Benzilirani dihidroflavoni in alkaloidi, pridobljeni iz izokinolina, iz lubja Diclinanona Calycina (Annonaceae) in njihova citotoksičnost

Za več informacij kontaktirajtetina.xiang@wecistanche.com

Povzetek: Diclinanona calycina RE Pomfrit, popularno znan kot "enviro", je vrsta iz družine Annonaceae, endemična za Brazilijo. V našem nenehnem iskanju bioaktivnih spojin iz amazonskih rastlin Annonaceae smo lubje D.calycina raziskali s klasičnimi kromatografskimi tehnikami, ki so dale trinajst spojin (alkaloidov in flavonoidov), ki so prvič opisani v D. calycina in v rodu Diclinanona. Struktura teh izoliranih spojin je bila ugotovljena z obsežno analizo z uporabo 1D/2D-NMR spektroskopije v kombinaciji z MS. Izolirani alkaloidi so bili identificirani kot pripadajoči podrazredom: enostavni izokinolin, thali online (1); aporfin, anonain (2); oksoaporfin, liriodenin (3); benziltetrahidroizokinolini, (S)-(plus )-retikulin(4); dehidro-oksonoretikulin (3,4-dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izokinolinil)(3-hidroksi-4-metoksifenil)-metanon)(5 );( plus )-1S,2R-retikulin Ng-oksid (6); in ( plus ) -1S,2S-retikulin N-oksid (7); tetrahidro protoberberin, koreksimin (8); in pavine, bisnorargemonin (9). Medtem ko jeflavonoidispadajo med benziliranedihidroflavoni, izorhamnetin (10), dichamanetin (11) in mešanica uvarinola (12) in izouvarinola (13). Spojina 5 je prvič v literaturi opisana kot naravni produkt. Citotoksično aktivnost glavnih izoliranih spojin so ovrednotili proti raku in nerakavim celičnim linijam. Med testiranimi spojinami so bili najbolj obetavni rezultati za benzilirane dihidroflavone dichamanetin (10) in mešanico uvarinola (12) in izouvarinola (13), ki je pokazala zmerno citotoksično aktivnost proti testiranimrakava celicačrte (<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). Dichamanetin (11) je pokazal citotoksično aktivnost proti HL-60 in HCT116 z vrednostmi IC50 15,78 ug·mL-I (33,70 umol·LI) in 18,99 ug∶mL-（40,56 umol. L-）, medtem ko je mešanica uvarinola（12） in izouvarinola (13) pokazala citotoksično aktivnost proti HL-60 z vrednostjo IC5 9,74 ugs.mL-1 in HCT116 z IC50 vrednosti 17,31 ug. mL-I. Te citotoksične aktivnosti je mogoče pripisati prisotnosti ene ali več hidroksibenzilnih skupin, prisotnih v teh molekulah, kot tudi položaju, v katerem so te skupine povezane. Citotoksično delovanje retikulina, anonaina in liriodenina je bilo že ugotovljeno, pri čemer je liriodenin najmočnejša spojina.

Ključne besede: Diclinanona calycina; alkaloidi in benzilirani dihidroflavoni; citotoksično delovanje

Kliknite, če želite izvedeti več o izdelkih

1. Uvod

Annonaceae je velika družina tropskih in subtropskih dreves in grmovnic, ki obsega približno 112 rodov in 2440 vrst [1]. Več vrst je znanih po svojih užitnih plodovih in zdravilnih lastnostih ]2]. Predhodne fitokemične raziskave z nekaterimi vrstami Annonaceae so vodile do izolacije in karakterizacije različnih razredov sekundarnih metabolitov, kot so monoterpeni, diterpeni, triterpeni, lignani,flavonoidi, fenilpropanoidi, pridobljeni iz asarona, acetogenini in predvsem tipični alkaloidi, pridobljeni iz izokinolina [3-7]. Nekateri od teh sekundarnih metabolitov, izoliranih iz vrst Annonaceae, so pokazali pomembne biološke aktivnosti, kot so protivnetne lastnosti in lastnosti zaviranja ureaze [8, 9], tripanocidne [10, 11], lajšmanicidne [11, 12], antimalarične [4, 13] , protimikrobno [4,14,15], antioksidativno in protirevmatsko delovanje [9,15] in zlasti citotoksično delovanje proti različnim človeškim tumorskim celičnim linijam [4,6,11,16-21].

Čeprav družina Annonaceae velja za primitivno in dobro raziskano družino, je bilo z njeno vrsto opravljenih le malo fitokemičnih in/ali farmakoloških študij[3]. Fitokemijske in/ali farmakološke študije so se zaradi velikega gospodarskega pomena osredotočile predvsem na vrste iz rodov Annona, Asimina in Cananga ter na nekatere vrste iz rodov Duguetia, Guatteria in Xylopia[5]. Kljub veliki rasti v zadnjih 20 letih v zvezi s fitokemičnimi in farmakološkimi študijami je število raziskanih vrst še vedno zelo majhno v primerjavi z velikim številom priznanih vrst. Glede na znanstvene baze podatkov Web of Science, Scopus in SciFinder ima trenutno samo približno 15 odstotkov opisanih vrst Annonaceae kakršno koli ustrezno fitokemično in/ali farmakološko študijo.

Med malo raziskanimi vrstami so tiste, ki pripadajo rodu Diclinanona Diels. Ta rod pripada plemenu Annoneae iz poddružine Annonoideae in se pojavlja samo v tropski Južni Ameriki (predvsem v regiji Amazonije). To je rod, ki ga sestavljajo le tri vrste, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas in Diclinanona tessmannii Diels, ki se pojavljajo kot drevesa [22-24]. D.calycina (sinonim Xulopia calycina Diels) je 8 do 30 m visoko drevo, popularno znano kot "envireira" in "enviro", razširjeno po celotnem porečju Amazonije v Braziliji, Peruju in Venezueli [23]. D.calycina je na videz podobna Xylopia zaradi svojih cvetov s podolgovatimi in ozkimi cvetnimi listi, vendar je drugačna zaradi svojih olesenelih, nedehiscentnih, kroglastih in debelostenskih monokarpov [23, 24].

