Poglavje 1: Krϋppelu podoben faktor 15 zavira proliferacijo ledvičnih glomerularnih mezangialnih celic s povečanjem konjugacije P53 SUMO1

Za več informacij. stiktina.xiang@wecistanche.com

Povzetek

Mesangialna celica (MC)širjenjeje ključna patološka značilnost pri številnih običajnih ljudehledvične boleznivključno z mezangialnim proliferativnim nefritisom in diabetičnimi nefropatijami. Poznavanje odzivov MC na patološke dražljaje je ključnega pomena za razumevanje teh bolezenskih procesov. Prej smo ugotovili, da je Krüppelu podoben faktor 15 (KLF15), transkripcijski faktor cinkovega prsta, obogaten z ledvicami, potreben za inhibicijo proliferacije MC. V tej študiji smo raziskali neposredni ciljni gen in osnovni mehanizem, s katerim je KLF15 reguliral mezangialno proliferacijo. Najprej smo pregledali majhen z ubikvitinom povezan modifikator 1 (SUMO1) kot neposredni transkripcijski cilj KLF15 in potrdili to ugotovitev s ChlP-PCR in testi luciferaze. Poleg tega smo dokazali, da je prekomerna ekspresija KLF15 ali SUMO1 povečala stabilnost P53, ki je blokiral celični cikel človeških ledvičnih MC (HRMC) in zato odpravil celično proliferacijo. Nasprotno pa knockdown SUMO1 v HRMC, tudi tistih, ki so prekomerno izraženi s KLF15, ni mogel zavirati stopnje proliferacije HRMC in povečati SUMOilacije P53. Končno so rezultati pokazali, da so se ravni SUMOiliranega P53 v ledvični skorji podgan anti-Thy 1 modela zmanjšale med obdobji proliferacije. Te ugotovitve razkrivajo kritičen mehanizem, s katerim KLF15 cilja na SUMO1 za posredovanje širjenja MC.

KLJUČNE BESEDE: KLF15, proliferacija mezangialnih celic, P53, SUMO1

Kliknite tukaj, če želite spoznati prednosticistanchein kje lahko kupite cistanche tubulosa

1| UVOD

Mesangialne celice (MC) predstavljajo približno eno tretjino celične populacije v glomerulu. Imajo pomembno vlogo pri homeostazi z vzdrževanjem strukturne zgradbe glomerulusa, proizvodnjo in vzdrževanjem mezangialnega matriksa, uravnavanjem površine filtracije in fagocitozo apoptotičnih celic ali imunskih kompleksov.1 Pri številnih glomerularnih boleznih, kot sta mezangialni proliferativni nefritis in diabetične nefropatije , so MC poškodovane in so podvržene veliki spremembi v fenotipu, kar ima za posledico nenadzorovano mezangialno proliferacijo in prekomerno odlaganje mezangialnega matriksa.2-4 Poleg hiperproliferacije in povečane proizvodnje proteinov zunajceličnega matriksa (ECM) in matričnih metaloproteinaz lahko MC povzročijo sproščanje vnetnih dejavnikov, kar ima za posledico glomerularno sklerozo in intersticijsko fibrozo; dodatno poslabša ledvično okvaro in povzroči napredovanje v ireverzibilno končno ledvično odpoved.5-Poznavanje odziva MC na patološke dražljaje je ključnega pomena za razvoj zdravljenja za zmanjšanje okvare ledvic, ki jo povzroča nenormalna proliferacija MC, in upočasnitev napredovanja v končni stadij ledvične bolezni.

Krüpplovi podobni faktorji (KLF) so skupina transkripcijskih faktorjev, ki vežejo DNA cinkovega prsta. Vse več dokazov kaže, da je ta družina vključena v različne celične procese, kot so diferenciacija celic, preoblikovanje srca, hematopoeza in določanje usode matičnih celic.8-10 Družino KLF sestavlja osemnajst članov, med katerimi je široko razširjen KLF15. vledvica, trebušna slinavka, srce,jetra, in skeletne mišice. Prejšnje študije so pokazale, da je KLF15 ključni transkripcijski regulator v različnih fizioloških procesih, vključno z glukoneogenezo,imunski odziviin diferenciacijo adipocitov.1-14 Naša prejšnja študija je pokazala, da je KLF15 potreben za zaviranje proliferacije MC.15 Namen te študije je bil razjasniti neposredni ciljni gen in spodnji mehanizem, s katerim KLF15 uravnava mezangialno proliferacijo.

