elemente, odzivne na ksenobiotike (XRE) baterije odzivnih genov za razstrupljanje faze I in II, kar sčasoma vodi do razgradnje ligandov [2]. Poleg svoje vloge pri odzivu na ksenobiotike deluje za AhR v različnih patofizioloških procesih, od imunosti [3,4], vnetja [5,6], presnove lipidov in glukoze [7,8] do srčno-žilnih, jetrnih in bolezni drugih organov [9-12], so odkrili v zadnjih desetletjih. Vse več dokazov kaže tudi na različne in navidezno nasprotujoče si vloge AhR v procesu staranja, ki bi jih bilo kljub temu mogoče uskladiti ob upoštevanju učinkov, specifičnih za tkiva, odmerke in vrste [13].cistanche Genghis KhanNegativna vloga AhR pri staranju in značilnostih, povezanih s starostjo, je bila opisana pri različnih vrstah [14, 15]. V primerjavi z divjim tipom Caenorhabditis elegans ima mutirani sev AhR, ahr-1(ju145), daljšo življenjsko dobo in dolgo življenjsko dobo; pri miših pomanjkanje AhR izboljša delovanje žil in poveča aktivnost sintaze dušikovega oksida in s tem biološko uporabnost NO; in nazadnje je bila ugotovljena pozitivna korelacija med izražanjem AhR in togostjo žil pri osebah srednjih let in starejših ljudeh [14]. Poleg tega je bila v epidemiološki študiji na kitajskem prebivalstvu izražanje AhR povezano s pojavnostjo koronarne arterijske bolezni [16].

Cistanche lahko upočasni staranje

Omeniti velja, da lahko številne spojine, ki vplivajo na staranje ali s starostjo povezane bolezni [17-19], modulirajo aktivnost AhR [20-22]. Medtem ko aktivacija AhR s ksenobiotiki vodi do različnih vrst raka pri sesalcih [23, 24], se je pokazalo, da imajo prehranski in okoljski dejavniki nasprotne učinke, odvisne od AhR, na zdravje C.elegans [25]. Med prehranskimi modulatorji AhR so bili polifenoli, kot je kurkumin, v veliki meri raziskani zaradi njihovih učinkov na zdravje. Kurkumin je rumeni pigment iz Curcuma longa s številnimi evolucijsko ohranjenimi koristnimi lastnostmi, vključno z antioksidativnim, protivnetnim delovanjem in delovanjem proti staranju [26]. Kurkumin preprečuje agregacijo beljakovin in podaljša življenjsko dobo pri C.elegans in Drosophila z modulacijo homeostaze beljakovin [27-29].cistanche podaljšanje življenjske dobePoleg tega je pri uporabi transgenega mišjega modela z Alzheimerjevo boleznijo znatno zmanjšal celotno obremenitev z amiloidom beta(A) [30]. Pri starih miših je kurkumin obnovil biološko uporabnost NO, s čimer je zmanjšal oksidativni stres in izboljšal endotelijsko disfunkcijo in togost arterije, ocenjeno s hitrostjo pulznega vala aorte (PWV) – eno najpomembnejših kliničnih meritev ali markerjev togosti velike elastične arterije [31]. Več študij pri ljudeh je pokazalo tudi zaščitni učinek kurkumina na zdravje srca in ožilja [32]. Vendar pa je način delovanja kurkumina še vedno v veliki meri nejasen in, kar je še pomembneje, ni bilo raziskano, ali njegove ugodne učinke na zdravje posreduje AhR [33,34].

