Pomanjkanje kalretikulina moti biogenezo ribosomov in povzroči zaostanek v embrionalnem razvoju ledvic

edmund.chen@wecistanche.com

Povzetek

Nefrogenezo poganjajo zapletene signalne poti, ki nadzorujejo rast in diferenciacijo celic. Endoplazmatski retikulum spremljevalec kalretikulina (Calr) je dobro znan po svoji funkciji pri shranjevanju kalcija in zvijanju glikoproteinov. Njena vloga vledvicarazvoj še vedno ni razumljen. V tej preiskavi nudimo dokaze o ključni vlogi Calr pri nefrogenezi. Pokazali smo, da pomanjkanje Calr povzroči moteno tvorbo intaktne nefrogene cone in upočasnitev nefrogeneze, kar dokazuje motnja v tvorbi teles v obliki vejice in črke S. Z uporabo pristopov proteomike in transkriptomike smo dokazali, da poleg spremembe ključnih proteinov, ki signalizirajo Wnt, embrionalniledviceiz Calr // je pokazala splošno okvaro izražanja ribosomskih proteinov, kar razkriva motnje v sintezi beljakovin in nefrogenezi. Knockout, posredovan s CRISPR/cas9, je potrdil, da je pomanjkanje Calr povezano s pomanjkanjem več ribosomskih proteinov in ključnih proteinov v biogenezi ribosomov. Naši podatki poudarjajo neposredno povezavo med izražanjem Calr in biogenezo ribosomov.

Uvod

LedvicaZa organogenezo je značilno zaporedje morfogenetskih dogodkov, ki jih poganja rast in diferenciacija celic. Med nefrogenezo sta gonilna sila za nastanek nefrona mezenhimsko-epitelni prehod (MET) in razvejanje sečničnega popka (UB), ki je rezultat recipročne indukcije med UB in metanefričnim mezenhimom (MM) [1]. Med tem procesom je potrebna zapletena in vzajemna interakcija različnih signalnih poti za orkestracijo diferenciacije epitelija in tvorbo nefrona [1–3]. Med ključnimi potmi v tem procesu ima nevrotrofični faktor (Gdnf), ki izhaja iz glije, ki signalizira prek svojega receptorja Ret, osrednjo vlogo med procesom, imenovanim brstenje v sečevodu. Motnje tega signaliziranja lahko povzročijo ektopični sečevod ozledvičnaagenezo, ko je signalizacija popolnoma odsotna [4]. Poleg signalizacije Gdnf/Ret je znano, da kanonična signalizacija Wnt/-catenin usklajuje več vidikovledvičnarazvoj znotraj MM in UB [5] ter inhibicija kanoničnega signaliziranja Wnt v liniji ureteričnih popkov in prednikov nefrona povzročiledvičnaageneza [6]. Vzdrževanje transkripcijskega reprogramiranja med nefrogenezo je odvisno od dostopnosti kromatina [7]. Dokazali smo, da so proteini heterokromatina, za katere je znano, da sodelujejo pri epigenetskem uravnavanju utišanja genov, nepogrešljivi za vzdrževanje ravnovesja med aktivatorji in zaviralci razvejanja v zgodnji fazi razvoja [7].

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DELOVANJE LEDVIC/LEDVIC

Kalretikulin (Calr) je promiskuitetni spremljevalec endoplazmatskega retikuluma (ER) z visoko sposobnostjo vezave kalcija in nizko afiniteto, ki je ključnega pomena za sekvestracijo Ca2 plus v ER in različne celične procese, vključno s prenosom signala, izražanjem genov in prometom beljakovin [8,9]. Mehanizmi, ki obravnavajo vlogo Calr pri boleznih, v glavnem temeljijo na kelaciji Ca2 plus s C-terminalno domeno Calr, ki veže Ca2 plus, in njegovi vlogi pri odzivu na nezvite proteine ​​(UPR) [10,11]. UPR ima lahko citoprotektivno vlogo med izzivom z napačno zvitimi proteini ali pa je lahko škodljiv za celice, saj trajno signaliziranje UPR povzroči apoptozo. Čeprav je le malo študij obravnavalo potencialno vlogo Calr pri boleznih z regulacijo transkripcije, ostaja funkcija nadzornika ER Calr eden od ključnih mehanizmov za usodo celice [9,12]. Podaljšan ER stres in napačno zvijanje beljakovin sta vidna pri različnihledvične boleznikot so glomerulopatije, akutnepoškodba ledvic, diabetična nefropatija,ledvičnafibrozo in kroničnobolezni ledvic[13,14]. Vloga Calr v embrionalnem razvoju še vedno ni jasna. Calr knockout povzroči embrionalno smrtnost v razvojni fazi E14.5 zaradi okvarjenega srčnega razvoja [15]. Posledice pomanjkanja Calr na molekularne mehanizmeledvicaembrionalni razvoj pa še niso povsem razumljeni. V tej študiji smo izvedli primerjalne transkriptomske in proteomske analize embrionalnihledvicaiz treh genotipov Calr plus / plus, Calr plus // in Calr// ter poudaril vpliv izločitve Calr na nefrogenezo in izražanje ribosomskih proteinov.

Ključne besede:pomanjkanje kalretikulina; nefrogeneza; ribosomska biogeneza, ledvice, ledvice

2. Rezultati

2.1. Posledica izločitve kalretikulina so morfološke in histološke nenormalnosti ledvic ter oslabljeno razvejanje ledvic

Genetski izločitev Calr pri miših povzroči zgodnjo embrionalno smrtnost zaradi okvar ventrikularnega septuma [15]. Da bi raziskali, ali Calr knockout vplivaledvicarazvoj, so bili mišji zarodki na stopnji E13.5 pripravljeni iz Calr plus // brejih miši (slika 1A). Zarodki Calr// so pokazali znatno spremembo rasti v primerjavi s Calr plus / plus in Calr plus // ter razkrili znatno okvaro v razvoju zarodka. Približna morfologija zarodkov inledvicepokazala znatno zmanjšanje velikosti med mišmi Calr plus / plus in Calr−//, pri čemer so miši Calr// pokazale največjo nenormalnost (slika 1A). Za ponazoritev vpliva Calrovega nokavta naledvicarazvoja in strukture so bili zarodki na treh različnih razvojnih stopnjah (E13.5, E14.5, E16.5) in iz treh genotipov (Calr plus / plus, Calr plus // in Calr//) žrtvovani inledviceso bile pridobljene. Odseki tkiva so pokazali različne razvojne stopnjeledvica,ki napreduje skozi zapletene morfološke strukture, kar dokazujeta PAS in HE-obarvanje delov tkiva.Ledviceiz iste embrionalne stopnje z različnimi genotipi so pokazali različne stopnje razvoja (slika 1B). Poleg tega so pomembne razlike vledvicastrukture so bile opažene zlasti pri primerjavi Calr // s Calr plus / plus in Calr plus //. Te razlike ostajajo tudi v napredovalih fazah nefrogeneze (slika 1B). Calr//ledvicekažejo resno okvaro v primerjavi s Calr plus / plus in Calr plus // (slika 1B). Na stopnji E13.5 velikost Calr//ledvicaje bilo manjše, število brstov in vej sečevodov pa je bilo bistveno manjše. Podobna opažanja so bila narejena na stopnjah E14.5 in E16.5. Kultura organov zarodkaledviceiz treh genotipov zarodkov je razkril znatno motnjo v razvejanosti UB inledvicarast. Za vizualizacijoledvičnastruktur, so bili gojeni zametki obarvani z lamininom kot markerjem za bazalno membrano in z lektinom Dolichos biflorus aglutinin (DBA), da bi vizualizirali UB.