2|MATERIALI IN METODE

2.1 |Model nefritisa proti Thy1

Samci podgan Wistar (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.), ki so tehtali med 200 in 220 g, so bili naključno dodeljeni kontrolni skupini in skupini proti Thy1. Vse podgane so bile nameščene v objektu za varstvo živali v ciklu svetloba/tema 12/12 ur s prostim dostopom do hrane in vode. Ocene in posegi v zvezi z blaginjo so bili izvedeni skozi ves poskus. Skupaj je bilo 28 podganam injicirano mišje anti-Thy1 monoklonsko protitelo, kot je opisano prej,16 in sedmim je bila injicirana fiziološka raztopina (kontrole). Glomerule smo očistili iz tkiva ledvične skorje z metodo sejanja. Serume smo zbrali za meritve dušika sečnine in kreatinina v serumu. Podgane z modelom anti-Thy1 smo ubili na dneve O, 3, 5, 7 in 10 in njihove glomerule pobrali. Vse dobro počutje živali in poskusni postopki so bili izvedeni v strogem skladu z Navodili za nego in uporabo laboratorijskih živali (Nacionalni raziskovalni svet ZDA, 1996).

2.2|Kultura in zdravljenje človeške ledvične MC (HRMC).

Primarni ledvični HRMC so bili kupljeni pri ScienCell (San Diego, CA). HRMC od tretjega do šestega prehoda smo vzdrževali v MC Medium (MsCM; ScienCell) v skladu z navodili proizvajalca. Za poskuse so celice gojili do sotočja, rast ustavili v zmanjšanem serumu (0.5 odstotkov FBS) za 24 ur in jih razdelili v različne poskusne skupine.

Za zdravljenje z različnimi koncentracijami glukoze so bile celice inkubirane v MsCM, ki je vseboval 5 mmol/L glukoze (normalna glukoza) ali 30 mmol/L glukoze (visoka glukoza, HG) 48 ur pri 37 stopinjah C. Celice so bile inkubirane pod enakimi poskusnimi pogoji. Kot osmotske kontrole so bili uporabljeni pogoji s 5 mmol/L glukoze in 25 mmol/L manitola namesto 30 mmol/L glukoze. Za zdravljenje s PDGF-BB so bile celice inkubirane v MsCM, ki je vseboval 20 ng/ml PDGF-BB (R&D Systems, Minneapolis, MN) 48 ur pri 37 stopinjah C.

2,3|Imunohistokemija (IHC)

Ledvično tkivo, vgrajeno v parafin, je bilo razrezano na 4 μm debeline in odseki so bili obarvani za IHC. Rezine smo inkubirali s 3 odstotki H, O, da blokiramo endogeno peroksidazo po deparafinizaciji. Po pridobitvi antigena in blokiranju so bile rezine inkubirane s protitelesi proti KLF15 (ab81604, Abcam), protitelesom proti majhnemu ubikvitinu povezanemu modifikatorju 1 (SUMO1, ab32058, Abcam) in protitelesom proti PCNA (ab92552, Abcam) pri 4 stopinjah C Rezine smo nato 30 minut inkubirali s sekundarnim protitelesom, označenim s hrenovo peroksidazo, pri 37 stopinjah in opazovali imunohistokemično reakcijo v skladu z navodili proizvajalca s 3,3'-diaminobenzidinom (DAB, ORIGINE, CN) kot kromogenim sredstvom. . Nato so bili preparati kontrastno obarvani s hematoksilin-eozinom in slikani s svetlobnim mikroskopom (Olympus). Imunohistokemično barvanje je bilo ocenjeno s programsko opremo Image J glede na vrednost povprečne optične gostote (AOD).

