Študija kemičnih profilov in metabolitov surove in predelane Cistanche Deserticola pri podganah z UPLC-Q-TOF-MSE

Kontaktni e-poštni naslovtina.xiang@wecistanche.comza več informacij

Povzetek

Ozadje: Predelava kitajske materie medice je prepoznavna in edinstvena farmacevtska tehnika v tradicionalni kitajski medicini (TCM), ki se uporablja za zmanjšanje stranskih učinkov ter povečanje ali celo spreminjanje terapevtske učinkovitosti surovih zelišč. Za večjo učinkovitost zdravilnih rastlin so v prvi vrsti odgovorne spremembe bistvenih sestavin, ki jih povzroči optimiziran postopek predelave. Poživljajoč učinek riževega vina na ledviceCistanche deserticola(C.deserticola) je bila močnejša od surovega C.deserticola (CD).

Metode: Izvedena je bila primerjalna analiza z uporabo UPLC-Q-TOF-MS' z informacijsko platformo UNIFl za določitev vpliva obdelave. Študije in vitro so bile izvedene za karakterizacijo sestavin inmetabolitiin vivo. Kemijske sestavine so bile določene v CD in njegovih predelanih produktih. Multivariatne statistične analize so bile izvedene za ovrednotenje variacij med njimi, medtem ko je bil OPLS-DA uporabljen za primerjavo parov.

Rezultati: Rezultati te študije so pokazali precejšnje razlike v feniletanoidnih glikozidih (PhG) iniridoidipo obdelavi. V ekstraktih CD-ja in njegovih predelanih produktih je bilo odkritih skupno 97 spojin. PhG z 4-O-kafeoilno skupino v 8-O- -D-glukopiranozilnem delu, kot so akteozid, cistanozid C, kampneozid Il, osmantusid, so se po predelavi zmanjšale, medtem ko so se PhG s 6' -O-kafeoilna skupina v 8-O- -D-glukopiranozilnem delu, kot so izoacetozid, izocistanozid C, izokampneozid 1, izomartinozid, se je povečala, zlasti v skupini CD-NP. Povečala se je tudi intenzivnost ehinakozida in cistanozida B, katerih struktura ima 6'-O- -D-glukopiranozilni del. V študiji in vivo so v podganji plazmi, blatu in urinu odkrili 10 prototipnih komponent in 44 metabolitov. Dobljeni rezultati so razkrili, da predelava vodi do znatnih variacij v kemičnih sestavinah CD in vpliva na dispozicijo spojin in vivo, presnovni procesi faze Ⅱ pa so ključne kaskade vsake spojine, večina metabolitov pa je povezana z ehinakozidom oz. akteozid.

Sklepi: To je prva globalna primerjalna raziskava surovega in predelanega CD-ja. Te ugotovitve prispevajo k našemu razumevanju vpliva obdelave CD-jev in dajejo pomembne podatke za prihodnje preiskave učinkovitosti.

Ključne besede: Cistanche deserticola, predelava, UPLC-Q-TOF-MS5, kemijski profili, metaboliti in vivo

Uvod

Obdelava s kitajsko materijo medico (CMM) je pokazala pomembno uporabnost v klinični praksi tradicionalne kitajske medicine (TCM) in že več stoletij velja za učinkovito zdravljenje. To je edinstvena farmacevtska tehnologija, ki izhaja iz teorije TKM. Po obdelavi so bile ugotovljene pomembne razlike v videzu, kemičnih sestavinah, značilnostih in medicinskem pomenu vseh vrst TKM, kar vodi do domneve, da bi lahko predelava izboljšala učinkovitost ali zmanjšala toksične učinke TKM.

Stotine let,Cistanche deserticola(Rou Cong Rong v kitajščini, CD) se običajno uporablja v klinični praksi TKM za dopolnitev funkcij ledvic. Pomaga tudi pri vlaženju črevesja, kar vodi do sproščanja črevesja [1].Cistancheje bil prvič zabeležen v ShenNongBencaoJing. Običajno ga najdemo v sušnih in polsušnih habitatih v Evraziji in Severni Afriki, vključno z Iranom, Kitajsko, Indijo in Mongolijo [2]. Predelava CD-ja je bila izvedena s parjenjem z riževim vinom pod normalnim pritiskom, kar je metoda priprave, dokumentirana v kitajski farmakopeji (Jiucongrong v kitajščini, v nadaljevanju "CD-NP"). In parjenje CD-ja z riževim vinom pod visokim pritiskom je učinkovitejša metoda priprave (v nadaljnjem besedilu "CD-HP") [3, 4]. Več študij je pokazalo, da se farmakološki učinki CD-ja razlikujejo od njegovih predelanih produktov [5]. CD lahko tonizira ledvični jang in sprosti črevesje, medtem ko bi se po kuhanju z riževim vinom okrepil učinek obnavljanja ledvičnega janga. V naši prejšnji študiji je bilo ugotovljeno, da lahko CD-NP poveča tonifikacijo ledvic in podpira jang ter ublaži učinek vlaženja črevesja in iztrebljanja [6–8]. V klinični praksi so predelani izdelki najpogosteje uporabljena oblika.

Do danes je več študij analiziralo kemijske sestavine CD-ja, čemur je sledila izolacija in identifikacija več kot 100 spojin [9–11], kot so feniletanol glikozidi (PhG),iridoidi, lignani in oligosaharidi kot njegove glavne kemične sestavine. Poročali so tudi, da obstaja veliko farmakoloških aktivnosti PhG, vključno z imunomodulatornimi, nevroprotektivnimi, hepatoprotektivnimi, protivnetnimi, antioksidativnimi itd. [12–14]. Iridoidi imajo protivnetno delovanje [15, 16]. Prejšnje študije so tudi pokazale, da so nekatere kemične komponente med predelavo nihale [17–20]. Na podlagi teh poročil se lahko domneva, da naknadna obdelava, spremembe v kemični sestavi vodijo do različnih farmakoloških učinkov, ki jih je treba nadalje raziskati.