Modelni organizmi, kot je ogorčica C.elegans, so bili ključni pri prepoznavanju genetskih in okoljskih dejavnikov staranja. To je posledica njegovih številnih ugodnih lastnosti, vključno z enostavnim laboratorijskim rokovanjem, kratko življenjsko dobo in proizvodnjo velikega števila potomcev s samooploditvijo. Genom C.elegans je popolnoma sekvenciran in večina njegovih genov in poti je evolucijsko ohranjenih. Proteinsko zaporedje AhR se med evolucijo ohrani in pri C.elegans so ortologi AhR in ARNT kodirani z AhR povezanim (ahr-1) in ahr-1 povezanim (aha{{4 }})geni [35]. Ustrezna proteina, AHR-1 in AHA-1, si delita približno 40 odstotkov svoje sekvence s proteini sesalcev in tvorita heterodimer (tudi s sorodniki sesalcev), ki lahko veže XRE tarče genov in vitro [36].cistanche nzAHR-1 se večinoma izraža v vrstah nevronskih celic, kot so GABAergični nevroni [37l], in ima ključno vlogo pri nadzoru nevronskega razvoja [38]. Za razliko od AhR vretenčarjev AHR-1 ne veže TCDD in drugih sorodnih ksenobiotikov [35,39], vendar ima skupne značilnosti z AhR sesalcev pri uravnavanju nevronskih procesov, razvoja in plodnosti [37,38,{ {8}}], kar na koncu nakazuje, da AhR prednikov ni bil neposredno vključen v nadzor genov za razgradnjo toksičnih ligandov [44,45]. Tako smo prepoznali C.elegans kot edinstven in močan modelni sistem za identifikacijo in preučevanje funkcij prednikov AhR, ki morda niso povezane z njegovim odzivom na ksenobiotike.

V tej študiji smo raziskali vlogo AhR pri učinkih kurkumina proti staranju med vrstami. S kombinacijo analiz in vivo, in vitro in in silico smo ugotovili, da ima kurkumin različne koristne učinke proti staranju prek nepovezanih mehanizmov, odvisnih in neodvisnih od hr-1-. Ugotovili smo, da so živali, osiromašene s C.elegans ahr-1-, dolgožive, vendar bolj občutljive na oksidativni stres. Čeprav kurkumin ni dodatno podaljšal življenjske dobe mutantov C.elegans ahr-1, je spodbudil njihovo odpornost na oksidativni stres. Kurkumin je prav tako spodbujal antioksidativni odziv in migracijsko sposobnost človeških primarnih endotelijskih celic (EC) neodvisno od AhR, učinek, ki je bil v prvi vrsti odvisen od Nrf2/SKN-1 med vrstami. SKN-1 je C.elegans ortolog redoks transkripcijskega faktorja človeškega Nrt2 (z jedrskim faktorjem eritroid 2-povezan faktor 2), ki ima evolucijsko ohranjeno vlogo pri celični in organski homeostazi ter odzivu na oksidativni stres [ 46,47] Rezultat spajanja iz testa celičnega reporterja in in silico modeliranja domene vezave liganda AHR-1 (LBD) smo nato pokazali, da je kurkumin najverjetneje zavrl aktivnost AHR-1 v ligand- neodvisen od vezave način. Predvsem in v skladu s podatki v C.elegans in EC so kurkumin in prooksidanti pokazali nasprotne učinke na aktivnost AHR-1, kar nakazuje, da lahko kurkumin modulira aktivnost AHR-1 prek svoje antioksidativne sposobnosti bodisi neposredno ali posredno preko regulacije Nrf2/SKN-1 ali drugih redoks regulativnih proteinov.

2. Materiali in metode

2.1. C.elegan1s

2.1.1. C. elegans Sorte in gojenje

Uporabili smo naslednje seve C.elegans: N2 [divji tip], CZ2485 [ahr-1(jul45)], NV38b [alhr-1(ju145);unc-54p:Q40 :YFP], NV38wt [unc-54p::Q40:YFP] (izvirni sev AM141 [48]), NV42a [unc-54p::alphasymuclein::YFP, ahr-1 (jul45)], NV42wt [unc-54p::alphasynuclein::YFPI (originalni sev NL5901 [49]), NV35a [ahr-1(ju145);(pAF15)gst-4 p::GFP::NLS], NV35wt (pAF15)st-4p::GFP::NLS](originalni sev CL2166). Za vzdrževanje so bili črvi sinhronizirani z odlaganjem jajčec pri 20 stopinjah na nematodnem rastnem mediju (NGM) plošče in hranjene z E.coli OP50, v skladu z metodami, opisanimi v [25]. Za poskuse so bili črvi sinhronizirani na ploščah, dopolnjenih z E.coli HT115(DE3), na ploščah, dopolnjenih z 1 mM IPTG (Fisher Scientific, Geel, Belgija).