Kombinirano FL fluorescenčno obarvanje gojenegaledvicazametki so pokazali znatno okvaro razvejanosti, ki je spremljala pomanjkanje Calr in povzročila splošno zaostalost vledvicarazvoj (slika 2A,B). V času izolacije je Calr//ledvicazametki so pokazali 6–10 konic UB, medtem ko so zametki Calr plus / plus in Calr plus // pokazali 20–30 konic UB. Kulturni zametki Calr plus / plus in Calr plus // so se med obdobjem kulture (72 ur) normalno razvili in so pokazali dobro razvejano UB (85 ± 9, n=6 vsak) ter različne znane strukture iz leta vivo razvijajoča se ledvica. Kulturniledvicaprikazani predcevni agregati,ledvičnavezikli in mezenhim kapice (slika 2A, B). Nasprotno pa se zametki Calr// niso uspeli normalno razviti in so pokazali znatno spremembo v razvejanosti UB (15 ± 3 n=6) (slika 2B).

Slika 2. Miška Calr−/−ledvicazametki kažejo resno spremembo v rasti in razvejanosti UB. (A):Ledvicazametke iz Calr plus / plus Calr plus /− in Calr−/− (E13.5) smo izolirali in gojili ex vivo tri dni. Calr−/−ledvicarudimenti so pokazali splošno spremembo v rasti in pomembno spremembo v razvejanosti popka sečnice. (B): Imunofluorescenčno barvanjeledvicazametke po treh dneh kulture. Izvedeno je bilo sočasno obarvanje laminina (rdeče) in DBA lektina (zeleno), da se vizualizirajo različne strukture rudimentov. Kvantifikacijo razvejanosti smo dosegli s štetjem števila vej sečničnega popka. Kvantifikacija je predstavljena kot palični grafikon z vrsticami napak. Vsaka vrstica predstavlja srednja števila veje ± sd iz šestih gojenih rudimentov. Pomembne razlike: (*) p < 0.05,="" (***)="" p="">< 0,001.="" 2,5="" ×="" 2,5="" ×="" 2,5="" ×="" notr.="" j.="" mol.="" sci.="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" od="" 21="" slika="" 2.="" calr悆="" zametki="" mišjih="" ledvic="" kažejo="" resno="" spremembo="" v="" rasti="" in="" razvejanosti="" ub.="">Ledvicazametke iz Calr plus / plus Calr plus // in Calr / (E13.5) smo izolirali in gojili ex vivo tri dni. Calr /ledvicarudimenti so pokazali splošno spremembo v rasti in pomembno spremembo v razvejanosti popka sečnice. (B): Imunoflfluorescenčno barvanjeledvicazametke po treh dneh kulture. Izvedeno je bilo sočasno obarvanje laminina (rdeče) in DBA lektina (zeleno), da se vizualizirajo različne strukture rudimentov. Kvantifikacijo razvejanosti smo dosegli s štetjem števila vej sečničnega popka. Kvantifikacija je predstavljena kot palični grafikon z vrsticami napak. Vsaka vrstica predstavlja srednja števila veje ± sd iz šestih gojenih rudimentov. Pomembne razlike: (*) p < 0.05,="" (***)="" p=""><>

2.2. Pomanjkanje Calr je povezano z velikimi in pomembnimi spremembami transkriptoma

Morfološke in histološke preiskave so pokazale okvaro vledvicarazvoj pri Calr/mišjih zarodkih v primerjavi s Calr plus / plus in Calr plus // . Da bi raziskali, ali je Calr knockout vplival na izražanje ključnih proteinov in poti nefrogeneze, so bile izvedene analize celotnega transkriptomaledvicazametki so bili izvedeni iz treh genotipov zarodkov. Za oceno različno izraženih genov med Calr plus / plus , Calr plus // in Calr/ledvicavzorcev, so bili kvantitativni testi na podlagi števila odčitkov izvedeni z uporabo Fisherjevega natančnega testa z Benjaminijevo-Hochbergovo prilagoditvijo za več testov. Dodatni sliki S1 in S2 prikazujeta toplotni zemljevid primerjalne analize med izražanjem genov vledvicazametki iz Calr plus / plus , Calr plus // in Calr / . Da bi pridobili izčrpen pregled sprememb izražanja genov med Calr plus / plus in Calr/kidney, je bil ustvarjen MA-graf s spremembo transformirane gube (FC) izražanja med Calr plus / plus in Calr / do log2 transformiranega povprečna raven izražanja za vsak gen v vseh vzorcih (slika 3A, dodatna slika S1). MA-graf prikazuje različno regulirane gene v Calr plus / plus v primerjavi s Calr / . Funkcionalna klasifikacija reguliranih genov glede na biološki proces je razkrila spremembo razvojnega procesa pri Calr /ledvice(Slika 3B, dodatna tabela S1). Natančnejša preiskava označevanja poti reguliranih genov je razkrila aberacijo dveh glavnih procesov: signalizacije Wnt in zvijanja beljakovin, saj je bilo ugotovljeno, da je večina reguliranih beljakovin vključenih v ti dve glavni poti (slika 3B). Hierarhično združevanje in združevanje k-sredstev na profilih izražanja je potrdilo, da je embrionalniledvicatranskriptoma Calr plus / plus in Calr plus // sta zelo podobna, vendar se bistveno razlikujeta od transkriptoma Calr / (slika 3C, dodatni sliki S1 in S2).