Prejšnje študije z D. calycina poročajo le o farmakoloških študijah. Prva študija opisuje raziskavo protimikrobnega delovanja metanolnih, kloroformskih in vodnih izvlečkov proti mikroorganizmom Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus in Candida albicans z metodo gelske difuzije [25]. Drugi poroča o raziskavi protimikrobne aktivnosti organskih (diklorometan: metanol 1:1) in vodnih ekstraktov proti mikroorganizmu Enterococcus faecalis z uporabo testa z mikrodilucijsko brozgo (MDBA) in disk difuzijskega testa (DDA) [26]. Tako smo v našem nenehnem iskanju novih bioaktivnih naravnih izdelkov iz Annonaceae iz amazonskega deževnega gozda namen te študije raziskati fitokemične in farmakološke lastnosti lubja D.calycina. V tem poročilu je trinajst spojin (devet alkaloidov in štirje benziliranidihidroflavoni) so bili izolirani in prvič identificirani v D.calycina, kot tudi v rodu Diclinanona. Poleg tega so raziskali citotoksičnost glavnih spojin proti B16-F10, HepG2, K562 in HL{{ 4}} tumorskih celičnih linij z uporabo Alamar blue testa.

2. Rezultati in razprava

2.1. Strukturna razlaga spojin

Po odkritju prisotnosti dušikovih spojin v metanolnem ekstraktu z uporabo Dragendorffovega reagenta je bil izpostavljen kislinsko-bazični obdelavi po metodologiji Costa et al. [12] kar povzroči alkaloidne in nevtralne frakcije. V alkaloidni frakciji, ki je bila podvržena kromatografski analizi, so opazili visoko koncentracijo spojin, ki vsebujejo dušik. Zaporedna kromatografska ločevanja, kot je opisano v razdelku Ekstrakcija in izolacija, so vodila do izolacije in identifikacije trinajstih kemičnih sestavin (1-13, slika 1), devetih alkaloidov, pridobljenih iz izokinolina 1-9, in štirih benziliranih dihidroflavonov 10-13. Strukture teh izoliranih spojin (slika 1) so bile ugotovljene z obsežno analizo z uporabo 1D in 2D NMR spektroskopije v kombinaciji z MS (dodatni podatki) ter primerjavo s podatki iz literature.

Spojina 5 je bila pridobljena kot rjav amorfen prah in pozitivna na Dragendorffov reagent. Pokazal je protonirano molekulo pri m/z328 [M plus H]' v LR-ESI( plus )MS-kompatibilno z molekulsko formulo C18H1NO5. 'H in 13C-NMR spektra 5 (tabela 1) sta bila skladna s spektroma retikulina (4)[27, razen odsotnosti z dušikom vezane metilne skupine (CH3-N) in signala metinska skupina na položaju 1, ki je bila nadomeščena s signalom pri δc 165,1 v tipičnem 13C-NMR spektru iminske skupine, konjugirane na karbonilno skupino pri bc 192,8. V 'H-NMR spektru trije nizkopoljski vodiki pri δH 6,88（1H,d, J=8.4 Hz, H-5'）,5H7.57（1H,d, J{{33} }.0Hz, H-2'）in δH 7,60（1H, dd, J=8.4 in 2,0 Hz, H-6'） , je razkril prisotnost sistema za spenjanje ABX. Dva singletna signala pri 6H 6,90(1H,s, H-8) in 6,71(1H, s, H-5) sta pokazala prisotnost 1,2,4,5-tetrasubstituiranega fenilnega obroča. Poleg tega je H-NMR spekter 5 pokazal tudi signale za dve metoksi skupini, ki resonirata pri bH 3,93 (3H, s) in 6H 3,95 （3H, s）, in signale za dve metilenski skupini, ki resonirata pri δμ 2,79 (2H, t, J=7,8 Hz） in 6H 3,89(2H,t,/=7,8 Hz), pripisano H-4 oziroma H-3 (tabela 1) . Ti podatki so pokazali, da ima alkaloid 5 benziltetrahidroizokinolinsko ogrodje [28-30].

Te skupine so bile ustanovljene na podlagi korelacijske karte z dvema in tremi vezmi 'H-13C iz eksperimenta HMBC-NMR (slika 2 in tabela 1). Ta analiza je pokazala, da je vodik pri δH 3,89 （H-3）kazal tripasovno korelacijo 'H-13C z ogljiki pri 6c130.1（4a） in δc165.{ {42}}（C-1）in korelacija z dvema vezma lH-13C z ogljikom pri δc 25,4(C-4), kar potrjuje prisotnost iminske skupine v molekuli. Po drugi strani sta signala pri δH 7,57 （H-2'） in δH 7,60（H-6'） pokazala korelacijo s tremi vezmi lH-13C z ogljiki pri δc 124,3（ C-6'）,5c 151,4（C-4'）in δc192.8（C-7）,in 5c116.0（C-2'）,6c 151.4 (C-4') oziroma c 192,8(C-7'), kar določa karbonilno skupino v molekuli (slika 2 in tabela 1). Zato je na podlagi teh NMR podatkov spojina 5

je bil ugotovljen kot benziltetrahidroizokinolinski alkaloid 34-dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izokinolinil)(3-hidroksi-4-metoksifenil)-metanon, ki je bil imenovan dehidro-oksonoretikulin. Ta alkaloid je v literaturi prvič opisan kot naravni proizvod. Njegov prvi in ​​edini zapis so opisali Dörnyei et al. leta 1982 【31】kot izdelek sintetičnega izvora. Le podatki 'H-NMR so opisani z nekaterimi nedoločenimi množinami. Tako so bile popolne dodelitve za vse kemične premike 1H- in 13C-NMR določene s korelacijskimi poskusi z eno vezjo (HSOC) ter dvema in tremi vezmi (HMBC)' H-13C-NMR in so bile opisane v Tabela 1.