2.1.2. Utišanje genov z interferenco, posredovano z RNA (RNAi)

Utišanje genov je bilo doseženo s hranjenjem E.coli HT115(DE3), ki izraža plazmide, z dsRNA proti specifičnim genom [50]. Hranjenje z RNAi je bilo uporabljeno neprekinjeno od rojstva do smrti. Za test odpornosti proti juglonu z bakterijami HT115(skn-1) smo črvi L4 hranili z RNAi 24 ur, preden smo jih prenesli na sveže plošče juglona.

2.1.3. Sevi in ​​rast E.coli

Bakterije so gojile v gojišču LB pri 37 stopinjah čez noč. Pri uporabi nosilnih vektorjev E.coli smo medij LB dopolnili z 0.01 odstotkom ampicilina in 0,0005 odstotka tetraciklina. E.coli HT115(L4440), HT115(ugt{{8} }),HT115(skn-1) in OP50 so bili pridobljeni iz knjižnice RNAi Ahringer C. elegans [51].

2.1.4. Življenjska doba

Analiza življenjske dobe se je začela s sinhronizirano populacijo črvov, ki so jo v plodnem obdobju vsak dan prenašali na sveže NGM plošče. Po plodni fazi so živali prenašali vsak drugi dan. Mrtve, žive in cenzurirane živali so bile ocenjene med postopkom prenosa. Živali so šteli za mrtve, ko niso pokazale niti gibanja niti odziva na ročni dražljaj s platinasto žico niti aktivnosti črpanja žrela. Živali z notranjim izvalitvijo (vrečke) in eksplodirano vulvo ali živali, ki so umrle posušene na steni, so bile cenzurirane. Število mrtvih in cenzuriranih živali je bilo uporabljeno za analizo preživetja v OASIS[52] ali OASIS 2[53]. Za izračun povprečne življenjske dobe in krivulje preživetja v OASIS in OASIS 2 je bil uporabljen Kaplan-Meierjev ocenjevalec, p-vrednosti pa so bile izračunane s testom log-rank med združenimi populacijami živali.

2.1.5. Gibanje/zdravje

Gibanje je bilo postavljeno kot parameter zdravega staranja, faza aktivnega gibanja pa je označena kot obdobje zdravja. Ocenjeno je bilo v populacijah, uporabljenih za analizo življenjske dobe. Živali, ki so se plazile spontano ali po ročnem dražljaju, so bile obravnavane kot premikajoče se, medtem ko so bile mrtve živali ali živali brez vedenja plazenja obravnavane kot negibljive. Statistična analiza je bila opravljena, kot je opisano za življenjsko dobo.

2.1.6. Zdravljenje C. elegans s kurkuminom

Kurkumin (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Nemčija) je bil raztopljen v DMSO (Carl Roth, Karlsruhe, Nemčija) v koncentraciji 100 mM in doveden v NGM po avtoklaviranju. Končna koncentracija kurkumina v mediju je bil 100 μM（0,1 odstotka DMSO）. Kontrolne plošče so vsebovale 0,1 odstotka DMSO. Črve smo zdravili neprekinjeno, začenši z jajčeci.

2.1.7. Kvantifikacija agregatov PolyQ

Agregate PolyQ40 smo vizualizirali s fluorescenčno mikroskopijo (100-kratna povečava) v 10-dnevnih črvih, anesteziranih s 15 mM natrijevim azidom (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Nemčija). Za oceno števila agregatov so bile slike sestavljene z uporabo vtičnika Fidži pair-wise stitching [54], da so se ustvarili celi črvi, število agregatov pa je bilo kvantificirano na Fidžiju [55] z uporabo vtičnika "Analiza delcev".

2.1.8. Kvantifikacija agregatov x-Synuclein

-sinukleinske agregate v mišicah glave 7-dnevnih črvov smo vizualizirali s fluorescenčno mikroskopijo (400× povečava) pri črvih, anesteziranih s 15 mM natrijevim azidom (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Nemčija, S2002 ). Slike so bile segmentirane z uporabo Plastik (različica 1.3.0) (Laboratorij Anne Kreshuk pri Evropskem laboratoriju za molekularno biologijo, Heidelberg, Nemčija) (na voljo na https://www.ilastik.org/, dostopno 10. aprila 2018) [56] . Segmentirane slike so bile uporabljene za analizo števila agregatov na Fidžiju [55] z uporabo vtičnika "Analiza delcev".