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL OKUŽBO LEDVIC/LEDVIC

Podatki naše analize transkriptoma so pokazali, da je knockout Calr spremljala sprememba v izražanju ključnih proteinov vledvicarazvoj (sliki 3C in 4A, dodatna tabela S2) poleg ključnih proteinov v signalizaciji Wnt in veliko število nefrogenih genov je bilo znižano reguliranih ali pa jih ni bilo zaznati v Calr /ledvicazametke (slika 3C, slika 4A). Med drugim so bili transkripcijski faktorji, kot sta Six1 in Six2, za katere so prej poročali, da delujejo v različnih stopnjah nefrogeneze, znatno znižani v embrionalni ledvici Calr//. Osr1 je eden od genov, katerih izražanje je potrebno za Eya1, Pax2, Six2, Sall1 in GDNF, izražanje tega gena pa je bilo skoraj odsotno v Calr / . Da bi raziskali vpliv spremembe signalizacije Wnt in nefrogenih ključnih genov naledvicarazvoj pri Calr knockout miših je bilo izvedeno imunofluorescenčno barvanje z označevalci embrionalnega razvoja vledvicarezine zarodkov v fazi E14.5. Barvanje je jasno potrdilo spremembo preiskovanih genov v Calr / (slika 4B). Poleg tega je v primerjavi s Calr plus / plus in Calr plus // Calr /ledvicanima jasne nefrogene cone (slika 4B), kar dokazuje barvanje, kar potrjuje resne motnje vledvicarazvoj v Calr/ zarodkih.

2.3. Primerjalne proteomske analize so odkrile pomembne spremembe v proteomu Calr/embrionalne ledvice

Morfološke in histološke analize so pokazale, da je omejitev Calr problematična za embrionalni razvojledvica. Za nadaljnje razumevanje vloge Calra vledvicaembrionalnega razvoja so bile izvedene široke analize proteomov na embrionalnihledvicez uporabo dveh strategij. V prvih poskusih smo za primerjavo embrionalnih uporabili 2D-gel elektroforezoledvicaproteomi iz Calr plus / plus in Calr plus // mišjih zarodkov iz stopnje E13.5. 2D vzorec je pokazal pomembno spremembo v proteomu Calr plus //ledvice(p < 0.05)="" (dodatna="" slika="" s3a).="" identifikacija="" različno="" bogatih="" proteinov="" je="" pokazala="" spremembo="" v="" izražanju="" proteinov,="" vključenih="" v="" stresne="" poti="" in="" presnovo="" rna="" v="" calr="" plus="">ledvica(Dodatna slika S3B,C). Da bi bolje raziskali spremembo proteoma v Calr plus // in Calr悆 / v primerjavi s Calr plus / plusledvicasmo izvedli profiliranje proteoma na osnovi masne spektrometrije (slika 5, dodatne tabele S3–S8). Analiza prekrivanja je pokazala visoko ponovljivost detekcije beljakovin med genotipi (slika 5A). Statistična analiza je pokazala pomembne spremembe v izražanju beljakovin med Calr plus / plus proti Calr悆 / (slika 5A, dodatni tabeli S3 in S4, dodatna slika S4A.), Calr plus // proti Calr/ (slika 5A, dodatni tabeli S5 in S6, dodatna slika S4B) in Calr plus / plus proti Calr plus // (slika 5A, dodatni tabeli S7 in S8, dodatna slika S4C). Imunofluorescenčno barvanje je potrdilo izločitev Calr v Calr //ledvice. Poleg tega smo potrdili ugotovitve proteomike za dva nizko regulirana proteina v Calr / : Calbindin 1(Calb-1) in Superoxide dismutase 1 (Sod1). V primeru Sod1 so tako proteomski kot transkriptomski podatki razkrili izločitev Sod1 v Calr悆 // embrionalnemledvicain imunofluorescenčno barvanje je potrdilo pomanjkanje Sod1 v Calr/embrionalnemledvica(Slika 5B). Sod1 je antioksidativni metaloencim, ki ima pomembno vlogo pri razstrupljanju reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) s pretvorbo prostih superoksidnih radikalov v vodikov peroksid za nadaljnjo razstrupljanje s celičnimi katalazami in tako preprečuje toksičnost. Calb-1 je glavni intracelularni protein, ki veže kalcij v distalnem zavitem tubulu (DCT) in ima ključno vlogo pri transcelularni reabsorpciji Ca2 plus. Kot intracelularni Ca2 plus -pufer in Ca2 plus -tranzitni protein Calb-1 prenaša Ca2 plus iz apikalne na bazolateralno stran brez bistvenih sprememb v znotrajcelični Ca2 plus -koncentraciji. Povezava med Calr knockoutom in spremembo izražanja obeh proteinov ni jasna in zahteva nadaljnje preiskave.

Slika 3. Primerjalna analiza genske ekspresije miši z izločenimi kalretikulini. (A): MA graf, ki prikazuje obsežne navzgor in navzdol regulirane gene v Calr plus / plus miših v primerjavi s Calr /. Kvantitativni testi spremembe gube (na podlagi normaliziranega log-transformiranega števila odčitkov) so bili izvedeni z uporabo Fisherjevega natančnega testa z Benjaminijevo-Hochbergovo korekcijo (p < 0.05),="" nepomembni="" geni="" pa="" so="" predstavljeni="" sivo.="" graf="" ma="" se="" uporablja="" za="" prikaz="" različno="" izraženih="" genov="" v="" calr="" plus="" plus="" proti="" calr="" (b):="" porazdelitev="" bioloških="" procesov="" navzdol="" reguliranih="" genov="" v="" calr/v="" primerjavi="" s="" calr="" plus="" plus="" -.="" klasifikacija="" identificiranih="" genov="" je="" bila="" izvedena="" z="" uporabo="" bioinformatičnega="" orodja="" david.="" simbol="" gena="" je="" bil="" uporabljen="" za="" kategorizacijo="" opomb="" genske="" ontologije,="" npr.="" bioloških="" procesov.="" (c):="" analiza="" obogatitve="" vrhunskih="" genov,="" za="" katere="" je="" bilo="" ugotovljeno,="" da="" so="" med="" tremi="" genotipi="" (calr="" plus="" plus,="" calr="" plus="" in="" calr/)="" znatno="" regulirani.="" primerjalna="" analiza="" je="" predstavljena="" kot="" toplotni="" zemljevid="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. Klasifikacija genske ontologije in analize mrežnih interakcij med beljakovinami