Spojini 6 in 7 sta bili identificirani kot benziltetrahidroizokinolinska alkaloida (plus)-1S,2R-retikulin-N-oksid oziroma (plus)-1S,2S-retikulin-N-oksid. H-NMR podatke teh alkaloidov smo primerjali s podatki, ki so jih opisali Lee et al. [28] z uporabo istega devteriranega topila (CD3OD) in opaženih je bilo nekaj nedoslednosti (tabela 1), predvsem v zvezi s H-1, H-8 in H, C-NO. Za te alkaloide v literaturi ni opisanih podatkov 13C-NMR. Na podlagi omejenih podatkov 1H- in 13C-NMR ter dvoumnosti, opaženih za te molekule, so bili izvedeni poskusi 1D in 2D NMR H in 13C, da bi določili njihove pravilne dodelitve in množitve.

Pravilen položaj vodika H{{0}} in H-1 obeh izomerov 6 in 7 je bil ugotovljen na podlagi korelacijske karte s tremi vezmi 'H-13C iz HMBC -NMR poskus （slika 2）. Za izomer 6 je analiza pokazala, da vodik pri δH 5,78（H-8）kaže korelacijo 'H-13C s tremi vezmi z ogljiki pri 6c 79,8（C-1）,δc120 .6（4a） in δc 149,4 （C-6）, medtem ko je vodik pri δH 4,13 （H-1） pokazal korelacijo 'H-13C s tremi vezmi z ogljiki pri c 60,7（C-3）,6c 115,7 （C-8）,δc 120,6（C-4a） in 131,2 （C-1'）, s čimer se določi pravilne položaje vodikov H-8 in H-1 za izomer 6. To pripisovanje lahko dodatno potrdimo z analizo vodika pri δH 6,76（H-5）, ki je pokazala tri vezi Korelacija H-13C z ogljiki pri δc 27,0（C-4）, δc 127,1（C-8a） in δc 145,7 （C-7） (slika 2）). Za izomer7 je analiza pokazala, da vodik pri δH 6,30 （H-8）kaže korelacijo 'H-13C s tremi vezmi z ogljiki pri δc 79,4（C-1）,δc 122,8（ 4a） in δc 148,9 （C-6）, medtem ko je vodik pri δH 4,46 （H-1） pokazal korelacije H-13C s tremi vezmi z ogljiki pri δc 62,9 （C{ {82}}）,5c 115.5（C-8）, bc 122.8（C-4a） in 131.4（C-1'）, s čimer se določijo pravilni položaji vodikov H -8 in H-1 za izomer 7. To pripisovanje je potrdila tudi analiza vodika pri δH 6,71 （H-5）, ki je pokazala tri vezi lH-13C korelacije z ogljiki pri δc26,3（C-4）, δc 126,9（C-8a） in 6c 146,1（C-7）(slika 2). Izveden je bil tudi poskus NOESY, da bi ugotovili pravilno stereokemijo izomerov6 in 7. V tem poskusu je močna korelacija NOE H-1（δH 4,13）in H, CN(5 3.15) pokazala, da -orientacija kisika v izomeru 6. Po drugi strani pa v poskusu 2D-NOESY za 7 ni bilo mogoče najti nobene očitne korelacije NOE med H-1(6H 4,46) in HAC-N(5H 3,20), ki kaže -orientacijo kisika v izomeru 7 (slika 2). Te majhne razlike v kemijskih premikih teh izomerov so jasno opazne zaradi stereokemije dušika, na katero vplivajo položaji in položaji kisika. Primerjave H- in 13C-NMR podatkov, dobljenih za spojini 6 in 7, s podatki za molekule s podobnimi strukturami, kot sta heksapetalin A in heksapetalin B [30], podpirajo podatke, opisane v tabeli 1, brez dvoumnosti.

Spojini 1-4 in 8-13 sta bili identificirani kot talifolin (1) [32], anonain (2) [33]liriodenin (3)[10,34], (S)-( plus )-retikulin ( 4)[27], koreksimin (8) [34,35], bisnorargemonin (9)[36], izohamanetin (10) [37], dihamanetin (11) [37] in mešanica uvarinola (12) in izouvarinola (13) [37] na podlagi njihovih spektroskopskih profilov in primerjave z vrednostmi v literaturi. Spektri lH- in 13C 1D in 2D-NMR ter masni spektri vseh izoliranih spojin so na voljo kot dodatni materiali.

S kemofenetičnega vidika (nov izraz za rastlinsko kemosistematiko/kemotaksonomijo rastlin) je pomembno omeniti, da je prisotnost C-benziliranih flavanonov in C-benziliranih dihidrohalkonov posebna vrsta flavonoidov, pridobljenih iz dobro znanega flavanon pinocembrina. in so bili opisani zlasti pri vrstah iz rodu Uoaria, ki pripadajo družini Annonaceae [3,38-42]. Prisotnost teh spojin v D. calycina kaže na tesno kemofenetsko povezavo z Uoario. Po drugi strani pa je treba opraviti nadaljnje preiskave z drugimi deli rastline in drugimi vrstami Diclinanona, da potrdimo to kemofenetsko povezavo. Flavanoni in halkoni so zelo razširjeni v višjih rastlinah, vendar je dodajanje benzilnih skupin precej redko in se zdi, da je pri Annonaceae omejeno na rod Uoaria [3,39-42] in zdaj na rod Diclinanona. Benzilne skupine domnevno izvirajo iz poti C6-C1, vendar je o-hidroksi funkcionalnost nenavadna. Odsotnost substituentov v B-obroču v vseh teh flavonoidih Uoaria in Diclinanona je mogoče povezati s prejšnjim opažanjem v zvezi s flavonoidi Popowia cauliflora [38].