2.1.9.Microarray in analiza izrazov GO

Zbrani so bili vzorci iz petih neodvisnih ponovitev s približno {{0}} dni starimi črvi na stanje, RNA pa je bila ekstrahirana in naložena v čip Affymetrix. Surovi podatki mikromrež v formatu CEL so bili analizirani s programsko opremo R (različica 3.4.2) (R Foundation, Dunaj, Avstrija) in Bioconductor (Projekt Bioconductor, Bioconductor je odprtokoden in odprt razvoj) [57]. Korekcija ozadja, normalizacija in izračun izražanja so bili izvedeni z oligo paketom58] in metodo RMA. Za nadzor kakovosti matrike je bil uporabljen paket arrayQualityMetrics 3.34.0 [59]. Zaradi meril kakovosti je bil vzorec ahr-1C5 izključen iz nadaljnje analize. Različno izraženi geni so bili identificirani z uporabo paketa limma in linearnega modela ter moderirane t-statistike s FDR za testiranje večkratnih primerjav [6{{20}}]. Uporabljena je bila p-vrednost 0,1. Različno izraženi geni so bili analizirani za obogatitev izrazov Gene Ontology z uporabo Cytoscape (različica 3.6.0) (The Cytoscape Consortium, neodvisna neprofitna organizacija) [61] z vtičnikom ClueGo (različica 2.5.0) (Laboratorij za integrativno Cancer Immunology, Pariz, Francija) [62]. Do podatkov mikromrež je mogoče dostopati prek pristopne št. Gene Expression Omnibus. GSE195769.

2.1.10. Kvantifikacija ROS

MtROS so odkrili v živih mutantnih črvih wt in ahr-1 z uporabo MitoSOX Red (Ther-moFisher Scientific, Dreieich, Nemčija). Nematode so bile sinhronizirane z odlaganjem jajčec na plošče IPTG z uporabo bakterij HT115 (L4440) kot hrane. Nato je bilo 48 ur kasneje 50 živali na stopnji L4 prenesenih na sveže pripravljene 10 μM MitoSOX rdeče plošče, posejane z UV-uničenim HT115 (L4440). Črvi so bili inkubirani v temi pri 20 stopinjah. Po 16-urni inkubaciji so jih prestavili na nove NGM plošče, namazane z živim HT115 (L4440) za 1 uro, da so odstranili preostalo barvilo iz črevesja. Za slikanje so bile ogorčice nameščene na 2-odstotna stekelca z agarozno blazinico, anestezirane z dodatkom 10 mM levamisola in pritrjene s ProLongTM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Nemčija). Slike so bile pridobljene takoj z mikroskopom Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Inc., Köln, Nemčija) z uporabo objektiva 40 × in filtra DsRed. Nato je bilo ročno izbrano območje glave črva, integrirana intenzivnost pa je bila izračunana s programsko opremo za slikanje Fij 55.

2.1.11. Test tetrametilrodamin etil estra (TMRE).

Za oceno potenciala mitohondrijske membrane so bile ogorčice sinhronizirane z odlaganjem jajčec na ploščah IPTG, zasejanih z bakterijami HT115 (L4440). Na dan poskusa je bil TMRE (Invitrogen, Eugene, OR, ZDA) raztopljen v DMSO do koncentracije 5 mM in nato razredčen na 30 μM s toplotno inaktiviranim HT115（L4440） (30 minut, 65 stopinj ）). Dodali smo skupno 150 μL te raztopine na ploščo in pustili, da se suši v temi približno 30 minut. Šestdeset odraslih sinhronih črvov pri 1, 3 ali 5 dneh odraslosti smo pobrali na pripravljene plošče TMRE in pustili, da se madež vpije 2 uri v temi pri 20 stopinjah. Po obarvanju smo črve prenesli na plošče IPTG, posejane s toplotno inaktiviranim HT115 (L4440) in jih inkubirali 1 uro v temi pri 20 stopinjah, da odstranimo preostalo barvilo iz črevesja.velikost penisa cistancheZa slikanje je bilo 10 ogorčic nameščenih na 2-odstotna stekelca z agaroznimi blazinicami, anesteziranih z dodatkom 10 mM levamisola in fiksiranih s ProLongM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Nemčija). Za vsako poskusno serijo je bilo pripravljenih 5 preparatov na skupino. Slike so bile pridobljene takoj z mikroskopom Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Köln, Nemčija) z uporabo objektiva 2,5 × in filtra DsRed. Intenzivnost fluorescence je bila izračunana z uporabo Fijija [55].