Grafi vulkanov in analize tortnih grafikonov so pokazale, da sprememba izraza Calr povzroči globalne spremembe v embrionalnemledvicaproteom (dodatna slika S4). Da bi pridobili več informacij o bioloških mehanizmih, povezanih z embrionalnimledvicarazvojne spremembe pri Calr / miših, smo združili bioinformatiko DAVID z informacijami o domnevni funkciji proteinov, ki jih najdemo v bazah podatkov UniProt in GenBank. Razvrstitev identificiranih proteinov glede na njihovo vpletenost v biološke procese je povzročila dvajset kategorij, z devetimi visoko zastopanimi kategorijami (dodatna slika S4D). Ena glavnih kategorij je bil razvojni proces, v to skupino spada več kot 1000 identificiranih proteinov. Ker so interakcije protein-protein ključni mehanizmi za skoraj vse biološke procese, vključno z razvojem, ekstrakcijo informacij o možnih interakcijah protein-protein in regulacijo poti, ki povezuje regulirane proteine ​​v Calr plus // in Calr/ embryonicledvicalahko zagotovi pomembne informacije o procesih, ki so oslabljeni v pogojih pomanjkanja Calr. V ta namen smo raziskali interakcijska omrežja med reguliranimi proteini z uporabo STRING 11.0 (http://string.embl.de, dostopno 24. marca 2021). Nadaljnja analiza beljakovin, izraženih samo v Calr plus / plus in Calr plus //, je razkrila dve močni interakcijski vozlišči iz beljakovin, vključenih v dva glavna procesa, ki sta metabolizem RNA in oksidativna fosforilacija (dodatna slika S5A). To nakazuje, da je Calr / embrionalniledvicalahko trpijo zaradi nenormalnosti v metabolizmu RNA in pomanjkanja energije. Preiskava interakcijskih mrež med proteini, ki so prekomerno izraženi v Calr plus / plus in Calr plus // v primerjavi s Calr/, močno podpira naše predpostavke, ker omrežja kažejo tri močna interakcijska vozlišča. Dve vozlišči sta kopičili beljakovine, ki sodelujejo pri metabolizmu RNA in oksidativni fosforilaciji, medtem ko tretje vozlišče vključuje ribosomske proteine ​​in je razkrilo motnje v tvorbi ribosomov in prometu beljakovin (dodatna slika S5B). Natančen pregled ribosomskih proteinov, za katere je bilo ugotovljeno, da so regulirani, je pokazal znatno spremembo proteinov iz velikih in majhnih ribosomskih podenot, kar je razkrilo resne motnje v ribosomski biogenezi in sintezi beljakovin (slika 6A–D).

2.5. Calr Knockout povzroči spremembo izražanja ribosomskih beljakovin 

Analize transkriptomskih in proteomskih podatkov so pokazale pomembno spremembo izražanja ribosomskih proteinov v Calr/mišjih embrionalnihledvice. Western blot analiza in MS kvantifikacija embrionalnihledvicabeljakovinski izvlečki iz treh genotipov so potrdili pomembno znižano regulacijo Rps10, Rps19 in Rps26.ledvice(Slika 7A) in Rps12, Rps13, Rps14 Rps15, Rps17 in Rps19 (dodatna slika S6A,B) v Calr/. Poleg tega obarvanje embrionalnihledvicaodseki so potrdili obseg spremembe v izražanju ribosomskih proteinov; v Calr/embryonic ni bilo mogoče zaznati Rps10 ali Rps6ledvicaodseki (slika 7B). Da bi raziskali povezavo med Calr knockout in izražanjem ribosomskih beljakovin, smo vzpostavili in vitro Calr knockout model v MDCKledvičnatubulnih celic z uporabo endonukleaznega sistema CRISPR/cas9. Western blot analize so potrdile od odmerka odvisno znižano regulacijo izražanja Calr v celicah MDCK in pokazale znatno zmanjšanje 40S ribosomske podenote, ki kodira proteina Rps10 in Rps19, kar je razkrilo motnjo v biogenezi ribosomov. Poleg tega je izražanje bistvenih komponent za sintezo beljakovin, npr. raztezek, razkrilo, da se je iniciacijski faktor eEIF5a znatno zmanjšal v celicah Calr knockout MDCK (slika 7C). Calrov knockout so spremljale pomembne morfološke, proteomske in transkriptomske spremembe. Naše raziskave in vivo in in vitro so dodatno poudarile, da je te aberacije spremljal znaten padec biogeneze ribosomov. Zmanjšanje ekspresije ribosomskih beljakovin v Calr knockoutuledvicani bila omejena na embrionalne stopnje, ampak jo je bilo mogoče dokazati tudi v celicah, pridobljenih iz odraslihledvice, ki razkriva potencialno vlogo Calr v ribosomski biogenezi.

Slika 7. Pomanjkanje Calr je povezano z znižano regulacijo izražanja ribosomskih beljakovin. (A): Western blot analize ribosomskih proteinov Rps10, Rps19 in Rps26 v beljakovinskih izvlečkih iz Calr plus / plus, Calr plus // in Calr // embrionalniledvice. Embrionalne ledvice so bile pridobljene iz treh različnih brejih Calr plus /- miši. Po genotipizaciji so bili zarodki iste matere in genotipa razvrščeni skupaj in njihovi zarodkiledvicabeljakovinski izvlečki so bili združeni. Po oceni beljakovin so bile izvedene Western blot analize v treh izvodih za vsak preiskovani protein. Za primerjalno analizo vzorcev je bila uporabljena enosmerna ANOVA. Rezultati so predstavljeni kot povprečje ± sd iz vsaj treh neodvisnih poskusov. Razlike so veljale za statistično pomembne, ko je p < 0.05.="" (b):="" imunoflfluorescenčno="" barvanje="" proti="" rps10="" in="" rps6="" v="" odsekih="" calr="" plus="" plus="" in="" calr悆="" mbrionalnih="" ledvičnih="" tkiv="" s="" povečavo="" 20×.="" (c):="" western="" blot="" analiza="" proteinskega="" ekstrakta="" iz="" celic="" mdck="" (levo)="" in="" kvantifikacija="" mrna="" po="" izločitvi="" calr="" v="" celicah="" mdck="" (desno).="" calr="" je="" bil="" izločen="" s="" sistemom="" crispr/cas9="" z="" dvema="" različnima="" sgrna.="" western="" bloti="" so="" bili="" testirani="" s="" protitelesi="" calr,="" gapdh,="" rps10,="" rps19="" in="" eif5a.="" kvantifikacije="" mrna="" calr="" in="" rps10="" v="" vzorcu="" sgcalr-2="" so="" bile="" izvedene="" s="" qpcr.="" nizka="" regulacija="" calr="" z="" uporabo="" sistema="" crispr/cas9="" je="" razkrila="" povezavo="" med="" pomanjkanjem="" calr="" in="" spremembo="" izražanja="" ribosomskih="" beljakovin.="" pomembne="" razlike:="" (**)="" p="">< 0,01,="" (***)="" p="">< 0,001,="" (****)="" p=""><>