Alkaloidi, pridobljeni iz izokinolina, izolirani in opisani v tem delu, so bili že registrirani pri več vrstah Annonaceae v različnih rodovih. Nekateri od teh, kot sta liriodenin in anonain, veljajo za kemofenetske označevalce in prisotnost teh alkaloidov v D.calycina dodatno krepi razmerje med temi kemofenetskimi označevalci v družini Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Treba je omeniti, da so po Zidornu [44] kemofenetične študije opredeljene kot študije, katerih cilj je opis niza specializiranih sekundarnih metabolitov v danem taksonu, kot je že opaženo v več objavljenih delih [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Tako kemofenetske študije prispevajo k fenetičnemu opisu taksonov, podobno kot anatomski, morfološki in kariološki pristopi, ki so že bili prepoznani kot zelo pomembni za vzpostavitev "naravnih" sistemov in so še vedno izjemnega pomena za opis razvrščenih organizmov s pomočjo sodobnih molekularnih metod [44].

2.2. Citotoksični test

In vitro citotoksično aktivnost izoliranih spojin (tabela 2), razen za spojine 2, 3, 5 in 8 (zaradi njihovega nizkega izkoristka), so ocenili glede narakava celicalinije HL-60 (človeška promielocitna levkemija), MCF-7(človeški adenokarcinom dojke), HepG2 (človeški hepatocelularni karcinom), HCT116 (človeški karcinom kolona) in nerakasta celična linija MRC{{5} }(človeški pljučni fibroblast) z uporabo Alamar blue testa po 72 urah inkubacije.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). Dichamanetin (11) je pokazal citotoksično aktivnost proti HL-60 in HCT116 z vrednostmi IC50 15,78 ug·mL-1（33,70 μmol·L-1） oziroma 18,99 ug·mL-1（40,56 umol.L-1）. Mešanica uvarinola (12) in izouvarinola (13) je pokazala citotoksično aktivnost proti HL-60 z vrednostjo ICs0 9,74 ug∶mL-1 in HCT116 z vrednostjo ICs0 17,31 ug∶mL{ {30}}. Med benziliranimi dihidroflavoni je samo izorhamnetin (10) pokazal citotoksično aktivnost proti HepG2 z vrednostjo IC50 19,79 ugs:mL-1(54,65 umol.L-1). Glede na literaturo so benzilirani dihidroflavoni opisani s citotoksičnimi lastnostmi [39-42]. Med opisanimi v tem delu so izorhamnetin (10), dichamanetin (11) in uvarinol (12) opisani v okviru vitro citotoksičnih lastnosti proti človeškim tumorskim celičnim linijam karcinoma nazofarinksa (KB) in P-388 limfocitne levkemije (PS) z vrednostmi IC50 5,3 in 4,1, 4,8 in 1,8 ter 5,9 in 9,7 ug.mL-1 [39,40]. Te različne aktivnosti je mogoče pripisati prisotnosti ene ali več hidroksibenzilnih skupin, prisotnih v molekulah, kot tudi položaju, v katerem so te skupine povezane. Vendar pa je za potrditev te ugotovitve potrebna nadaljnja preiskava.

In vitro citotoksično aktivnost izokinolinskih alkaloidov anonaina (2), liri-adenina (3) in (S)-(plus )-retikulina (4) so ​​nedavno opisali Menezes et al.[2{{16] }}], Souza et al. [6] in Costa et al. [43] s poudarkom na liriodeninu, ki je pokazal močno citotoksično aktivnost proti rakavim celičnim linijam B{{10}}F10(mišji melanom), HepG2 (človeški hepatocelularni karcinom), HL{{13 }} (človeška promielocitna levkemija) in K562 (človeška kronična mielocitna levkemija） z vrednostmi IC5s0 pod 10,0 μmol.L-1【43】. Anonain je pokazal zmerno aktivnost proti B16-F10, HepG2, HL60 in K562 z vrednostmi IC50, nižjimi od 19,0 umol.L-1[20]. (S)-(plus )-retikulin je pokazal zmerno aktivnost samo proti HepG2 z vrednostmi IC50 15,35 μmol L-1【 6,20】.