V trenutni študiji je bila za primerjalno analizo izvedena občutljiva in učinkovita metoda, tj. tekočinska kromatografija ultra visoke ločljivosti, povezana s TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE), za kvalitativno analizo ekstraktov pa so bile izvedene študije in vitro. CD, CD-NP in CD-HP za pojasnitev njihovih kemijskih profilov. Na splošno so bile eksogene kemikalije z visoko izpostavljenostjo v ciljnih organih obravnavane kot učinkovite komponente. Zato so pri podganah peroralno dajali CD in njegove predelane produkte, čemur je sledila njihova karakterizacija. Obstoječa študija prvič razkriva primerjalno študijo (tako in vitro kot in vivo) surovega in predelanega CD-ja. Dobljeni rezultati bi razširili naše razumevanje učinka obdelave CD-jev, kar bi lahko bilo koristno za nadaljnje študije.

Materiali in metode

Materiali

Standardne spojine ajugola (180120) in 2'-acetil-acetozida (M0601AS) je zagotovil Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Kitajska). Cistanozid F(MUST-17022620), ehinakozid (D1105AS), cistano-stran A(M0906AS) in izoakteozid (M0106AS) je zagotovilo podjetje Must (Sichuan Kitajska); akteozid (O0618AS), salidrozid (J0526AS), katalpol (S0728AS), genipozid (A0407AS) in genipozidno kislino (MB6001-S) so pridobili pri Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, Kitajska).8-epide oksiloganska kislina (B31123) je bila pridobljeno od Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Kitajska. Metanol in acetonitril sta bila razreda MS in sta bila pridobljena pri Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija. Metanojsko kislino (CH, O,) stopnje HPLC je zagotovil Merck KGaA (Darmstadt, Nemčija). Voda, uporabljena v obstoječi študiji, je bila obdelana s sistemom Milli-Q (18,2 MQ, Millipore, Ma, ZDA). Riževo vino je zagotovilo podjetje Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kitajska).

Cistanch deserticola je bil zbran pri Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Vzorce je identificiral prof. Yanjun Zhai (farmacevtska fakulteta, Univerza Liaoning TCM). Vzorci so bili predloženi Univerzi tradicionalne kitajske medicine Liaoning.

Živali

Podganje samce Sprague–Dawley (razred SPF) s 180–220 g skupne telesne teže je zagotovil Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Center za laboratorijske živalske vire province Liaoning, številka licence: SCXK-2015–0001). Te podgane so bile en teden nameščene v sobi za vzrejo z dobro vzdrževano temperaturo in vlažnostjo, tj. 20–26 stopinj, 50–70 odstotkov. Podgane so pred poskusom hranili z običajno laboratorijsko hrano in vodo. Živali so se čez noč postile, vendar jim je bila pred poskusom zagotovljena voda ad libitum. Podgane so usmrtili z 10-odstotnim anestetikom kloralhidrata. Institucionalni odbor za etiko živali provincialne bolnišnice kitajske medicine Liaoning je odobril vse eksperimentalne protokole (2019.3.25, 2019015).

Priprava izvlečka CD, CD‑NP in CD‑HP

CD-NP, CD-HP sta bila obdelana iz iste serije Cistanch deserticola. Za pripravo CD-NP smo suhe kose CD-ja (debeline 5 mm, 100 g) navlažili z riževim vinom (30 ml) in jih 16 ur dušili pri 100 stopinjah, čemur je sledilo sušenje pri 55 stopinjah v sušilni pečici. Medtem ko je bil CD-HP pripravljen z infiltracijo suhih kosov CD-ja (5 mm debeline, 100 g) z riževim vinom (30 ml), čemur je sledilo parjenje pri 1, 25 atmosferskem tlaku 4 ure. in nato sušimo v sušilnici pri 55 stopinjah.

V 100-mililitrski merilni bučki smo en gram praška presejali skozi sito #4, čemur je sledilo dodajanje 50 odstotkov metanola (50 ml) in nato tesno pokrito in premešano. To mešanico smo stehtali, čemur je sledilo pol ure. maceracija. Po maceraciji smo zmes obdelovali z ultrazvokom (moč 250 W, frekvenca 35 kHz) 40 minut, nato smo jo ohladili in ponovno stehtali. Izgubo teže smo nadomestili s 50-odstotnim metanolom, ustrezno premešali in pustili stati, čemur je sledilo filtriranje supernatanta in nato uporaba dobljenega filtrata kot preskusne raztopine.

MSE analiza aktivnih komponent

Priprava standardnih substanc: tubulozid-A (3.02 mg), ehinakozid (300 mg), 2'-acetilakteozid (2,34 mg), akteozid (2,45 mg), izoakteozid (0,61). mg), cistanozid-F (2,14 mg), salidrozid (3,39 mg), genipozid (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), katalpol (2,39 mg), genipozidna kislina (2,56 mg) in 8-epideoksiloganik kislino (2,34 mg) smo dodali v 10 ml volumetrično posodo, dodali stalen volumen metanola v merilu in konfigurirali v ustrezno referenčno raztopino koncentracije. Vsak od 100 μL je bil konfiguriran v mešano referenčno raztopino.

Pogoj MS analize: Masna vrednost Te je bila popravljena pred poskusom in uporabljen je bil način negativnih ionov. Razpon mase je bil 50–1200 Da, vzorec pa je bil vbrizgan s pretočno injekcijsko črpalko. Hitrost stožca je bila 100 L/h, pretok topila je bil nastavljen na 800 L/h. Kapilarna in stožčna napetost sta bili fiksirani na 2500 oziroma 40 V. Temperatura ionskega vira in plina topila je bila 100 stopinj oziroma 400 stopinj, frekvenca pridobivanja signala pa 0,5 S-1.