3. Razprava

Theledvicerazvijejo z razvejano morfogenezo, ki je proces, ki vključuje kompleksne procese rasti in diferenciacije in ga poganjajo signali, ki prihajajo iz okoliških celic v nastajajočem mezenhimskem predelu [16]. V zadnjih letih je več ključnih genov in poti vledvicarazvoj. Priledvičnarast in diferenciacijo. Uravnavajo signalizacijo, vključeno v morfogenezo razvejanja UB, kot tudi pri vzdrževanju in diferenciaciji nefrogenega mezenhima v embrionalnemledvica[17]. Calr knockout povzroči embrionalno smrtnost zaradi disfunkcionalnega razvoja srca [15]. V normalnih kardiomiocitih je za spodbujanje srčne miofibrilogeneze potrebno povečanje citoplazemske koncentracije Ca2 plus. Ta nepogrešljiva sprememba koncentracije Ca2 plus je odvisna od Calr in je odsotna v pogojih pomanjkanja Calr [18]. Funkcionalna vloga ER šaperona in proteina Calr, ki veže kalcij, v nefrogenezi še ni bila raziskana. Da bi raziskali potencialno vlogo Calr v embrionalnemledvicarazvoj in vpliv pomanjkanja Calr na nefrogenezo, smo opravili primerjalno transkriptomsko in proteomsko analizo. Na splošno je pomanjkanje Calr povzročilo upočasnitev razvoja ledvic in nepomembne spremembe transkriptoma in proteoma. Poleg tega so naši podatki razkrili, da je pomanjkanje Calr sprožilo resne motnje v poteh nefrogeneze, saj so bile ugotovljene pomembne spremembe izražanja Wnt signalnih ključnih proteinov (npr. Wnt7a, Wnt11, Wnt10b, Fzd10, Fzd9, Prkcb, Prkcq in Kremen2). Induktivno signaliziranje med epitelijem sečničnega popka in metanefričnim mezenhimom v glavnem uravnava povratno signaliziranje Wnt [19, 20]. Medtem ko je Calr glavni del celične homeostaze kalcija, je hkrati bistven spremljevalec ER za zvijanje in promet glikoproteinov in beljakovin, vključenih v celično signalizacijo in izražanje genov [21]. Izločitev Calr bi lahko povzročila motnje zvijanja beljakovin in ER stresa, kar povzroči motnje v translacijskih strojih. To lahko pojasni opaženo zaostajanje v razvoju ledvic pri homozigotnih miših.

Eden od presenetljivih in zanimivih vidikov, ki so jih izpostavili naši podatki, je sprememba izražanja ribosomskih proteinov. Pokazali smo skoraj popolno izčrpanost več proteinov ribosomskih podenot 40S in 60S. Poleg tega so naši poskusi in vitro potrdili korelacijo med znižano regulacijo Calr in poslabšanjem izražanja ribosomskih beljakovin. Biogeneza ribosomov je dobro organizirana in podvržena strogi regulaciji. Nove študije so pokazale, da ima ribosom pomembno vlogo ne le v normalni celični fiziologiji, temveč tudi pri odzivanju na dražljaje in v patogenezi bolezni. Poleg tega biogeneza ribosomov nadzoruje rast celic, proliferacija in spremembe v ribosomih pa se odražajo v aberaciji celične proliferacije, zaustavitvi celičnega cikla, apoptozi in patoloških manifestacijah [22, 23].

Poleg njihove vloge pri biogenezi ribosomov je bilo ugotovljeno, da ribosomski proteini izvajajo različne dodatne ribosomske funkcije, npr. pri celični rasti in proliferaciji, pri popravljanju DNK ter pri celični diferenciaciji in razvoju [24–31]. Oslabitev funkcij ribosomskih beljakovin je bila povezana s hematološkimi in presnovnimi motnjami ter lahko povzroči kardiovaskularne bolezni in raka [32–36]. Mutacije v genih, ki kodirajo ribosomske proteine, so povezane z nenormalnostjo eritropoeze, kar povzroči klinične sindrome, npr. anemijo Diamond–Blackfan (DBA) [37] in 5q-sindrom [38]. Mutacije v RPS10 so povezane z anemijo Diamond–Blackfan in 30 odstotkov teh bolnikov ima podkvasto ali sigmoidnoledvice[39]. Zanimivo je, da imajo bolniki Diamond–Blackfana večjo možnost za razvoj mielodisplastičnega sindroma, ki je povezan z mutacijo eksona 9 gena Calr [40–42]. To preoblikovanje translacijskega mehanizma povzroča velike aberacije v razvojnem procesu in ne vpliva le na urogenitalni, temveč tudi na obtočni in reproduktivni sistem, kar sčasoma povzroči smrt zarodka zaradi pomanjkanja kalretikulina. Naši podatki so razkrili motečo biogenezo ribosomov v Calr/embrionalnemledvicain poudaril pomembno vlogo Calr v biogenezi beljakovin. Verjamemo, da bi boljše razumevanje odnosov med pomanjkanjem Calr in spremembo izražanja ribosomskih beljakovin zagotovilo nove vpoglede za razumevanje, kako Calr vpliva na biogenezo ribosomov in embrionalneledvicarazvoj in omogočajo nove poglede na procese, ki vodijo razvoj organov.

4. Materiali in metode

4.1. Živali

Kalretikulinske heterozigotne (Calr plus //) in divje (Calr plus / plus) miši iz legla v identičnem genetskem ozadju C57BL/6J so bile pridobljene od profesorja Mareka Michalaka, Univerza Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada. Miši so bile vzrejene v posebnih pogojih bivanja brez patogenov in genotipizirane, kot je prej opisano v Michalak et al. [15]. Za našo študijo smo breje miši Calr plus // žrtvovali na različnih stopnjah embrionalnega razvoja (embrionalni dnevi 13,5: E13,5; 14,5: E14,5; in 16,5: E16,5), zarodke smo pobrali inledviceso secirali. Za genotipizacijo je bil uporabljen delček repa zarodka. Theledviceso bili nadalje pripravljeni bodisi za histokemično obarvanje ali transkriptomično ali proteomsko analizo. Vsi poskusni postopki so bili izvedeni v skladu z nemško zakonodajo o oskrbi živali in etiki (standardi NIH) in jih je odobril lokalni odbor za etiko Univerzitetnega medicinskega centra Göttingen v Nemčiji (33.14-42502-04-11/0598).