2.1.12. Stopnja faringealnega črpanja in test motilitete

Nematode N2 in CZ2485 smo sinhronizirali z beljenjem [63] in jajca pustila pufru za valilna jajca (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3) čez noč pri orbitalnem stresanju. Ličinke L1 so opazili na NGM, ki je bil dopolnjen z 1 mM IPTG in je vseboval 0.1 odstotka DMSO ali 100 µM kurkumina. Kot hrana so bile uporabljene bakterije HT115（L4440）. Mlade odrasle črve smo zbrali s pufrom M9, centrifugirali (300 g × 3 min) in dvakrat sprali, da smo odstranili bakterije. Črvi so bili inkubirani z 0-1 mM H, O (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Nemčija) (100 črvov/100 µL) 2 uri pri orbitalnem stresanju. Kontrolne črve smo inkubirali samo s pufrom M9. Po 2 urah so črve premaknili na NGM, dopolnjen z 1 mM IPTG in ki je vseboval 0,1 odstotka DMSO ali 100 µM kurkumina, in zasejali z bakterijami HT115 (L4440) kot hrano. Hitrost faringealnega črpanja, ocenjena s štetjem, kolikokrat se je terminalni bulbus žrela skrčil v 1-minutnem intervalu (črpalke/min), in test gibljivosti, ocenjen s štetjem števila udarcev telesa (upogibi telesa/min) v pufra M9 v 1-minutnem intervalu so bili ocenjeni od 2 do 20 ur kasneje.

2.1.13. Test občutljivosti na akutni juglon

Nematode N2 in CZ2485 so bile sinhronizirane z odlaganjem jajčec na plošče NGM z DMSO ali 100 μM kurkumina. Ploščam smo dodali 1 mM IPTG in zasejali bakterije HT115(L4440) ali HT115(ugt-45) ​​kot hrano. Da bi ocenili učinek skin-1 RNAi, so črve sinhronizirali z odlaganjem jajčec na plošče z DMSO ali kurkuminom, posejane z bakterijami HT115(L4440). Ko so ogorčice dosegle stopnjo ličinke L4, so jih za 24 ur prenesli na plošče z DMSO ali kurkuminom, zasejane z bakterijami HT115(koža-1). Odrasle črve 1. dne (25 črvov) smo premaknili na sveže plošče NGM, ki so vsebovale 200 μM Juglone (Merck, Darmstadt, Nemčija) in zasejali s 25 μL 10 × koncentrirane bakterijske kulture čez noč. Preživetje črva pod oksidativnim stresom, ki ga povzroča juglon, je bilo preverjeno z gibanjem, ki ga je sprožil dotik, vsako uro, 6 ur. Živali so bile ocenjene kot mrtve, če se niso odzvale na dotik s platinasto žico. Nematode, posušene na steni, so bile cenzurirane. Ocenjeno je bilo število mrtvih in cenzuriranih živali, za analizo preživetja pa je bila uporabljena spletna aplikacija za analizo preživetja OASIS2 [53].

2.1.14. Kvantifikacija intenzivnosti GST-4:GFP

NV35wt in NV35a sta bila sinhronizirana z odlaganjem jajčec na plošče NGM, dopolnjene z 1 mM IPTG in vsebovale 0.1 odstotka DMSO ali 100 μM kurkumina. Kot hrana so bile uporabljene bakterije HT115（L4440）, HT115(ugt-45) in HT115(skin-7). Za vizualizacijo GFP fluorescence smo odrasle črve 1. dan anestezirali z 10 mM raztopino levamisol hidroklorida in jih namestili na 2-odstotne agarozne blazinice. Slike so bile takoj pridobljene z mikroskopom Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Köln, Nemčija), 2,5-kratna povečava) in nato analizirane s programsko opremo CellProfiler (projektna skupina CellProfiler, laboratorij Cimini na Broad Institute of MIT in Harvard, MA, ZDA). Na kratko, slike so bile obdelane s pomočjo cevovoda za segmentacijo črvov na vsaki sliki iz mikroskopije v svetlem polju in jih ločijo od ozadja. Nato je bila izmerjena integrirana intenzivnost GFP na črva.