Analiza UPLC-Q-TOF-MS ekstrakta CD (15–16 min), 65 do 55 odstotkov A (16–18 min). Hitrost pretoka je bila 0.3 mL min−1, medtem ko je bila temperatura prostora za samodejno vzorčenje in kolone 30 stopinj in 8 stopinj ločeno. Volumen injekcije je bil 1,0 μL.

Masno spektrometrično vrednotenje je bilo izvedeno prek Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, ZDA), ki vključuje vir ESI. Hitrost pretoka dušikovega plina je bila fiksirana na 800 L·hrs−1 s temperaturo 400 stopinj, temperatura vira je bila fiksirana na 100 stopinj in stožčasti plin je bil nastavljen na 50 L h−1. Napetost stožca in kapilare je bila ustrezno nastavljena na 40 in 2000 V. Energija trka rampe je bila uporabljena v območju 20–30 V. Te centroidni podatki vseh vzorcev so bili pridobljeni od 50 do 1200 Da, s 5-časom skeniranja 0,5 s v času analize 10 minut . LockSpray TM je bil uporabljen za validacijo natančnosti mase. Te [M–H]− ion levcinskega enkefalina (200 pg·μL−1 hitrost pretoka infuzije 10 μL min−1) pri m/z 554,2615 je bil uporabljen kot zaporna masa. Programska oprema MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, ZDA) je bila uporabljena za natančno maso, sestavo prekurzorskih ionov in izračun fragmentnih ionov.

Analiza podatkov v platformi Masslynx

Poleg tega je bila na podlagi literature vzpostavljena interna knjižnica, ki vsebuje ime spojine, njeno strukturo in molekulsko formulo (v mol.). Vse spojine smo zapisali v posebno predlogo, izdelano v Excelu. Poleg tega so bile datoteke mol (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, ZDA) in datoteke Excel vseh posameznih struktur spojin shranjene tudi na lokalnem računalniku. Vzpostavljen Excelov list s pomembnimi podatki je bil neposredno uvožen v znanstveno knjižnico v UNIFI

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Združeno kraljestvo je bil uporabljen za vrednotenje strukturnih značilnosti, zlasti za značilne fragmente in fragmentacijo MS. Za 2D zaznavanje vrhov je bilo nastavljeno najmanjše območje vrha 500. Med razkrivanjem 3D vrhov je bila izbrana nizka energijska konična intenzivnost več kot 300 štetij in povišana energijska konična intenzivnost več kot 80 štetij. Ugotovljeno je bilo, da je napaka mase do ±10 ppm za znane spojine, toleranca retencijskega časa pa je bila nastavljena v območju ±0,1 min. Izbrali smo negativne adukte, ki vsebujejo -H in HCOOH. Obdelava neobdelanih podatkov, pridobljenih iz MS, je bila izvedena prek poenostavljene programske opreme UNIFI za hitro določitev kemičnih sestavin, ki so ustrezale standardom, z lastno bazo podatkov in interno knjižnico tradicionalne medicine.

Nato smo za preverjanje kemijske strukture vsake ciljne spojine izomere razlikovali po njihovih značilnih vzorcih fragmentacije MS, ki so bili razkriti v poročanih študijah, in s primerjavo retencijskih časov referenčnih standardov.

Metabolomska analiza na podlagi multivariatne statistične analize

Pred obdelavo neobdelanih podatkov so bili nastavljeni parametri, kot so masa v razponu od 150 do 1200 Da, razpon retencijskega časa (0 do 20 min), intenzivnost praga ( 2000 štetij), masna toleranca, tj. 5 MDA, medtem ko sta bila masa in retenzijsko časovno okno 0,20 min oziroma 0,05 Da. Na naslednjem seznamu baze podatkov je bil identifikator ionov pari RT-m/ glede na njihove elucijske čase. Enake vrednosti za RT in m/z v različnih serijah vzorcev so bile obravnavane kot ista spojina.

Izvedena je bila multivariatna statistična analiza za ovrednotenje učinkovitih biomarkerjev, ki so znatno prispevali k razlikam med različnimi skupinami. Med analizo je bila uporabljena analiza glavnih komponent (PCA) za prikaz največjih razlik in prepoznavanje vzorcev za pridobitev pregleda in klasifikacije. OPLS-DA je orodje za modeliranje, ki zagotavlja vizualizacijo napovedne obremenitve komponent OPLS-DA za pomoč pri vrednotenju modela. Spremenljivka pomembnosti za projekcijo (VIP) je bila uporabljena za ocenjevanje vrednotenja različnih komponent inmetabolitiwith VIP values>1.0 in P-vrednost<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Poskusi na živalih podgane so bile naključno razvrščene v štiri skupine (n=6 za vsako skupino), čemur je sledilo peroralno dajanje različnih izvlečkov: (1) Slepa kontrolna skupina: podgane so dobile običajno fiziološko raztopino (2 ml/100 g) ; (2) skupina CD: podgane so dobile ekstrakt CD (2 mL/100 g); (3) skupina CD-NP: podgane so dobile ekstrakt CD-NP (2 ml/100 g); (4) Skupina CD-HP: podgane so dobile ekstrakt CD-HP (2 mL/100 g). Nadaljnja kategorizacija vseh skupin je bila izvedena v tri podskupine za plazmo, urin in blato. Dve uri pozneje so vsaki podgani peroralno dali isto in enako količino izvlečkov.