2.4|Imunoprecipitacija kromatina (ChlP) z vzporednim sekvenciranjem (ChIP-Seq)

ChIP je bil izveden z uporabo Simple ChlP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads; Cell Signaling Technology) v skladu s protokolom proizvajalca. Na kratko, HRMC-ji so bili čezmerno izraženi bodisi s KLF15 bodisi s kodiranimi celicami pri gostoti celic 2.0×10³celic/mL in zamreženi z 1,7-odstotnim formaldehidom v PBS 5 minut pri sobni temperaturi (RT ). Zamrežene celice so bile lizirane, da smo dobili jedrsko frakcijo, ki smo jo obdelali z ultrazvokom v pufru 1 × ChIP. Lizate smo zbistrili s centrifugiranjem pri 9300×g 10 minut pri 4 stopinjah. Vzorce kromatina smo inkubirali s protitelesom proti KLF15 (ab81604, Abcam) ali protitelesom proti lgG (kontrola ozadja) čez noč pri 4 stopinjah. Komplekse, vezane na protitelesa, smo ujeli z inkubacijo z magnetnimi kroglicami proteina G. Knjižnice ChlP-Seq za sekvenciranje so bile pripravljene z uporabo TruSeq ChlP Sample Prep Kit (Illumina). Knjižnice so bile podvržene vzporednemu sekvenciranju s sekvencerjem HiSeq2500 (Illumina) z uporabo enosmernega protokola dolžine sekvenciranja 50 bp. Neobdelani podatki sekvenciranja naslednje generacije (NGS) so bili pretvorjeni v datoteke FASTQ z uporabo programske opreme CASAVA (različica 1.8.2) in vsak niz podatkov je bil poravnan s človeškim referenčnim genomom (UCSC hg19) z uporabo Burrows-Wheeler Alignerja (različica 0.7.12). ).17 Priklic vrhov ChIP-Seq je bil izveden s programom MACS2 (različica 2.0.1) s privzetimi parametri, vendar vrednostjo aq 0,05, z vhodnimi podatki za odštevanje.18 Primerjava vrhov s kodiranim nadzorom (starševske celice) in vzorci čezmerne ekspresije so bili izvedeni z Diffbindom, paketom R, z uporabo algoritma DeSeq2, stopnja napačnega odkritja 0,1 pa je veljala za znak pomembnosti. programska oprema ROSE.2 stopinja Vrhovi ChIP-Seq so bili označeni s paketom R ChlPpeakAnno, promotorji pa so bili definirani kot regije, obogatene s KLF15- znotraj 1 kb od mesta začetka transkripcije.21 Gen z mestom začetka transkripcije, ki je najbližje c vstop vsakega super-ojačevalca je bil opredeljen kot ciljni gen tega super-ojačevalca.

2.5|ChIP-kvantitativni PCR v realnem času (ChlP-PCR)

Postopek ChlP-PCR je bil podoben zgoraj opisanemu postopku. ChIP DNA iz celic, obdelanih s protitelesi proti KLF15, je bila uporabljena za odkrivanje povezave med KLF15 in SUMO1. DNA iz celic, obdelanih s protitelesi proti IgG, je služila kot kontrola. Očiščeno DNK smo uporabili za analizo proksimalne promotorske regije SUMO1 s PCR v realnem času na ABI PRISM 7600 z uporabo SYBR GreenER qPCR Supermix. Primerji SUMO1 so bili naslednji: naprej: 5'-AGCAGCGGTCTTTAGCATCA-3';nazaj:5'-TCGGTTAACCAGCACCCTTG-3'. Relativno pomnoževanje promotorskega zaporedja gena je bilo izračunano z uporabo {{18 }}AcT metoda, normalizacija pa je bila izvedena glede na razredčino 1:100 vhodne DNA.