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNE/LEDVIČNE BOLEČINE

4.2. Histokemično barvanje

Za histološko barvanje zarodkaledvice, izločenoledviceso bili čez noč fiksirani v 4-odstotni pufrirani raztopini formaldehida in nato vstavljeni v parafinske bloke. Odrezke, vgrajene v parafin, smo deparafinizirali in rehidrirali ter obarvali z raztopino hematoksilina Gill III in raztopino eozina Y (Merck, Darmstadt, Nemčija) v skladu s protokolom proizvajalca.

4.3. Ex-Vivo organska kultura embrionalne ledvice

Kultura organov ex vivo je bila izvedena v skladu z Davies et.al [43]. Breje miši so žrtvovali na stopnji E13.5 embrionalnega razvoja, zarodke pobrali inledviceso secirali. Po genotipizaciji, 6ledvicazametke iz vsakega genotipa (Calr plus / plus, Calr plus // in Calr/) smo nasadili na prozorno PET membrano z velikostjo por 0.4 µM (24 vdolbinic, BD Falcon). Membrana je bila postavljena v eno vdolbino plošče s 24 vdolbinicami, ki je vsebovala 400 µLledvicagojišče (KCM, DMEM, 10 odstotkov inaktiviranega FCS). To je omogočiloledvicaza stik z medijem, ne da bi ga utopili. Pod temi pogoji je bilo mogoče ohranitiledvicagojijo pri 37 ◦C in 5 odstotkih CO2 vsaj 144 ur.

4.4. Imunoflfluorescenčno barvanje kultiviranih ledvic in imunohistološka analiza ledvičnih delov

Zarodekledvicegojili ex vivo 72 ur, nato paledvicazametke smo 30 minut fiksirali v hladnem metanolu pri t 20 ◦C. Koraku fiksiranja so sledili 3 koraki pranja, od katerih je bil vsak 5 minut v PBS. Primarno protitelo zajčje monoklonsko protitelo proti lamininu (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ZDA) je bilo razredčeno v PBS in inkubirano pri 4 °C čez noč. Kulturniledvicazametke smo 4 ure izpirali v PBS in preko noči pri 4 °C dodajali sekundarno protitelo (Molecular Probes Alexa Fluor 555 kozji anti-kunčji IgG (1:500)). UB je bil obarvan z uporabo lektina Dolichos biflflorus agglutinin (DBA) vsaj 3 ure. Po inkubaciji seledvicesmo 3 ure izpirali v PBS in vdelali za mikroskopsko analizo. Imunsko barvanje deparafiniziranih in rehidriranih zarodkovledvicaOdseki so bili izvedeni za odkrivanje izražanja in porazdelitve več proteinov. Odseke smo obdelali z raztopino za pridobivanje antigena (1,8 µM citronske kisline in 8,2 µM natrijevega citrata), ki smo jo 25 minut predhodno segrevali v sopari. Odseke smo 1 uro blokirali z 10-odstotnim kozjim serumom v PBS in jih čez noč inkubirali pri 4 ◦C s primarnimi protitelesi (uporabljena so bila naslednja primarna protitelesa: kunčja monoklonska protitelesa proti kalbindinu-1, anti-Wt1, anti- Six2, anti-Pax2, anti-Calr (Abcam, Cambridge, UK), zajčja monoklonska protitelesa proti Rps6, antiRps10 (Invitrogen) in zajčja monoklonska protitelesa proti Sod1 (Abnova, Taipei, Tajvan). Primarna protitelesa so bila odkrita s fluorescenco označena sekundarna protitelesa (molekularne sonde Alexa Fluor 555 kozje protitelo proti miši IgG in Alexa Fluor 555 kozje proti kunčje IgG) 1 uro pri sobni temperaturi. Za negativne kontrole so bili odseki tkiva inkubirani samo s sekundarnim protitelesom. Stekelci so bili nameščeni s pokrovnimi stekelci v pritrdilnem mediju Vectashield z DAPI za kontrastno barvanje jeder (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ZDA).

4.5. Celična kultura

Psi Madin–Darbyledvica(MDCK) celice so bile pridobljene iz ameriške zbirke tipskih kultur (ATCC) in razmnožene v Dulbeccovem modificiranem orlovem mediju (DMEM), 10 odstotkih fetalnega govejega seruma (FBS), 1 odstotkih penicilina/streptomicina in 1 odstotkih L-glutamina pri 37 °C. v atmosferi s 5 odstotki CO2-. Celice gojimo v steklenicah T25 in jih razdelimo dvakrat na teden. Za celično pasažo so bile celice MDCK tripsinizirane za kratek čas, da bi se izognili spremembi celične strukture.

4.6. Generacija izločenih celic

Sekvence sgRNA Calr (XM8622117) za vrsto canis lupus so bile zasnovane s spletnim orodjem BlueHeronBio (Origene, Herford, Nemčija). Zaporedje sgRNA 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30 je bilo vstavljeno v plazmid pLenti-Cas-Guide (plazmidi Addgene #3931646) z restrikcijskima encimoma BamHI in BsmBI, da se ustvari konstrukt pLenti-Cas9-Calr, ki je bil pozneje potrjen s Sangerjevim sekvenciranjem. Da bi izločili Carla v celicah MDCK, je bila izvedena prehodna transfekcija pLenti-Cas9-Calr. En dan pred transfekcijo je bilo 200,000 celic/ml posejanih v plošče s 6 vdolbinicami z medijem MEM. Pred transfekcijo smo gojišče kulture spremenili v medij Opti-MEM brez FCS. Za transfekcijo celic smo uporabili Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Mešanica plazmidne DNA lipofektamina je bila pripravljena z OptiMEM na podlagi inštruktorjevega protokola. Za transfekcijo plošče s 6 jamicami smo 4 µg plazmidne DNA ločeno dodali v 250 µL medija Opti-MEM in inkubirali 10 minut pri sobni temperaturi. Nato smo mešanico DNA dodali mešanici Lipofectamine 2000 in jo inkubirali 30 minut, preden smo jo dodali celicam. Uspeh transfekcije je bil ocenjen z uporabo Western blota.