Po dajanju je bil odvzem vzorcev krvi izveden po 1.0 h, 2.0 h in 4.0 h v hepariniziranih 1,5 ml polietilenskih epruvetah (iz orbitalnih ven) , čemur je sledilo centrifugiranje (pri 4500 rpm) vseh vzorcev 15 minut.

Za vzorce urina in iztrebkov so podgane držali v kletkah za presnovo, nato pa zbiranje vzorcev urina in iztrebkov izvajali 24 ur po dajanju. Centrifugiranje vzorcev urina je potekalo pri 4500 obratih na minuto 15 minut, medtem ko so bili vzorci blata posušeni v senci, zmleti v prah, nato vzeti 0,2 g in dodani v 0,5 ml fiziološke raztopine. raztopino, ultrazvok 5 minut in centrifugiranje pri 12,000 rpm 15 minut. Vse biovzorce smo hranili pri –80 stopinjah do analize.

Priprava bioloških vzorcev. Dodatek vzorcev plazme, urina in blata je bil izveden s 3 volumni metanola, čemur je sledilo vrtinčenje 3 minute. Nato je bilo izvedeno centrifugiranje (pri 12,000 rpm) mešanic 10 minut, čemur je sledil prenos supernatanta v EP epruveto in nato posušen z dušikom pri 37 stopinjah. Poleg tega je bil izveden dodatek 200 μL raztopine HCN-H2O (50 odstotkov). Deset, vrtinec je bil uporabljen za mešanje (1 min), čemur je sledilo centrifugiranje (pri 12,000 vrt/min) 5 minut. Supernatant (5 μL) obdelanih vzorcev smo vbrizgali v sistem UPLC-Q-TOF-MSE.

Pogoji tekočinske kromatografije in masne spektrometrije Analiza zametabolitiizvedel tudi instrument Waters UPLC prek vmesnika ESI. Ločevanja smo izvedli z uporabo Acquity UPLC HSS T3 kolone (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm), mobilna faza je bila 0,1-odstotna mravljinčna kislina (A): acetonitril (B), pogoj gradientne elucije je bil 0-3 min (99,8 odstotka →98 odstotkov A).3-5 min (98 odstotkov →95 odstotkov A),5-8 min (95 odstotkov →90 odstotkov A), { {18}} min (90 odstotkov →85 odstotkov A),12-17 min(85 odstotkov →70 odstotkov A), 17-22 min (70 odstotkov →60 odstotkov A), 22-23 min (60 odstotkov → 58 odstotkov A), 23-25 min (58 odstotkov A), 25-32 min (58 odstotkov → 45 odstotkov A) in 32-37 min (45 odstotkov → 35 odstotkov A ),0,4 mL min-1 je bila hitrost pretoka. Temperatura za kolono in prostor za vzorce je bila nastavljena na 40 stopinj oziroma 8 stopinj. Uporabljeni so bili zgoraj navedeni pogoji masne spektrometrije.

Strategija za sistematično analizo metabolitov v bioloških vzorcih Za obdelavo podatkov je bila uporabljena programska oprema UNIFI (1.8.2). Za identifikacijo učinkovitih metabolitov je bila uporabljena funkcija Binary Compare. Ocenjeni metaboliti niso obstajali v enakovrednem kontrolnem vzorcu ali obstajajo pri nizki intenzivnosti ionov. Prag relativne intenzivnosti je bil nastavljen na 3 ali 5 in metabolite, ki so izpolnjevali podčrtana merila, je bilo mogoče oceniti. Pogosti in predvidljivi metaboliti so bili nato določeni z EIC. Za iskanje dvofaznih metabolitov je bila uporabljena funkcija NLF. Na primer, v programski opremi UNIFI bi lahko parametre nastavili na 176,0321 za iskanje možnih konjugatov glukuronske kisline. Po obdelavi je mogoče v metodi nastaviti ali identificirati nevtralno izgubo. MassFragment je bil uporabljen za določanje ali karakterizacijo zaznanih struktur metabolitov, funkcija spektralne interpretacije UNIFI je glavna funkcija, ki se uporablja za analizo sekundarne fragmentacije matičnih komponent. To funkcijo lahko uporabite za hitro preverjanje, ali je pot fragmentacije smiselna.

Rezultati

Pravilo množične fragmentacije feniletanoidnih glikozidov in iridoidov

Feniletanoidni glikozidi so glavne kemične sestavine CD. Standardne raztopine izoakteozida,

vzeti so bili cistanozid F, tubulozid A, ehinakozid, akteozid in 2'-acetil-akteozid, čemur je sledila zagotovitev drugačne ravni energije trkov (tabela 1), nato pa so bili pridobljeni ustrezni zemljevidi MS2 (slika 1).

Masna spektrometrična analiza je pokazala, da imajo feniletanoidni glikozidi podobne vzorce fragmentacije masnega spektra, poti cepitve v načinu negativnih ionov vključujejo predvsem (1) cepitev estrske vezi: izguba nevtralne kafeoilne skupine (C, H, O162.03) in nevtralne acetilne skupine. skupina (C, H, O, 42.00); (2) Glikozidna cepitev: izguba nevtralnih ostankov ramnoze (C.HIO, 146,05) in nevtralnega ostanka glukoze (CgHO, 162,05). Iz masne spektrometrije visoke ločljivosti je mogoče ločiti kofeoil (162.03) in ostanek glukoze (162.05).

Vzeli so standardne raztopine iridoidov ajugola, katalpola, genipozidne kisline, genipozida in 8-epide oksiloganske kisline, čemur je sledilo zagotavljanje različnih energij trkov in pridobljeni so bili ustrezni zemljevidi MS (slika 2).