3. Materiali in metode

3.1. Splošni eksperimentalni postopki

Optične rotacije v metanolu (MeOH) so bile zabeležene s polarimetrom P{{0}} (Jasco, Tokio, Japonska) pri 589 nm. 1D in 2D NMR poskusi so bili pridobljeni v CDCl2. (kloroform-d) ali CDCl plus kapljica CD, OD (metanol-du in CD, COCD3(aceton-d6) pri 298 K na NMR spektrometru AVANCE I HD (Bruker, Billerica, MA, ZDA), ki deluje pri 11,75 T (Hand 13C pri 500 oziroma 125 MHz) in na NMR spektrometru Bruker AVANCE I 600, ki deluje pri 14,1 T('H in 13Cat 60{) {63}} oziroma 150 MHz). Vsi kemični premiki 1H- in 13C-NMR （δ） so predstavljeni v ppm glede na signal tetrametilsilana pri 0.00 ppm kot notranja referenca in sklopitvene konstante (D) so podane v Hz. NMR spektrometer je bil opremljen z večjedrno inverzno detekcijsko sondo 5- mm (poskusi 1D in 2D NMR) z gradientom z. Ena vez (HSQC) in dve in korelacijski poskusi s tremi vezmi (HMBC)1H-13C-NMR so bili optimizirani za povprečno sklopitveno konstanto JcH in LRJ(cH 140 oziroma 8 Hz. Za analizo masne spektrometrije z nizko ločljivostjo (LC-MS) vzorci izoliranih spojin so bili resuspendirani v metanolu (HPLC stopnje), kar je ustvarilo zalogo k raztopin (1 mg·mL-1). Alikvote (5 uL) osnovnih raztopin smo nadalje razredčili na 5 ug·mL in analizirali z neposredno infuzijo v trojni kvadrupolni masni spektrometer, model TSO Quantum Access (Thermo Scientific, San Jose, CA, ZDA), opremljen z ionizacijo z elektrosprejem. (ESI) ali viri kemične ionizacije pri atmosferskem tlaku (APCI). Pogoji ESI-MS: napetost pršenja, 5 kV; plaščni plin, 10 poljubnih enot (arb); pomožni plin, 5arb;čistilni plin,0arb;kapilarna temperatura, 250 stopinj; kapilarna napetost, 40 V; cevna leča, 70 V; masno območje, m/z 100 do 1000. Pogoji APCI-MS: razelektritveni tok, 5 μA; temperatura uparjalnika, 350 stopinj; tlak plinskega plašča, 25 poljubna enota （arb）; tlak ionskega čistilnega plina, 0,0 arb; tlak pomožnega plina, 10 arb; kapilarna temperatura, 250 stopinj C; odmik cevne leče,70 V; odmik skimmera,0 V; masno območje, m/z 100 do 1000. Argon je bil uporabljen kot trkovni plin, MS/MS spektri pa so bili pridobljeni z uporabo trkovnih energij v razponu od 25 do 30 eV. Za kolonsko kromatografijo (CC) smo uporabili silikagel 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, ZDA, 70-230 mesh), medtem ko silikagel 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Nemčija, 0,25 mm, aluminij) je bil uporabljen za analitično in preparativno s tanko laver kromatografijo (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 mm, steklo). Spojine smo vizualizirali z izpostavitvijo UV254/365 svetlobi, z razprševanjem s p-anisaldehidnim reagentom, ki mu je sledilo segrevanje na vroči plošči, in z razprševanjem Dragendorffovega reagenta.

3.2. Rastlinski material

V tej preiskavi je bil botanični material (lubje) D.calycina zbran 27. maja 2017 v rezervatu Adolpho Ducke (geografske koordinate: 02 stopinja 53'36.1J in 59 stopinja 58'28.9"Z), Manaus, država Amazonas Antonio Carlos Webber, rastlinski taksonomist Oddelka za biologijo Universidade Federal do Amazonas (DB/UFAM). Vzorec vavčerja številka 10.810 je bil deponiran v Herbariju DB/UFAM. dostop (vzorec) je bil registriran v Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) z zapisom A70EDCD.

3.3. Ekstrakcija in izolacija

Lubje D.calycina je bilo sprva sušeno pri sobni temperaturi 24 ur in nato sušeno v pečici s kroženjem zraka 48 ur pri temperaturi 40 stopinj in nato zdrobljeno v mlinčku s štirimi noži (Marconi, Piracicaba, SP). , Brazilija), da dobimo praškasti material (1340 g). Nato je bila izvedena izčrpna maceracija s heksanom (8 × 4 L), ki ji je sledil MeOH (8 × 4 L). Dobljene ekstraktivne raztopine smo koncentrirali v rotacijskem uparjalniku pri znižanem tlaku (40-50 stopinj), da smo dobili heksanski (24,85 g) oziroma MeOH (199,43 g) ekstrakt.

Analiza TLC, razkrita z Dragendorffovim reagentom, je pokazala visoko prisotnost alkaloidov v ekstraktu MeOH. Zato smo alikvot ekstrakta MeOH (188,30 g) sprva izpostavili kislinsko-bazični ekstrakciji, da smo dobili alkaloidne (5,46 g) in nevtralne (4,47 g) frakcije. Nato smo del alkaloidne frakcije (5.0g) izpostavili kromatografski koloni s silikagelom (CC), predhodno obdelano z 10-odstotno raztopino NaHCO3 [12], eluirano s heksanom (100 odstotkov), heksanom-CHCl, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 in 10:90,v/o), CH2Cl2 (100 odstotkov), CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 in 10:90,0/u), EtOAc (100 odstotkov), EtOAc-MeOH (95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 in 10:90, v/o) in končno MeOH, kar je dalo 250 frakcij (30 mL vsaka). Po TLC vrednotenju z uporabo mešanice CH2Cl2-MeOH v razmerjih 95:05, 90:10, 85:15 in 80:20 kot eluentni sistem (v/o), so bili podobni vzorci združeni v 16 frakcij (F1 do F16).

Frakcijo F5 (181,2 mg) iz začetne CC, eluirano s heksanom-CH,Cl2 (50:50 do 10:90, v/o), smo izpostavili novemu silikagelu CC z uporabo iste zgornje metodologije, eluirano s heksanom (100 odstotkov), heksanom -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 in 10:90,v/o), CH,Cl ,(100 odstotkov), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 in 10:90 ,o/), EtOAc (100 odstotkov), EtOAc-MeOH (85:15, 70:30, 50:50, 30:70 in 15:85, /o) in MeOH (100 odstotkov), kar je dalo 118 frakcij ( 15 mL vsak), ki smo jih združili v 12 subfrakcij (F5.1 do F5.12), glede na vrednotenje analize TLC z uporabo mešanice CH2Cl2-MeOH v razmerju 95:05 in 90:10. Subfrakcija F5 .1 (28,9 mg), eluiran s heksanom (100 odstotkov), je bil izpostavljen preparativni TLC, eluiran s CH,Cl-MeOH (95:05, v/v, dve eluciji), kar je dalo 2 (1,4 mg) in 3 (1,7 mg), oz. Podfrakcije F5.4 (21,5 mg) eluirane s heksanom-CH,C (80:20,vo), F5.5 (16,7 mg) eluirane s heksanom-CH,Cl (80:20,70:30,60; 40. in 50:50). ,v/) in F5.6 (15,4 mg), eluiran s heksanom-CHCl2 (50:50, 40:60 in 30:70, v/o), smo združili (53,6 mg) in prav tako izpostavili preparativni eluirani TLC s CH,Cl-MeOH (95:05, v/u, dve eluciji), da dobimo 3 (8,9 mg).