2.6|Označevanje celic in označevanje stabilnih izotopov z analizo aminokislin v celični kulturi (SILAC)

Celice pri 15-odstotni konfluenci so bile zasejane v ustreznem popolnem mediju (za HRMC: MsCM). Označevanje in postopki SILAC so bili opisani v prejšnjih raziskavah.22 Na kratko, po označevanju z lahkim (13C,-označen) ali težkim (15N,-označen) lizinom in lahkim (1c-označen) ali težkim (15N-označen )arginina so bile celice transfektirane s prekomerno ekspresijskim plazmidom KLF15 ali kontrolnim plazmidom. Po obdelavi smo celice tripsinizirali in prešteli, da smo dobili celično peleto 2×10'celic/stanje, celice pa smo podvrgli analizi SILAC z uporabo masne spektrometrije. Peleti težkih in lahkih celic so bili lizirani v pufru za radioimunoprecipitacijo, dodanem zaviralcem proteaze in fosfataze, z uporabo kratkih 15-sekundnih izbruhov sonikacije. Lizate centrifugiramo pri 14,000 obratih na minuto 20 minuti. Po centrifugiranju smo zbrali supernatante in izmerili koncentracijo beljakovin z analizatorjem aminokislin Hitachi L-8900. Iz vzorcev smo pripravili alikvote po 200 ug beljakovin, jih združili in oborili z metodo obarjanja z metanolom in kloroformom. Proteinske pelete smo resuspendirali v pufru 8 mol/l sečnine/0,4 mol/l amonijevega bikarbonata, reducirali s 45 mmol/l DTT 30 minut pri 37 stopinjah C, alkilirali s 100 mmol/l jodoacetamida 30 minut v temi pri sobni temperaturi. in prebavimo s proteazo Lys-C (1:20 w/w) čez noč (~16 ur) pri 37 stopinjah. Prebavo Lys-C smo nadalje razredčili in razgradili s tripsinom (1:20 w/w) 8 ur pri 37 stopinjah. Prebavo smo razsolili s kolono MacroSpin (The Nest Group, Inc) in posušili v koncentratorju SpeedVac. Razsoljene peptide smo nato obogatili s fosfopeptidi z uporabo smole titanovega dioksida, vdelane v 10 μL konice (Glygen Corp). Pretoki so bili rezervirani, obogateni peptidi pa eluirani z uporabo razmerja 1:33 amonijevega hidroksida proti vodi. S SpeedVac posušene pretočne in elucijske frakcije smo resuspendirali v pufru A (0,1 odstotka mravljične kisline v vodi) in podvrgli analizi s tandemsko masno spektrometrijo s tekočinsko kromatografijo (LC/MS).

2.7| Dvojni luciferazni reporterski test

Človeški promotor SUMO1(NM_001005781) divjega tipa s 1604bp(-1474nt- plus 129nt), vključno s potencialnim veznim mestom (-205nt--199nt), je bil pridobljen s PCR pomnožimo in subkloniramo v osnovni vektor pGL3-(Cat.# E1751 Promega) z mesti restrikcijskih encimov SacI in Bglll, imenovan pGL3-WT-SU. Poleg tega je bilo vezavno mesto -CACCCA- znotraj promotorja SUMO1 mutirano v -CGTTTG-, imenovano pGL3-MT-SU. Plazmid (pReceiver-M94), ki je vseboval cDNA človeške KLF15 polne dolžine, je bil pridobljen iz GeneCopoeia. Plazmid čezmerne ekspresije KLF15 in pGL3-WT-SU ali pGL3-MT-SU smo transfektirali v celice HEK293T z reagentom Lipofectamine 2000. Vzorce smo nato sotransfektirali s plazmidom pRL-TK (Cat #E2241, Promega), ki izraža Renilla luciferazo. Po 24 urah transfekcije so bile celice lizirane. Stopnje aktivnosti luciferaze Firefly in Renilla so bile pregledane z uporabo dvojnega luciferaznega reporterskega testnega sistema (Biotek).

2.8 |Priprava RNA, sinteza cDNA in analiza RT-qPCR

Celotno RNA smo ekstrahirali z uporabo TRlzola (Invitrogen) in očistili z uporabo RNeasy Mini Kit (Qiagen) v skladu z navodili proizvajalca. cDNA je bila ustvarjena z uporabo kompleta za sintezo prve verige cDNA ProtoScript (New England Biolabs. Kvantitativni PCR je bil izveden z uporabo Power SYBR Green Master Mix (Life Technologies). Oligonukleotidna zaporedja, uporabljena za RT-qPCR, so navedena v tabeli 1.