Iridoidni glikozidi imajo podobne vzorce fragmentacije masnega spektra, poti cepitve v načinu negativnih ionov večinoma vključujejo (1) Glikozidno cepitev: Izguba nevtralnega ostanka glukoze (CHoO, 162,05); (2) Izguba nevtralnega CO (43,99) in H , O(18,01).

Identifikacija spojin v ekstraktih CD, CD-NP in CD-HP

Analiza UPLC-QTOF-MSE

Izvedena je bila optimizacija kromatografskih pogojev. Nato so bile spojine CistancheHerba ovrednotene v načinu negativnih in pozitivnih ionov z visokimi in nizkimi CE. Dobljeni rezultati so pokazali, da je bila združljivost negativnega načina višja glede na pozitivni način za te spojine. Slika 3 prikazuje kromatogram MS z osnovnimi vrhovi ionov (BPI), označen z oštevilčenimi vrhovi. Intenzivnost vsakega zaznanega iona v analizi UPLC-Q-TOF-MS je bila normalizirana glede na celotno število ionov za generiranje podatkovne matrike, ki je sestavljena iz vrednosti m/z, normalizirane površine vrha in retencijskega časa.

Ocenjevanje komponent iz CD-ja in njegovih predelanih produktov na platformi UNIFl

Skupaj 97 spojin je bilo identificiranih z načinom -SEM (n=6) iz CD in njegovega predelanega produkta (tabela 2), vključno s feniletanoidnimi glikozidi (PhG), iridoidi, lignani in oligosaharidi. Komponente 95, 91 in 94 so bile ustrezno odkrite v CD, CD-NP in CD-HP. Med njimi je bilo 64 feniletanoidov, 13 iridoidov in 20 drugih vrst spojin. Kemična sestava CD-ja in njegovega predelanega proizvoda je bila podobna, vendar je bilo ugotovljeno, da se količina komponent med CD-jem in njegovim predelanim proizvodom razlikuje.

Variacije kemijskih sestavin predelanih izdelkov Za analizo multivariatne podatkovne matrike je bila uporabljena programska oprema Simca-P 13.0. Pred PCA so bile vse spremenljivke centrirane na srednjo vrednost in skalirane po Pareto lestvici, čemur je sledila identifikacija potencialnih diskriminantnih spremenljivk. V grafu rezultatov PCA je vsaka točka pokazala posamezen vzorec. Vzorci, ki so pokazali podobnost v svojih kemičnih sestavinah, so bili raztreseni drug poleg drugega, medtem ko so bili tisti, ki so pokazali razlike v svojih komponentah, razdeljeni. Kot je razvidno iz PCA (slika 4), je bila skupina CD-HP ločena od skupin CD in CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 in P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Na sliki 8 smo ugotovili intenzivnost akteozida (54), cistanozida C (74), kampneozida I (43), osmantusida (75) in 2'-aktilakteozida (80), ki imajo 4'-O-kafeoilno skupino v 8-O- -D-glukopiranozilni del (glej sliko 9) se je zmanjšal po predelavi z riževim vinom, medtem ko je intenzivnost izoacetozida (60) kastanozid (71), izo-kampneozid I (69), izomartinozida (86), ki ima 6'-O-kafeoilno skupino (glej sliko 9), povečano, zlasti za skupino CD-NP. Čeprav ima tubulozid B (72) 6'-O-kafeoilno skupino, enako kot izoakteozid, se je intenzivnost zmanjšala zaradi njegove 2'-acetilne skupine. Povečala se je intenzivnost ehinakozida (38) in cistanozida B, ki imata skupine 6'-O- -D-glukopiranozilnih delov, vendar se je intenzivnost tubulozida A (55) zmanjšala tudi zaradi njegove 2'-acetilne skupine.

Naša raziskovalna skupina je preučevala tudi toplotno stabilnost akteozida in izoakteozida in ugotovila, da je akteozid nestabilen v vodi, metanolu in raztopini rumenega riževega vina in ga je mogoče delno pretvoriti v izoakteozid pod pogoji segrevanja. Vendar je bila termostabilnost izoakteozida boljša, zlasti v raztopini rumenega riževega vina. Slika 10 prikazuje možne spremembe PhG v CD med obdelavo:

Identifikacija presnovkov pri podganah Iz podatkov masne spektrometrije visoke ločljivosti so analizirali in primerjali natančno molekulsko maso in elementarno sestavo za presnovke in protomolekulske spojine. Ker so iste vrste spojin v TCM pokazale podobnost v presnovnih spremembah, se lahko korelacije fitokemičnih sestavin in vitro razširijo na njihove metabolite in vivo. Medtem so na podlagi običajnih poti biotransformacije sklepali o razumni spremembi molekulske mase. Nazadnje so bili presnovki identificirani z analizo MSE masnih spektrov presnovkov in poti fragmentacije proto-spojin v masnem spektru [21, 22]. V primerjavi s slepim vzorcem so bile njegove komponente identificirane in vivo na podlagi informacij, ki jih je zagotovil kromatogramski masni spekter, možnost presnovne reakcije, značilnosti strukture spojine in pravila fragmentacije njenega masnega spektra. Glej tabelo 3.

Identifikacija metabolitov, povezanih s feniletanol glikozidi

Za obdelavo je bila uporabljena platforma UNIFI. Slika 11 prikazuje TIC kromatograf urina, blata in plazme za CD in njegove predelane produkte. V primerjavi s slepimi vzorci je bilo pri podganah identificiranih skupno 54 metabolitov, vključno z 10 prototipnimi komponentami in 44 metaboliti, od katerih jih je bilo 24, 49 in 6 v blatu, urinu in plazmi.