Frakcija F6(2099,1 mg) iz začetne CC, eluirane s heksanom-CHCl(10:90,v/)), CH2Cl, (100 odstotkov ) in CH,Cl2-EtOAc (90:10 do 10:90, o/o) smo izpostavili novi CC silikagelu z uporabo iste metodologije zgoraj, eluirano z istimi sistemi topil, kar je dalo 140 frakcij (30 mL vsakega). Po vrednotenju s TLC z uporabo mešanice CH2Cl2-MeOH v razmerjih 95:05, 90:10 in 85:15 kot eluentnega sistema (o/o) so podobne vzorce združili, da smo dobili 13 subfrakcij (F6 .1 do F6.13). Podfrakcijo F6.6 (1541,3 mg) smo izpostavili novi CC na silikagelu z uporabo iste metodologije zgoraj, eluirano z istimi sistemi topil, kar je dalo 120 frakcij (vsaka po 30 ml), ki smo jih analizirali s TLC (z uporabo iste metodologije zgoraj), kar je zagotovilo 12 novih podfrakcije (F6.6.1 do F6.6.12). Podfrakcijo F6.6.2 (17,0 mg), eluirano s heksanom-CH,Cl (60:40 in 50:50, v/v), smo izpostavili preparativni TLC, eluirano s CH2Cl2-MeOH (90:10, v/o, ena elucija), kar je povzročilo 3 (1,4 mg). Subfrakcija F6.6.3 (643,3 mg) eluirana s heksanom-CH2Cl2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 in 10:90, o/v), CH2Cl2 (100 odstotkov) in CH2Cl2-EtOAc (90:10 in 80:20,o/o) smo podvrgli preparativni TLC, eluirani s CH2Cl2-MeOH (90 :10, vfo, ena elucija), kar je dalo novo subfrakcijo F6.6.3.1 (161,8 mg), ki je bila izpostavljena novi preparativni TLC, eluirano z EtOAc-MeOH (90:10, v/o, ena elucija), kar je dalo 4(148,2 subfrakcijo F6.6.4 (90,2 mg), eluirano s CH2Cl2-EtOAc (70:30 in 60:40,o/o), smo izpostavili preparativni TLC, eluirano s CH2Cl-MeOH (90:10, v/o, ena elucija), kar je dalo 1 (1,4 mg) oziroma 4 (50,1 mg). Podfrakcijo F6.6.5 (83,4 mg), eluirano s CH,Cl-EtOAc (60:40 in 50:50, o/o), smo prav tako izpostavili preparativni TLC, eluirano s CH,Cl2-MeOH (90:10, ufo, ena elucija), kar ponovno daje 1 (1,5 mg) oziroma 4 (45,5 mg). Podfrakcijo F6.6.6 (101,4 mg), eluirano s CH,Cl2-EtOAc (50:50 in 40:60, v/)), smo izpostavili preparativni TLC, eluirano s CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, eno eluiranje), kar je dalo 8 (3,4 mg) in drugo podfrakcijo F6.6.6.1 (48,8 mg). To podfrakcijo (F6.6.6.1) smo izpostavili preparativni TLC, eluirani najprej z EtOAc-MeOH (85 :15, vo, ena elucija) in posteriorno CHCl-MeOH (90:10, v/v, ena elucija), kar ponovno povzroči 4 (37,4 mg). Za ta postopek smo kromatografsko ploščo najprej eluirali z mobilno fazo EtOAc-MeOH (85:15, v/o, ena elucija). Po tem eluiranju smo kromatografsko ploščo posušili, da smo ponovno odstranili topilo, nato pa podvrgli novemu eluiranju z mobilno fazo CH,Cl,-MeOH (90:10, vf, ena elucija), kar je dalo 4. Podfrakcijo F6.6.7 ( 109,0 mg), eluiran s CH,Cl2-EtOAc (40:60, 30:70, 20:80 in 10:90,vfo), je bil izpostavljen preparativni TLC, eluiran s CH,Cl2-MeOH (90:10, vol., ena elucija), kar je dalo drugo subfrakcijo F6.6.7.1 (24,8 mg), ki je bila izpostavljena novi preparativni TLC, eluirano sprva z EtOAc-MeOH (85:15, v/o, ena elucija) in posteriorno CH2Cl2-MeOH (90:10, vfo, ena elucija), kar ima za posledico 9 (11,1 mg). Postopek izolacije, uporabljen za 9, je bil enak kot prej opisan za 4. Podfrakcijo F6.6.10 (92,0 mg), eluirano z EtOAc-MeOH (60:40 in 50:50, v/o), smo podvrgli preparativni TLC, eluirani s CH, Cl,-MeOH (90:10, v/o, ena elucija), kar je dalo 5 (1,7 mg) oziroma 6 (7,8 mg). Podfrakcijo F6.6.11 (326,0 mg), eluirano z EtOAc-MeOH (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 in 10:90, v/o), smo podvrgli preparativni TLC, eluirani s CHCl- MeOH (90:10, v/o, ena elucija), ki vsebuje 1 (2,4 mg) oziroma 7 (12,5 mg).

Frakcijo F7 (692,4 mg) iz začetne CC, eluirano z EtOAc (100 odstotkov) in CHCl2-EtOAc (95:05, 90:10, 85:15 in 75:25, ofo), smo izpostavili novemu silikagelu C Z uporabo enake metodologije, kot je opisana za začetno CC z istimi sistemi topil, ki dajejo 110 frakcij (30 ml vsake). Po TLC vrednotenju z uporabo mešanice CH2Cl2-MeOH v razmerjih 95:05, 90:10 in 85 :15 kot sistem eluenta (o/o), so bili podobni vzorci združeni, da je nastalo 12 podfrakcij (F7.1 do F7.12).F7.8(147,4 mg), eluiranih s CH,Cl2- EtOAc (50:50, 40:60 in 30:70, v/o odstotkov) smo izpostavili preparativni TLC, eluirano s CHCl-MeOH (95:05, vfo, ena elucija), da smo dobili 10 (5,4 mg) in 11( 120,6 mg). F7.9 (144,2 mg), eluiran s CHCl2-EtOAc (30:70, 20:80 in 10:90, v/o odstotkov), je bil prav tako izpostavljen preparativni TLC, eluiran s CH,Cl,-MeOH( 95:05, vo, ena elucija), kar je dalo 11 (91,2 mg) oziroma zmes 12 in 13 (39,4 mg).

Talifolin (1): rjav amorfen prah;“ H-NMR in 13C-NMR v skladu z literaturo [32]; LR-ESI(plus)-MS [M plus H]* plus m/z 208.

Anonain (2): rjav amorfen prah; 1H-NMR in 13C-NMR v skladu z literaturo [33]; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 266.

Liriodenin (3): rumeni kristali (CH,Cl-MeOH 3:1);1H-NMR in 13C-NMR v skladu z literaturo [10,34]; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 276.

(S)-(plus )-retikulin(4): rjav amorfen prah; []p25 plus 71,60(c 0,05 g/100 ml, MeOH); 1H-NMR in 13C-NMR v skladu z literaturo [27; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 30.

3,4-dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izokinolinil)(3-hidroksi-4-metoksifenil)-metanon (dehidro-oksonoretikulin)(5 ): rjav amorfen prah; 'H in 13C-NMR podatki, glej tabelo 1; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 328.

(plus ){{0}}S,2R-retikulin N-oksid(6): rjav amorfen prah; [ lp25 plus 136,4 (c0,146 g/100 ml, MeOH); Podatki 13C-NMR z eno roko, glejte tabelo 1; LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/2346

( plus ){{0}}S,2S-retikulin N.-oksid (7): rjav amorfen prah; []p25 plus 394,5 (c 0,03 g/100 ml, MeOH); 'H in 13C-NMR podatki, glejte tabelo 1; LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/z346.

Koreksimin (8): svetlo rumen amorfen prašek; []p25 plus 201,1 (c 0,08 g/100 ml, MeOH)'H-NMR in 13C-NMR v skladu z literaturo [34,35]; LR- ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 328.

Bisnorargemonin (9): rjav amorfen prah; 1H-NMR in 13C-NMR v skladu z literaturo [36]; LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 328.

Isochamanetin (10): svetlo rumen amorfen prašek; [p25-12.4(c 0,5 g/100 ml, MeOH)'H-NMR in 13C-NMR v skladu z literaturo [37; LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Dichamanetin (11): Rumen amorfen prašek; [ ]D25-10.7(c 0.5g/100 mL, MeOH);1H-NMR in 13C-NMR v skladu z literaturo [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Mešanica uvarinola (12) in izouvarinola (13): rumen amorfen prah; H-NMR in 13C-NMR v skladu z literaturo [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]- m/z 573.

3.4. Citotoksični test in vitro

3.4.1.Celice

HL-60 (človeška promielocitna levkemija), MCF-7 (človeški adenokarcinom dojke), HepG2 (človeški hepatocelularni karcinom), HCT116 (človeški karcinom kolona) in MRC-5 (človeški pljučni fibroblast) celične linije so bile pridobljene iz ameriške zbirke tipskih kultur (ATCC, Manassas, VA, ZDA) in so bile kultivirane, kot priporoča ATCC vodnik za gojenje živalskih celic. Vse celične linije so bile testirane na mikoplazmo z uporabo kompleta za barvanje z mikoplazmo (Sigma-Aldrich), da se potrdi uporaba celic brez kontaminacije.

3.4.2. Test citotoksičnosti

Za test citotoksičnosti je bila viabilnost celic kvantificirana z metodo Alamar blue, kot je opisano prej [{{0}}]. Za vse poskuse so bile celice posejane v 96-plošče z vdolbinicami. Kemične sestavine smo raztopili v dimetil sulfoksidu (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brazilija) in dodali v vsako vdolbinico ter inkubirali 72 ur. Doksorubicin (doksorubicinijev klorid, čistost večja ali enaka 95 odstotkom, Laboratorij IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina) je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Na koncu zdravljenja je bilo 20 μL osnovne raztopine (0,312 mg/mL) resazurina (Sigma-Aldrich Co.) smo dodali vsaki vdolbinici. Absorbance pri 570 nm in 600 nm smo izmerili z uporabo čitalnika mikroplošč SpectraMax190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ZDA). Polovično inhibitorno koncentracijo (IC50) smo dobili z nelinearno regresijo s 95-odstotnimi intervali zaupanja (CI95 odstotkov) z uporabo programske opreme GraphPad Prism (Intuitivna programska oprema za znanost; San Diego, CA, ZDA).

4. Sklepi

Fitokemijska raziskava lubja D.calycina je vodila do izolacije in identifikacije trinajstih spojin (1-13); devet alkaloidov, pridobljenih iz izokinolina (1-9) in štiriflavonoidi(10-13). Alkaloid spada v naslednje podrazrede: enostavni izokinolin, thali online (1); aporfin, anonain (2); oksoaporfin, liriodenin (3); benzil-tetrahidroizokinolini, ( plus )-retikulin(4), de hidro-oksonoretikulin(3,4-dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izokinolinil)({{13} }hidroksi-4-metoksifenil)-metanon)(5), 1S,2R-retikulin Ng-oksid (6) in 1S,2S-retikulin N.-oksid (7); tetrahidro protoberberin, koreksimin (8); in pavin, bisnorargemonin (9). Medtem ko flavonoidi spadajo med benzilirane dihidroflavone, izorhamnetin (10), dichamanetin (11) in mešanico uvarinola (12) in izouvarinola (13). Izolirane spojine so prvič opisane v D.calycina kot tudi v rodu Diclinanona.