2.9|Test celične proliferacije

Človeško SUMO1 cDNA polne dolžine (NM_003352.8), pridobljeno od OriGene Technologies (Peking, Kitajska), smo vstavili v pCMV6-vstopni plazmid (CAT#: RC200633). Proliferacijo celic smo analizirali s Click-iT⑧ Plus EdU Alexa Fluor⑧555 Imaging Kit (Invitrogen) v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko, celice so bile inkubirane v 6-plošči z vdolbinicami za kulturo in transficirane s kontrolnim plazmidom KLF15 (Scramble, skupina VECTOR), plazmidom prekomerne ekspresije KLF15 (enako zgoraj, skupina KLF15), ekspresijskim vektorjem za SUMO1 (skupina VECTOR), plazmid prekomerne ekspresije SUMO1 (skupina SUMO1), siRNA negativne kontrole (skupina SI CON), siRNA SUMO1 (skupina SI SUMO1), plazmid prekomerne ekspresije KLF15 s siRNA SUMO1 (skupina KLF15 plus SI SUMO1) ali plazmid prekomerne ekspresije KLF15 z negativno kontrolo siRNA (skupina KLF15 plus SICON) za 24 ur. Nato smo medij zamenjali z medijem, dopolnjenim z 20 ng/mL PDGF-BB za 48 ur, in dodali optimizirano koncentracijo EdU 10 μmol/L približno 12 ur pred stimulacijo PDGF-BB. Po obdelavi so bile celice fiksirane s 4-odstotnim formaldehidom, permeabilizirane z 0,5-odstotnim Tritonom X-100, sprane s 3-odstotnim BSA v PBS, inkubirane s Click-iT⑧ reakcijskim koktajlom 30 minut pri sobni temperaturi in inkubirane z DAPIre-action pufer 10 minut pri sobni temperaturi, zaščiten pred svetlobo. Celice smo opazovali s fluorescenčno mikroskopijo (Olympus, Tokio, Japonska). Jedra proliferirajočih celic so bila nato obarvana rdeče.

2.10|Western blot analiza in imunoprecipitacija (IP)

Celice so bile lizirane z uporabo pufra RIPA (Thermo Scientific) in skupni protein v supernatantih je bil kvantificiran z uporabo kompleta za testiranje beljakovin BCA (Thermo Scientific). Western blot analiza in IP sta bili izvedeni, kot je opisano prej. 23.24 Protitelesa proti KLF15 (AV32587, Merk), protitelesa proti SUMO1 (S8070, Merk) in anti- -aktin (A5316, Sigma) so bila uporabljena za Western blot analizo. Za IP analizo smo uporabili protitelesa proti P53 (P5813, Merk).

2.11|Bioinformatska analiza

Kandidati iz ChIP-Seq ali SILAC so pokazali vsaj dvakratno obogatitev v primerjavi s kontrolami. Analiza genske ontologije (GO) je bila izvedena z zbirko podatkov za označevanje, vizualizacijo in integrirano odkrivanje (DAVID; različica 6.7). P-vrednosti so bile prilagojene za večkratno testiranje hipotez z uporabo Benjamini-Hochbergove metode. Znatno obogatene kategorije v funkcijski subontologiji in poteh KEGG s prilagojeno P-vrednostjo<.05 were="" chosen.="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa)="" of="" 52="" intersecting="" genes="" or="" proteins="" between="" chlp-seq="" and="" silac="" was="" performed="" on="" the="" qiagen="" ipa="" platform(https://digitalinsights.qiagen.com/),="" and="" the="" motifs="" in="" the="" target="" genes="" were="" analyzed="" using="" meme="" suite="" 5.3.0.="">

2.12|Statistična analiza

Vsi poskusi so bili izvedeni v treh izvodih, rezultati pa so izraženi kot povprečje ± SE. Vsi podatki so bili analizirani s programsko opremo SPSS (ver.20.0; SPSS Inc) in primerjani s Studentovim t-testom ali enosmerno ANOVA. P-vrednost<.05 was="" considered="" to="" reflect="" statistical="">