4.7. Analiza transkriptoma

Za preiskave transkriptoma so bile uporabljene 3 breje Calr plus // miši. Zarodki (8–10/breje miši) so bili pobrani inledviceso bili izolirani. Po genotipizaciji,ledviceiz istega genotipa in iste matere so bile združene in obdelane za ekstrakcijo RNK. Celotne RNA so bile izolirane iz Calr plus / plus , Calr plus // in Calr / embryonicledvicepo metodi Trizol (Invitrogen) po priporočilih proizvajalca. Vzorce smo nato obdelali z DNAse I (Sigma), da smo odstranili kontaminacijo DNA. Kakovost RNA je bila ugotovljena z mikrofluidno elektroforezo Agilent 21{{10}}0 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA). Za sekvenciranje so bili vzorci RNA pripravljeni z uporabo "TruSeq RNA Sample Prep Kit" v skladu s protokolom proizvajalca (Illumina, San Diego, CA, ZDA). Sekvenciranje z enim branjem (50 bp) je bilo izvedeno z uporabo HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, ZDA). Zaporedja so bila poravnana z referenčnim zaporedjem genoma Mus Muscullus (Ensembl genome assembly 3.2.1; https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly. html, dostopno 24. marca 2021) z uporabo poravnave STAR programska oprema (Cold Spring Labaro tory, Cold Spring Harbor, ZDA) (različica 2.3.0e, https://github.com/alexdobin/STAR, dostopno 24. marca 2021) [44], ki omogoča 2 neujemanja znotraj 50 baz. Za filtriranje unikatnih zadetkov in štetje sta bila uporabljena paket SAMtools (različica 0.1.18) in HTSeq (različica 0.6.1p1) [45,46]. Kandidatni geni so bili filtrirani na najmanjšo 2-kratno spremembo in FDR-popravljeno p-vrednost < 0,05.="" gensko="" označevanje="" je="" bilo="" izvedeno="" z="" mus="" muscullus="" iz="" ensembl="" v78="" (www.ensembl.org,="" dostopno="" 1.="" marca="" 2019)="" prek="" paketa="" biomart="" (različica="" 2.24.0)="" [47].="" analiza="" obogatitve="" go="" za="" kandidatne="" gene="" je="" bila="" izvedena="" s="" paketom="" goseq="" (različica="" 1.2)="" [48]="" z="" uporabo="" standardnih="">

4.8. Liza ledvic, ekstrakcija beljakovin in dvodimenzionalna gelska elektroforeza (2-DE)

Za 2D gelsko elektroforezo so bili uporabljeni zarodki 6 brejih samic Calr plus // (8–10 zarodkov/samico). Za ekstrakcijo beljakovin za 2D gelsko elektroforezo (2-DE) jeledviceiz zarodkov v istem embrionalnem stadiju in iz istega genotipa in samice (8–10 zarodkov/brejo samico) smo združili, prekinili z liznim pufrom (9,5 M sečnina, 2 odstotka CHAPS (w/v), 2 odstotka amfolitov (w /v), 1 odstotek DTT) in vrtinčen. Po dodajanju pufra za telizo smo vzorce inkubirali 30 minut pri 4 ◦C. Da bi odstranili celične ostanke, smo centrifugirali pri 13, 000 × g in 4 ° C 30 minut. Supernatant smo ponovno centrifugirali dodatnih 30 minut pri 13,000× g in 4 ◦C, da smo dosegli največjo čistost. Supernatante smo zbrali in pelete zavrgli, dobljene vzorce pa uporabili takoj ali shranili pri –80 ◦C do uporabe. Da bi zmanjšali kontaminacijo s soljo in obogatili beljakovine, smo izvedli obarjanje z metanolom in kloroformom po Wesselu in Flüggeju [49]. Pelet smo posušili in raztopili v pufru za lizo. Celotno koncentracijo beljakovin smo določili s testom beljakovin Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) po Bradfordu. Kot standard je bil uporabljen BSA (Sigma, Steinheim, Nemčija). Da bi zagotovili eksperimentalno ponovljivost, smo iz vsakega ustvarili trojne geleledvicabazen. 2D ločevanje beljakovin je bilo izvedeno, kot je opisano prej [50]. 2-DE geli so bili obarvani s fluorescenčnim gelnim barvilom Flamingo (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca. Po obarvanju smo gele skenirali pri ločljivosti 50 µm na skenerju Fuji FLA-5100. Digitalizirane slike so bile analizirane z uporabo Delta 2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Nemčija). Za vizualizacijo beljakovin so bili 2-DE geli čez noč dodatno obarvani s koloidno Coomassie blue, Roti-Blue (Roth, Karlsruhe, Nemčija).

4.9. Masna spektrometrična analiza in identifikacija beljakovin

Iz gelov so bile izrezane znatno regulirane lise, izvedena pa je bila triptična razgradnja v gelu in ekstrakcija peptidov, kot so predhodno opisali Dihazi et al. [51]. Na kratko, gelne lise smo dvakrat splaknili v 25 mM amonijevem bikarbonatu (amBic) in enkrat v vodi, 15 minut skrčili z 100 odstotki acetonitrila (ACN) in posušili v SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) 20–30 minut. Vse izrezane lise so bile inkubirane z 12,5 ng/µL tripsina za sekvenciranje (Roche Molecular Biochemicals, Basel, CH) v 25 mM amBic čez noč pri 37 ◦C. Ekstrakcijo peptida smo izvedli dvakrat, tako da smo najprej uporabili 50 odstotkov ACN/1 odstotek trifluoroocetne kisline (TFA) in nato 100 odstotkov ACN. Vse izvlečke smo združili in volumen zmanjšali z uporabo SpeedVac. Triptični peptidi so bili izpostavljeni masnemu spektrometričnemu sekvenciranju z uporabo Q-TOF Ultima Global masnega spektrometra (Micromass, Manchester, Združeno kraljestvo), opremljenega z nanofllow ESI Z-sprejom. Identifikacija beljakovin je bila izvedena z iskalnikom Mascot proti podatkovnim bazam MSDB in Swissprot z uporabo tolerance mase peptida in tolerance fragmentov 0, 5 Da.