Citotoksično aktivnost izoliranih spojin (razen anonaina, liriodenina, 1,2-dihidro-oksonoretikulina in koreksimina) so ovrednotili proti raku (HL-60, MCF-7, HepG2 in HCT116) in nerakavih (MRC-5) ​​celičnih linijah. Med njimi so najbolj obetavne rezultate opazili za benzilirane dihidroflavone dichamanetin (10) in

mešanica uvarinola (12) in izouvarinola (13), ki je pokazala zmerno citotoksično aktivnost proti testiranim rakavim celičnim linijam （<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). Dichamanetin (11) je pokazal citotoksično aktivnost proti HL-60 in HCT116 z vrednostmi IC50 15,78 ug·mL-1 （33,70 μmol-L-1) in 18,99 ug·mL-I（40,56 μmol .L-1）, medtem ko je mešanica uvarinola （12） in izouvarinola (13) pokazala citotoksično aktivnost proti HL-60 z vrednostjo IC50 9,74 ug∶mL-I in HCT116 z IC50 vrednost 17,31 ug·mL-1. Ti rezultati na tumorskih celičnih linijah so prvič opisani tudi za benzilirane dihidroflavone. Citotoksično delovanje retikulina, anonaina in liriodenina je bilo predhodno ugotovljeno, pri čemer je liriodenin najmočnejša spojina.

Rezultati, pridobljeni v tem delu, kažejo, da so vrste iz družine Annonaceae obetaven vir biološko aktivnih spojin s citotoksičnimi lastnostmi, in predlagajo nadaljevanje njihovega raziskovanja v drugih modelih bioloških testov.

Reference

1. Couvreur, TLP; Pirie, MD; Chatrou, LW; Saunders, RMK; Su, YCF; Richardson, JE; Erkens, RHJ Zgodnja evolucijska zgodovina družine cvetočih rastlin Annonaceae: Stalna diverzifikacija in boreotropska georazpršitev. J. Biogeogr. 2011, 38, 664–680. [CrossRef]

2. Corrêa, MP Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministério da Agricultura: Rio de Janeiro, Brazilija, 1984.

3. Leboeuf, M.; Jama, A.; Bhaumik, PK; Mukherjee, B.; Mukherjee, R. Fitokemija Annonaceae. Fitokemija 1982, 21, 2783–2813. [CrossRef]

4. Rupprecht, JK; Hui, Y.-H.; McLaughlin, JL Annonaceous acetogenins: Pregled. J. Nat. Prod. 1990, 53, 237–278. [CrossRef]

5. Lúcio, ASSC; Almeida, JRGDS; Da-Cunha, EVL; Tavares, JF; Filho, JMB Alkaloidi Annonaceae: Pojav in zbirka njihovih bioloških aktivnosti. V Alkaloidi; Knolker, H.-J., ur.; Elsevier: Amsterdam, Nizozemska, 2015; 5. poglavje; Zvezek 74, str. 233–409. [CrossRef]

6. Souza, CAS; Nardelli, VB; Paz, WHP; Pinheiro, MLB; Rodrigues, ACBC; Bomfifim, LM; Soares, MBP; Bezerra, DP; Chaar, JS; Koolen, HHF; et al. Fenilpropanoidi, pridobljeni iz asarona, in alkaloidi, pridobljeni iz izokinolina, iz lubja Duguetia pycnastera (Annonaceae) in njihove citotoksičnosti. Quim. Nova 2020, 43, 1397–1403. [CrossRef]

7. Araújo, MS; Silva, FMA; Koolen, HHF; Costa, EV Alkaloidi, pridobljeni iz izokinolina, iz lubja Guatteria olivacea (Annonaceae). Biochem. Syst. Ecol. 2020, 92, 104105. [CrossRef]

8. Ngouonpe, AW; Mbobda, ASW; Happi, GM; Mbiantcha, M.; Tatuedom, OK; Ali, MS; Lateef, M.; Tchouankeu, JC; Kouam, SF Naravni izdelki iz zdravilne rastline Duguetia staudtii (Annonaceae). Biochem. Syst. Ecol. 2019, 83, 22–25. [CrossRef]

9. Santos, RC; Souza, AV; Andrade-Silva, M.; Cruz, KCV; Kassuya, CAL; Cardoso, CAL; Vieira, MC; Formaggio, ASN Antioksidantna, antirevmatična in protivnetna preiskava ekstrakta in dicentrinona iz Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth. & Hook. f. J. Ethnopharmacol. 2018, 211, 9–16. [CrossRef]

10. Kosta, EV; Pinheiro, MLB; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Valdez, RH; Ueda-Nakamura, T.; Dias Filho, BP; Nakamura, CV Tripanocidna aktivnost oksoaporfina in pirimidin- -karbolinskih alkaloidov iz vej Annona foetida Mart. (Annonaceae). Molekule 2011, 16, 9714–9720. [CrossRef]

11. Silva, DB; Tulli, EKO; Milita, GCG; Costa-Lotufo, LV; Pessoa, C.; Moraes, MO; Albuquerque, S.; Siqueira, JM Protitumorske, tripanocidne in antileishmanske aktivnosti ekstrakta in alkaloidov, izoliranih iz Duguetia furacea. Fitomedicina 2009, 16, 1059–1063. [CrossRef] [PubMed]

12. Kosta, EV; Pinheiro, MLB; Xavier, CM; Silva, JRA; Amaral, ACF; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Ferreira, AG; Machado, GMC; et al. Pirimidin- -karbolin in drugi alkaloidi iz Annona foetida z antileishmanijskim delovanjem. J. Nat. Prod. 2006, 69, 292–294. [CrossRef]