2.1.15. Polkvantitativni PCR v realnem času (qPCR) pri C. elegans

Zbrani so bili vzorci iz 3 neodvisnih ponovitev s približno 1000 3-dnevnimi črvi na stanje in ekstrahirana RNA. Po izpiranju in eluciji je bila vsebnost RNA kvantificirana s spektrofotometrijo in 1-2 ug RNA je bilo uporabljeno za sintezo cDNA (Omniscript RT Kit (Qiagen, Hilden, Nemčija).cistanche v prahuPari primerkov so navedeni v tabeli S1. Za qPCR v realnem času je bila cDNA razredčena pri 1:2 0 v 10 mM TRIS (pH 8,0). Za reakcijo je bil uporabljen komplet qPCR Green Core (Jena Biosciences, Jena, Nemčija) ali komplet GoTaq⑧ qPCR (Promega, Walldorf, Nemčija). Vzorci so bili obdelani v ciklerju MyiQ2 (BioRad, Feldkirchen, Nemčija) in izražanje vsakega vzorca je bilo izmerjeno v dvojniku na isti plošči z več jamicami. Ekspresija je bila izračunana glede na referenčne gene act-1 in CDC-42 z uporabo programske opreme iO5. Vsi zbrani podatki so bili omogočeni za študijo genov v skladu z uporabniškimi navodili BioRad, ekspresija pa je bila izračunana z uporabo normalizirane ekspresije (ddCr). Učinkovitost vsake reakcije para primerjev je bila dodana za pravilno kvantifikacijo normaliziranega izražanja. Učinkovitost smo ocenili z razredčinami cDNA 1:20, 1:100, 1:500 in 1:2500. Iz normaliziranih vrednosti izražanja je bila za vsako ponovitev izračunana sprememba gub v primerjavi z divjim tipom.

2.2. Celice sesalcev

2.2.1. Gojenje celic Cos7

Celice Cos7 (ATTC, #CRL-1651) so bile gojene pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO v Dulbeccovem modificiranem orlovem mediju (DMEM) (Gibco/ThermoScientific, Dreieich, Nemčija) z 1 odstotkom piruvata, 1 odstotkom glutamaksa in 1 0 odstotkov fetalnega govejega seruma (FBS) (Gibco/ThermoScientific, Dreier-ich, Nemčija) in dodatni penicilin（10.000 enot/mL）/streptomicin （10.000 ug/ mL) Takoj, ko so celice zgradile konfluentno celično trato, so jih ločili od baze z uporabo 0,05-odstotnega Tripsina/EDTA (Thermo Scientific, Dreieich, Nemčija).

2.2.2. Transfekcijski plazmidi

Za transfekcijo celic Cos7 smo uporabili naslednje plazmide: pcDNA3, pcDNA3-Ahr-1-VP16,pcDNA3-AhA-1-VP16,pcDNA3-AhR -1(45. julij)-VP16, p1A1-FL, Perl-TK. Plazmide so opisali Larigot et al. (predloženo skupaj s to študijo). Plazmid p1A1-FL nosi XRE-inducibilno luciferazo, Perl-TK nosi renilla luciferazo, pcDNA3-Ahr-1-VP16 in pcDNA3-AhA{{24 }}VP16 nosilna zaporedja za izražanje C.elegans AHR-1 oziroma AHA-1. Za to študijo smo ustvarili pcDNA3-AhR-1(LBD)-VP16 s spletno usmerjeno mutagenezo plazmida pcDNA3-Ahr-1-VP16 s QuikChange II Site-Directed Komplet za mutagenezo (Agilent, Santa Clara, CA, ZDA). Naslednji par primerjev je bil uporabljen za ustvarjanje substitucije L v A pri L363 in substitucije H v Q pri H365 AHR-1:LBD-F5'-GAGAGCATCGGCGCGACCCAACGGCTGCTGAACGAG 3'andLBD-R5'-CTCGTTCAGCAGCCGTTGGGTCGCGCCGATGCTCTC-3 '.Super-kompetentne XL1-Blue celice smo transformirali s pridobljenim plazmidom za pomnoževanje. Zaporedje plazmidov je bilo preverjeno s Sangerjevim sekvenciranjem.