Na podlagi natančne mase, kaskade fragmentacije in predvidljivih nevtralnih izgub z biotransformacijo je bilo okvirno ovrednotenih skupno 35 metabolitov, povezanih s feniletanoidnimi glikozidi. Sorodni presnovki feniletanoidnih glikozidov imajo podobne vzorce fragmentacije masnega spektra, kot tipičen dekafeoilni fragment m/z 461.1605, ki se nato nadalje hidrolizira z glikozidnimi in estrskimi vezmi in vivo ter presnovi v hidroksitirozol (HT)(m/ z153,0504, C.HO.4,73 min) in kofeinske kisline (CA) (m/z179,0389, CH, 0,77 min), glej sliko 12A.

M11 označen [MH]~ pri m/ 153,0504 s formulo ie, C.HO, in identificiran kot HT. M16 je predstavljal [MH]- pri m/z 329,0851, kar je bilo za 176 Da povišano kot pri HT, kar je razkrilo, da je morda glukuronidirani metabolit HT. [MH]- za M26 je bil pri m/z 343,1037,14 Da višji kot pri HT-glukuronidu. Zato je bil M26 identificiran kot HT-metiliran glukuronid. M17 je bil identificiran kot HT-sulfat na podlagi njegovega [MH]- pri m/z 233,0112,80 Da nad HT, ki bi ga bilo mogoče nadalje metilirati, nato pa je proizvedel M22, ki je pokazal m/z 247,0278, kar kaže, da je HT- metilirani sulfatirani metabolit. M7 (m/167,0335) in M5 (m/z 167,0762) sta bila obravnavana kot produkt oksidacije oziroma metiliran HT (slika 12B).

M1 je pokazal [MH]- pri m/z 179,0389, razjasnjena molekulska formula je bila CH-O in identificirana kot kofeinska kislina (CA). M25 je pokazal [MH]- pri m/355,0704, ki je bil za 176 Da povišan kot pri CA, kaže da bi lahko bil glukuronidirani metabolit CA. M27 je imel m/z 258,994, kar je bilo 80 Da višje od vrednosti CA, zato smo ga razjasnili kot CA sulfat in lahko proizvede M35 (m/z 273,0064). Ker M4 daje [MH]7 pri m/z 193,0524,14 Da višje od CA, je bil identificiran kot metilirani metabolit CA. M39 je bil metabolit dehidroksilacije CA z m/z 163,04 in ga je bilo mogoče sulfatirati v M32 (m/z 242,9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO,9,06 min) je bil redukcijski produkt CA, to je 3,4-dihidroksi-benzenpropionske kisline, ki se lahko metilira v M19 (m /z 195,0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 se lahko dehidrira v M43, to je 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min), in M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) in M29 (m/z 245,0125, C9H10O6S, 8,52 min) so bili glukuronidirani in sulfatirani produkti (slika 12C).

Za metabolite, povezane s feniletanoidnimi glikozidi, so bile ključne presnovne kaskade presnovne reakcije faze II, tj. glukuronidacija, metilacija in sulfatacija. Predlagane presnovne kaskade feniletanoidov so prikazane na sliki 13.

Identifikacija metabolitov, povezanih z iridoidi

Z analizo elementarne sestave metabolitov, fragmentacije MSE in povezane literature je bilo okvirno ovrednotenih skupno 19 metabolitov, povezanih z iridoidom. Iridoidni glikozidi so bili hidrolizirani z glikozidnimi vezmi, da so nastali njihovi ustrezni aglikoni. M/z 185,117 je bil za M8, 162 Da manj kot ajugol, ki je nastal zaradi izgube ostanka glukoze.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) je bil deglikoziliran produkt katalpola. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) je bil manjši od 30 Da deglikoziliranega metabolita katalpola in je bil identificiran kot odstranitev molekule metabolita CH, O. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), je bila nadaljnja izguba metabolita H, O.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) je bil deglikoziliran presnovek genipozida, M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) pa deglikozilacija 8-epideoksiloganske kisline. Presnovne reakcije za iridoide bi lahko razkrili kot metabolizem faze I deglikozilacije (slika 12D).

Primerjava presnovnega profiliranja v plazmi, urinu in blatu med CD in njegovimi predelanimi produkti

Primerjali smo 2 prototipa v plazmi, 7 v urinu in 3 v blatu. V CD je bilo 7 prototipov, 7 prototipov v CD-NP in 8 prototipov v CD-HP. M21 je bil odkrit samo v fecesni skupini CD-NP, M38 in M51 pa samo v urinskih skupinah CD-HP. V primerjavi s presnovki je bilo enakih presnovkov v plazmi, urinu in blatu 4, 42 oziroma 21. V skupini CD je bilo absorbiranih 34 presnovkov, 39 v CD-NP in 40 v skupini CD-HP. M5, M7, M40 in M52 so bili odkriti samo v skupinah CD-NP, medtem ko so bili M24, M4l in M48 odkriti samo v skupinah CD-HP.

Opazili so razlike v absorpciji in presnovi aktivnih spojin v različnih predelanih produktih CD. Na sliki 14 smo ugotovili, da je bila intenzivnost HT-sulfatne konjugacije (M17) najvišja v urinu, sledi 3-HPP sulfatna konjugacija (M29), metilirana HT sulfatna konjugacija (M22), dehidroksiliran CA sulfat konjugacija (M32) in 3,4-dihidroksi benzen propionska kislina sulfatna konjugacija (M19). Vsebnost presnovnih produktov v predelani skupini je bila višja kot v skupini CD, predvsem pri M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Njihova prekurzorska 6'-O-kafeoilna skupina v 8-O- -D-glukopiranozilnem delu, spojine, kot je hidroksitirozol, imajo protitumorske, protivnetne, antibakterijske, protivirusne in protiglivične lastnosti [ 23]. Kofeinska kislina ima protivnetno, protirakavo in protivirusno delovanje [24]. Bilo je skladno s klinično uporabo CD-ja in njegovih predelanih izdelkov.

Diskusija

CD je TCM in njegove glavne bioaktivne sestavine, vključno s PhG, iridoidi in polisaharidi, so bile dokumentirane z različnimi raziskovalnimi študijami. V klinični praksi TKM se predelani produkti CD pogosto uporabljajo v primerjavi s surovimi. Kemična sestava se bo med predelavo spremenila, kar lahko povzroči spremembe v zdravilnih učinkih (slika 14).

PhG so vrsta fenolne spojine, za katero je značilna -glukopiranozidna struktura, ki nosi hidroksi-feniletilni del kot aglikon. Te spojine pogosto vsebujejo kofeinsko kislino in ramnozo, pritrjeno na glukozni ostanek preko estrske oziroma glikozidne vezi. V trenutni študiji so kvalitativne analize CD, CD-NP. in CD-HP ter skupno identificiranih 97 spojin, vključno s feniletanoidnimi glikozidi (PhG), iridoidi itd. Dobljeni rezultati so pokazali razlike v kemični sestavi pred in po obdelavi. Intenzivnost PhG s 4'-O-kafeoilno skupino v 8-O- -D-glukopiranozilnem delu, kot so akteozid, cistanozid C, kampneozid II, osmantusova stran, se je po obdelavi zmanjšala, medtem ko so PhG z

kot so izoacetozid, izocistanozid, izokampneozid I, izomartinozid, povečan, zlasti v skupini CD-NP. Povečala se je tudi intenzivnost ehinakozida in cistanozida B, katerih struktura ima 6'-O- -D-glukopiranozilni del. PhG z 2'-acetilno skupino se je pogosto zmanjšal zaradi reakcije hidrolize med postopkom, kot je tubulozid B, 2-acetilakteozid.

Preiskava metabolitov, absorbiranih in vivo, je bila izvedena po peroralnem dajanju CD-ja in njegovih predelanih produktov. Presnovni procesi faze II so bili ključni kaskadi in večina presnovkov je bilo sulfatnih, glukuronidnih in metiliranih konjugatov. Feniletanolni glikozidi imajo nizko peroralno absorpcijo in izkoristek. Težko se absorbirajo v kri in delujejo kot predniki, ki igrajo svojo vlogo po presnovni aktivaciji in vivo. Feniletanoidi, proizvedeni v feniletanolaglikon, kot sta hidroksitirozol (HT) in kofeinska kislina (CA) ter njen derivat 3-hidroksifenilpropionska kislina (3-HPP), se lahko ti presnovki lažje absorbirajo v plazmo in imajo boljši zdravilni učinek.

CD in njegovi predelani izdelki. HT-sulfatna konjugacija (M17) ima največjo intenzivnost v urinu, sledi 3-HPP sulfatna konjugacija (M29), metilirana HT sulfatna konjugacija (M22), dehidroksilirana CA sulfatna konjugacija (M32) in 3,{{ 7}}dihidroksi benzenpropionska kislina sulfatna konjugacija (M19). Vsebnost presnovnih produktov v predelani skupini je bila višja kot v skupini CD, predvsem pri M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Na splošno so lahko učinkovite komponente, ki imajo visoko izpostavljenost v ciljnih organih. Zadostna količina feniletanoidov in njihovih derivatov je bila ocenjena in določena in vitro. Akteozid je značilna spojina, katere vsebnost se je po predelavi z riževim vinom zmanjšala, vsebnost izoakteozida, izocistanozida C, izokampneozida I pa se je ustrezno povečala. Razgradne produkte PhG, kot so derivati ​​CA in HT, je mogoče ovrednotiti v bioloških vzorcih, predelava riževega vina pa lahko poveča absorpcijo metabolitov in vivo.

Zaključek

V tej študiji je bilo odkritih 97 spojin v izvlečkih CD in njegovih predelanih produktih. Pri povišani temperaturi je prišlo do razgradnje nekaterih glikozidov in posledično so bili sintetizirani nekateri novi izomeri in kompleksi. V študiji in vivo so prototipne komponente (10) in presnovke (44) določili ali okvirno ovrednotili v podganji plazmi, blatu in urinu. Presnovni procesi faze II so bili ključni kaskadi, večina metabolitov je bila povezana z ehinakozidom ali akteozidom, kot sta HT, CA in njuni derivati ​​3-hidroksifenilpropionska kislina 3-HPP. Ti metaboliti se lahko lažje absorbirajo v plazmo in imajo boljši zdravilni učinek. Dobljeni rezultati so pokazali, da je kemijska sestava CD različna in vpliva na dispozicijo spojine in vitro in in vivo.

Okrajšave

PhG: feniletanoidni glikozidi; CD: Cistanche deserticola; CMM: kitajska Materia Medica; TKM: tradicionalna kitajska medicina; CD-NP: Gistanche deserticola Predelano s parjenjem z riževim vinom pod normalnim pritiskom; CD-HP: Cistanche deserticola Predelano s parjenjem z riževim vinom pod visokim pritiskom; UPLC-Q-TOF-MS: Tekočinska kromatografija ultra visoke ločljivosti skupaj s TOF-MS; PCA: analiza glavnih komponent; VIP: spremenljiv pomen za projekcijo; CA: kofeinska kislina; HA: hidroksitirozol.

Zahvala

Se ne uporablja.

Prispevki avtorjev

Pri pisanju, pisanju rokopisa so sodelovali LZ, LBN, SJ. RJ, LPP je pomagal pri poskusih na živalih ter pripravil in dokončal vse slike in tabele. ZC, HY. ITZ je pomagal pri oblikovanju in izvedbi te študije ter pregledal rokopis. Vsi avtorji so prebrali in odobrili končni rokopis.

financiranje

To delo sta podprli Nacionalna naravoslovna fundacija Kitajske (št. donacije: 81874345) in Fundacija za naravoslovje province Liaoning (št. donacije: 2020-MS-223).

Dostopnost podatkov in materialov

Nabori podatkov, uporabljeni in/ali analizirani med trenutno študijo, so na razumno zahtevo na voljo pri ustreznem avtorju.

Izjave

Etična odobritev in soglasje za sodelovanje

Etično odobritev za uporabo poskusnih živali za to študijo je pridobil Odbor za medicinsko etiko Univerze tradicionalne kitajske medicine Liaoning (številka odobritve: 2018YS(DW)-044-01). Vsi poskusni postopki v tej študiji so bili v skladu z etičnimi standardi Odbor za medicinsko etiko Univerze tradicionalne kitajske medicine Liaoning.

Soglasje za objavo

Se ne uporablja.

Konkurenčni interesi

Avtorji izjavljajo, da nimajo navzkrižja interesov, ki bi ga morali razkriti.

Podrobnosti avtorja

'Farmacevtski oddelek, Univerza tradicionalne kitajske medicine Liaoning, Dalian, Liaoning, Kitajska.' Inštitut za raziskave zdravil skupine Monos, Ulaanbaatar 14250, Mongolija.

Prejeto: 31. maj 2021 Sprejeto: 17. september 2021 Objavljeno na spletu: 28. september 2021

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1*, Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 in Tianzhu Jia1

Reference

1. Komisija za kitajsko farmakopejo. Farmakopeja Ljudske republike Kitajske, vol. I. Peking: China Medical Science Press; 2020. str. 140.
2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): eno najboljših farmacevtskih daril tradicionalne kitajske medicine. Front Pharmacol. 2016; 7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Učinki različnih načinov predelave sušenja sveže Cistanche deserticola na vsebnost njegovih sestavin. J Chin Med Mater. 2020; 10: 2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimizacija postopka parjenja pod visokim pritiskom za Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019; 11: 2576–80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Učinki Cistanches herba pred in po obdelavi na funkcijo proti staranju in imunsko funkcijo starajočih se podgan, ki jih povzroča D-galaktoza. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11: 2882–2885.
6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Študija odvajalnih sestavin v Cistanche deserticola YMCA. Modern Chin Med. 2015; 17 (4): 307–10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Študija o nevroendokrino-imunski funkciji Cistanche deserticola in njenih produktov kuhanja riževega vina v modelu podgan, ki ga povzroča glukokortikoid. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Izboljšanje poživitvene funkcije ledvic v modelu miši z rastlino Cistanches herba, hitro posušeno pri srednje visoki temperaturi. J Med Hrana. 2019; 22 (12): 1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, "Puščavski ginseng": pregled. Am J Chin Med. 2012; 40 (6): 1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: Pregled njegove kemije, farmakologije in farmakokinetične lastnosti. J Ethnopharmacol col. 2018; 219: 233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): pregled njegove fitokemije in farmakologije. Chem Pharm Bull. 2020; 68 (8): 694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Nevroprotektivni učinki ehinakozida v mišjem MPTP modelu Parkinsonove bolezni. Eur J Pharmacol. 2007; 564: 66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Zaščitni učinek tubulozida B na apoptozo, ki jo povzroča TNF alfa v nevronskih celicah. Acta Pharmacol Sin. 2004; 25 (10): 1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Protivnetni iridoidi iz stebel Cistanche deserticola, gojenih v puščavi Tarim. Chin J Nat Med. 2016; 14 (1): 61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Feniletanoidni glikozidi s protivnetnimi aktivnostmi iz stebel Cistanche deserticola, gojenih v puščavi Tarim. Fitoterapija. 2013; 89: 167–74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoidni in aciklični monoterpenski glikozidi, kankanozidi L, M, N, O in P iz Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull. 2010; 58 (10): 1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. Nova strategija za hitro raziskovanje potencialnih kemičnih markerjev za razlikovanje med surovim in predelanim Radix Rehmanniae z UHPLC-TOF-MS z multivariatno statistično analizo. J Pharm Biomed Anal. 2010; 51 (4): 812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Spremembe ravni feniletanoidnih glikozidov, antioksidativne aktivnosti in drugih kakovostnih lastnosti v rezinah Cistanche deserticola s parno obdelavo. Chem Pharm Bull. 2016; 64: 1024–30.
19. Ma ZG, Tan YX. Spremembe vsebine šestih feniletanoidnih glikozidov med kuhanjem na pari z vinom v Desertliving Cistanche. Chin Trad Pat ent Med. 2011;33(11):1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Vpliv postopka parjenja na kakovost po žetvi cistanche deserticola za medicinsko uporabo med sušenjem na soncu. Biol Pharm Bull. 2016; 39 (12): 2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metaboliti prehranskega akteozida: profili, izolacija, identifikacija in hepatoprotektivne zmogljivosti. J Agric Food Chem. 2018; 66 (11): 2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Sistematična karakterizacija presnovkov ehinakozida in akteozida iz Cistanche tubulosa v podganji plazmi, žolču, urinu in blatu na podlagi UPLC-ESI-Q-TOF -GOSPA. Biomed Chromatogr. 2016; 30 (9): 1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroxytyrosol: naravna spojina z obetajočimi farmakološkimi aktivnostmi. J Biotechnol. 2020; 309: 29–33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Kafeinska kislina, vsestranski farmakofor: pregled. Mini Rev Med Chem. 2011; 11 (8): 695–713.

Opomba založnika

Springer Nature ostaja nevtralen glede trditev o pristojnosti v objavljenih zemljevidih ​​in institucionalnih povezavah.