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO OKVARJO

4.10. Ekstrakcija beljakovin, SDS-PAGE, triptična razgradnja v gelu in analize masne spektrometrije

Za masno spektrometrično kvantifikacijo spremembe beljakovin v Calr/ledvica, so bili vzorci istega genotipa in iste matere združeni. Da bi ustvarili dovolj skupin in zagotovili biološko in eksperimentalno replikacijo, smo uporabili 6 različnih brejih Cal plus // z 8–10 zarodki/miši. Zarodekledviceiz treh genotipov smo pobrali iz zarodkov in izvedli ekstrakcijo beljakovin z uporabo liznega pufra, kot je opisano zgoraj. Proteinske izvlečke smo ločili s SDS-PAGE, gele obarvali s Coomassie Blue, vsako stezo izrezali in razrezali na 20 rezini enake velikosti, rezine pa izpostavili razgradnji v gelu s tripsinom. Za masno spektrometrično analizo so bili vzorci obogateni na predkoloni C18 z reverzno fazo (0.15 mm ID × 20 mm, Reprosil-Pur120 C{{11} }AQ 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Nemčija) in ločeno na analitični koloni C18 z reverzno fazo (0.075 mm ID × 200 mm, Reprosil-Pur 120 C{ {21}}AQ, 3 µm, Dr. Maisch) z uporabo 30-minutnega linearnega gradienta 5–35 odstotkov acetonitrila/0,1 odstotka mravljinčne kisline (v:v) pri 300 nl min-1). Eluent je bil analiziran na Q Exactive hibridnem kvadrupolnem/orbitrap masnem spektrometru (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Nemčija), ki je bil opremljen z izvorom FlexIon nanoSpray in je deloval pod programsko opremo Excalibur 2.4 z uporabo metode odvisnega pridobivanja podatkov. Vsak eksperimentalni cikel je bil v naslednji obliki: eno celotno skeniranje MS v območju 350–1600 m/z je bilo pridobljeno pri nastavitvi ločljivosti 70,000 FWHM in cilju AGC 106 in najdaljšem času polnjenja 60 ms . Do 12 najpogostejših peptidnih prekurzorjev stanj naboja od 2 do 5 nad pragom intenzivnosti 2 × 104 je bilo nato zaporedno izoliranih pri širini izolacije 2,0 FWHM, fragmentiranih z dušikom pri normalizirani nastavitvi energije trka 25 odstotkov in posledičnih produktnih ionskih spektrov je bil posnet pri nastavitvi ločljivosti 17.500 FWHM in ciljni AGC je bil 2 × 105 in najdaljši čas polnjenja 60 ms. Izbrane predhodne vrednosti m/z so bile nato izključene za naslednjih 15 s. Pridobljeni sta bili dve tehnični ponovitvi na vzorec. Seznami vrhov so bili ekstrahirani iz neobdelanih podatkov s programsko opremo Raw2MSMS v1.17 (Max Planck Institute for Biochemistry, Martinsried, Nemčija). Identifikacija beljakovin je bila dosežena s programsko opremo MASCOT 2.5.1 (Matrixscience, London, Združeno kraljestvo). Proteini so bili identificirani glede na mišji referenčni proteom UniProtKB v2017.09 (16930 proteinskih vnosov) skupaj z nizom 51 kontaminantov, ki so običajno identificirani v našem laboratoriju. Iskanje je bilo izvedeno s tripsinom kot encimom in jodoacetamidom kot zaviralcem cisteina. Dovoljeni sta bili do dve zgrešeni triptični cepitvi in ​​oksidacija metionina kot spremenljiva modifikacija. Tolerance iskanja so bile nastavljene na 10 ppm za maso prekurzorja in 0,05 Da za mase fragmentov, kot tip instrumenta pa je bil določen ESI-QUAD-TOF. Različica programske opreme Scaffold 4.8.9 (Proteome Software Inc., Portland, OR, ZDA) je bila uporabljena za validacijo identifikacije peptidov in beljakovin na osnovi MS/MS. Identifikacije peptidov so bile sprejete, če jih je algoritem Percolator lahko ugotovil z več kot 95,0-odstotno verjetnostjo. Identifikacije beljakovin so bile okrnjene na stopnjo lažnega odkritja 1 odstotka pri najmanj 2 zanesljivo identificiranih peptidih. Zadetki beljakovin, ki so vsebovali podobne peptide in jih poleg tega ni bilo mogoče razlikovati samo na podlagi analize MS/MS, so bili razvrščeni v skupine, da bi zadostili načelom skromnosti. Proteini, ki si delijo pomembne peptidne dokaze, so bili združeni v skupine. Številčnost beljakovin je bila ocenjena z njihovim spektralnim številom po normalizaciji skupnih vsot med vsemi ponovitvami.

4.11. Western blot analiza

Western blot analize so bile izvedene po Towbinu et al. [52]. Enake količine beljakovin (50–75 µg) smo ločili z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) in jih prenesli na nitrocelulozne membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Membrane so bile blokirane v 5-odstotnem nemastnem suhem mleku v TBST-pufru (20 mM Tris-HCl, pH 7.4 150 mM NaCl 0,1 odstotka Tween 20) in inkubirane s primarnimi protitelesi (anti-Calr, anti -Rps10, anti-Rps19, anti-Rps26 in anti-eIF5A) čez noč pri 4 ◦C. Za vizualizacijo proteinskih pasov so bila uporabljena fluorescenčno označena sekundarna protitelesa. Da bi potrdili enako obremenitev z beljakovinami, smo blote obdelali s protitelesi anti-Actb ali anti-GAPDH (Sigma, Taufkirchen, Nemčija).

4.12. Bioinformatika

Razvrstitev identificiranih proteinov glede na njihove večinoma znane in domnevne funkcije je bila izvedena z uporabo bioinformatike DAVID (http://david.abcc. ncifcrf.gov, dostopno 21. februarja 2019) [53,54]. Genski simboli so bili uporabljeni za raziskovanje in kategorizacijo opomb genske ontologije (GO) (biološki procesi in molekularne funkcije). Mrežna analiza znanih in predvidenih interakcij protein-protein identificiranih proteinov je bila izvedena z uporabo STRING (orodja za iskanje za iskanje interakcijskih genov/proteinov) [55].

4.13. Statistična analiza

Za {{0}}DE so bile digitalizirane slike analizirane in ujemanje točk po gelih ter normalizacija izvedena z uporabo Delta2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Nemčija). Delta2D izračuna vrednost "kakovosti točke" za vsako zaznano točko. Ta vrednost kaže, kako natančno točka predstavlja "idealno" 3D Gaussovo obliko zvona. Na podlagi povprečnega volumskega razmerja pik so bile pike, katerih relativni izraz je bil spremenjen vsaj 2--krat (povečanje ali zmanjšanje) v trojniku med primerjanimi vzorci, pomembne. Da bi analizirali pomen regulacije beljakovin, smo izvedli Studentov t-test in predpostavili statistično značilnost za vrednosti P, manjše od 0.05. Vsi madeži so bili kvantificirani s programsko opremo ImageJ. Podatki so bili zbrani s programskim paketom GraphPad Prism, različica 8 (San Diego, CA, ZDA). Programska oprema je bila uporabljena za grafično predstavitev in analizo s Studentovo t-distribucijo ali enosmerno ANOVA. Rezultati so predstavljeni kot povprečje ± sd iz vsaj treh neodvisnih poskusov. Razlike so veljale za statistično pomembne, ko je p < 0,05.="" konice="" brstov="" sečevodov="" in="" nefroni="" so="" bili="" prešteti="" ročno,="" podatki="" pa="" so="" bili="" zbrani="" s="" programskim="" paketom="" graphpad="" prism,="" različica="">