2.2.3. Prehodna transfekcija celic Cos7

24 ur pred transfekcijo je bilo 20 000 celic/jamico posejanih v 48-ploščo z vdolbinicami v 400 uL DMEM (plus 10 odstotkov FBS plus antibiotiki) in inkubirano pri 37 stopinjah. Celice smo nato transfektirali z naslednjimi koncentracijami plazmidov z uporabo lipofektamina 200 (Invitrogen, Eugene, OR, ZDA): p1A1-FL(244ng/jamico), Phil-TK(36ng/jamico),pcDNA3- AhA-1-VP16(5ng/jamico) in bodisi pcDNA3-VP16(10 ng/jamico), pcDNA3-Ahr-1-VP16(5 ng/jamico) ali pcDNA 3-AhR-1(ju145)-VP16(5 ng/jamico), kot so opisali Larigot et al. (predloženo skupaj s to študijo). Lipofectamine 2000 smo uporabili v koncentraciji 1 uL/vdolbino in ga predhodno inkubirali z ustreznimi plazmidi v DMEM 20 minut pred uporabo. Za prehodno transfekcijo smo celice Cos7 inkubirali z mešanico lipofektamina/plazmida for3hin DMEM (plus 10 odstotkov FBS) brez antibiotikov, da bi se izognili toksičnosti, povzročeni z antibiotiki. Nato je bil transfekcijski medij odstranjen in nadomeščen s 400 μL/jamico DMEM（ plus 10 odstotkov FBS plus antibiotiki）. Transfektirane celice smo inkubirali pri 37 stopinjah. Na vsaki plošči 2 vdolbinici celic nista bili transficirani in sta bili tako uporabljeni za namene normalizacije. 2.2.4. Obdelava celic Cos7

Za vse spojine so bile pripravljene osnovne raztopine v koncentracijah, 1000--krat višjih od želene koncentracije obdelave. Kurkumin (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Nemčija), benzo(a)piren (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Nemčija), leflunomid (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Nemčija) in lutein (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Nemčija) smo raztopili v DMSO ( Carl Roth, Karlsruhe, Nemčija), medtem ko sta bila resveratrol (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Nemčija) in rotenon (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Nemčija) raztopljena v etanolu (Carl Roth, Karlsruhe, Nemčija). 24 ur po transfekciji je bil medij celične kulture zamenjan z medijem celične kulture, ki je vseboval 1:100 razredčino zadevne spojine. Celice smo obdelali 24 ur pred oceno aktivnosti luciferaze.

2.2.5. Preizkus luciferaze (aktivnost AhR)

Transkripcijska aktivnost AhR je bila ocenjena z merjenjem aktivnosti luciferaze, ki jo poganja XRE [64]. Za to je bil uporabljen dvojni luciferazni reporterski testni sistem (Promega, Wall Dorf, Nemčija). Po 24-urnem zdravljenju smo celice Cos7 dvakrat sprali s PBS in nato lizirali 15 minut pri RT z uporabo pufra za pasivno lizo, ki je vključen v komplet Dual-Luciferase Reporter Assay. Skupno 20 μL liziranih celic smo dali v belo 96-ploščo z jamicami in uporabili za meritve luminiscence. Substrat luciferin (LARII) in vanilija (Stop&cGlo) smo pripravili po opisu proizvajalca. Vzorce smo naložili na luminometer (EG&G Berthold microplate Luminometer LB 96V Microluminomat plus (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Nemčija) in substrate pritrdili na cevni sistem luminometra. Najprej smo v vsako vdolbinico dodali 65 uL LARII vzorca in izmerili luminiscenco, ki jo proizvaja luciferaza kresničke, nato smo dodali 65 μL reagenta Stop&clo in izmerili luminescenco, ki jo proizvaja luciferaza Renilla.Za oceno aktivnosti AhR iz meritev luminiscence smo izvedli naslednjo naknadno obdelavo koraki: Najprej smo luminiscenco netransfektiranih celic odšteli od luminescence vsakega vzorca za korekcijo ozadja. V naslednjem koraku smo normalizirali luminiscenco luciferaze na renilla luminiscenco istega vzorca, da smo odpravili razlike v stopnji transfekcije in celici. Za vsako zdravljeno skupino smo izvedli še en normalizacijski korak za celice, transficirane s pcDNA-VP16, da bi odstranili AhR-indep. endentni učinki na luciferazo, ki jo poganja XRE.

Ta članek je izvleček iz Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants