Krizogenamid A iz endofitične glive povezane s Cistanche Deserticola in njegov nevroprotektivni učinek na SH-SY5Y celice

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Uvod

Cistanche deserticola(Y. C. Ma) je parazitska rastlina na severozahodu Kitajske. Stebelo te rastline je pomembno tradicionalno kitajsko zdravilo in se uporablja za zdravljenje ledvične pomanjkljivosti in nevrastenenije ("Kitajski slovar medicine", 1977). Feniltanoidni glikozidi izCistanchedeserticolaporočali, da imajo dejavnosti pri preprečevanju in zdravljenju bolezni lobanjskih živcev in preprečevanju prostih radikalov [1, 2]. Na podlagi dejstva, da endofitične glive lahko proizvajajo nove zdravilne sestavine in iste/podobne kot tiste iz gostiteljskih rastlin, iskanje novih aktivnih spojin iz endofitičnih gliv pomembnih zdravilnih rastlin kaže vrednost za razvoj novih zdravilnih virov. V času našega iskanja novih nevroprotektivnih spojin iz endofitičnih gliv izCistanchedeserticolazbranih iz Notranje Mongolije na severozahodu Kitajske, so bili pregledani trije aktivni sevi s pomočjo celic SH-SY5Y. Med njimi je kulturna juha gliv št. Študije o aktivnih sestavinah tega seva so privedle do izolacije krizogenamida A (1) (slika 1) v postopku bioaseje vodene izolacije. Poleg tega so bile štiri znane spojine izolirane in opredeljene kot obtok v G (2) [3], 2-[(2-hidroksipropilonil) amino] benzamid (3) [4], 2-,3-dihidrosorbicillin (4) [5] i (9Z,12Z)-2,3-dihidroksipropil oktadeka-9,12-dienoat (5) [6], u skladu s njihovim spektroskopskih podatkima s literaturnim podatke. Tukaj poročamo o izoločitvi, identifikaciji in nevroprotektivnem učinku krizogenamida A.

Cistanche deserticola

Materiali in metode

Glivični material Vzorec Penicillium chrysogenum no. 005 je bil izoliran iz korena C. deserticola, zbranega iz Notranje Mongolije na severozahodu Kitajske. Na krompirjevem dekstroznem agarju je bil makroskopski videz širjenja, gladkih, žametnih, modro-zelenih kolonij, včasih zaraščanih s svetlobno hifajo; površina kolonij je pogosto pokazala številne svetlo rumene kapljice; rumene barve. GenBank iskanje z ribosomsko DNK zaporedje 18S 005 (1676 jekleotidov; Številka pristopa banke Gen-Bank EU203859) je bila izvedena. Rezultati kažejo na vrsto Penicillium chrysogenum kot najbližje ujemanje. Na podlagi makroskopskega videza in 18S rDNA genskega zaporedja, no.005 je sev Penicillium chrysogenum.

Fermentacija in ekstrakcija

Gliva se je gojila v statičnih pogojih pri 24 °C 30 dni v 35 1000-ml koničnih flflasks, ki vsebujejo tekoči medij (300 ml/flflask), sestavljen iz glukoze (10 g/liter), maltoze (20 g/liter), mannitola (20 g/liter), Mononatrijev glutamat (10 g/litar), KH2PO4 (0,5 g/litar), MgSO4·7H2O (0,3 g/litar), koruzni strmi liker (1,0 g/litar) i ekstrakt kvasca (3,0 g/litar) i morska voda, po prilagoditvi pH na 7,0. Fermentirana celotna solata (10,5 litra) je bila trikrat ekstrahirana z EtOAc, da bi dal EtOAc soln, ki je bil koncentriran pod zmanjšanim pritiskom, da bi surov izvleček (9,5 g).

Čiščenje

Surovi izvleček (9,5 g) je bil ločen na 15 frakcij na koloni silicijevega gela s korakom gradientnega izvlečka zemeljskih etra/Me2CO. Ulomek 2, izvlečen z 8 : 2 zemeljski eter/Me2CO, je bil rekustaliziran iz meOH, ki je 3 kot brezbarvno iglo (8,0 mg). Ulomek 3 (19,0 mg), izvlečen s 7 : 3 zemeljski eter/Me2CO, je bil nadalje ločen z obratnim stolpcem (RP18, 4060 mm, Merck; MeOH - H2O3:2→4:1→MeOH) si lahko privoščite fr. 37 (8,0 mg), ki ga je prečiščen z obsežno PHPLC (60% MeOH, ki vsebuje 0,1% TFA, 4,0 ml/minuto), da se da 4 (2,0 mg). Ulomek 4 (26,0 mg), izvlečen s 6 : 4 zemeljski eter/Me2CO, je bil nadalje ločen z obratnim stolpcem (RP18, 4060 mm, Merck; MeOH - H2O3:2→4:1→MeOH) si privoščiti fr. 4-3 (5,4 mg) in fr. 4-9 (7,6 mg). Nato je bil fr. 4-3 ločen z obsežnim PHPLC [YMC-pack ODS (A), 10250 mm, 5 mm, 4,0 ml/minutu] (60% MeOH, 4,0 ml/minutu) do prinosa 2 (1,0 mg), a fr. 4-9 je bila razdvojena obimnim PHPLC (80% MeOH, 4,0 ml/minutu) za prinos 1 (4,0 mg) i 5 (2,6 mg). 1: pridobljena kot bledo rumena trdna; [a] D 25 24,5° (c 0,155, MeOH); UV (MeOH) l max 208, 251 nm; CD (MeOH) (glej sl. 4); IR (KBr) n max 3433, 3200, 3076, 2928, 2862, 1677, 1440, 1370, 1324, 1188, 1029 cm1 ; 1 H- in 13C-NMR (glej preglednico 1); HRESI-MS m/z 448.2951 [MH] (izračunano za C28H38N3O2, 448.2964)

DPPH radikalni učinek za scavenging

40 ml DPPH (1,1- difenil-2-pikrilhirazil) je bil dodan meOH soln (160 ml) z razli čno koncentracijo vzorca (1,0 mg/ml0.0001 mg/ml); Sigma) MeOH soln (1,5 104 M). Po nežnem mešanju in odhodu 30 minut pri sobni temperaturi je bila optična gostota izmerjena pri 520 nm z uporabo spektrohotometra. Antioksidacialna aktivnost vsakega vzorca je bila izražena v smislu IC50 (mg/ml ali mM, potrebna za zaviranje radikalne tvorbe DPPH za 50 %) in izračunana iz krivule zaviranja log-odmerka.

neuroprotective of cistanche deserticola

nevroprotektivna cistanche deserticola

Celična kultura in zdravljenje drog

Človeške nevroblastoma SH-SY5Y celice so bile kultivirane v DMEM mediju in vzdrževane pri 37 °C v vlažnem ozračju s 5,0% CO2. Te celične suspenzije (180 ml) v gostoti 5*104 celic ml-1 so bile prevlečene v 96- dobro mikrotiterske plošče in inkubirani 24 ur ob zgornjem stanju. Raztopina chrysogenamide A (2,0 ml v DMSO) pri različnih koncentracijah je bila dodana vsakemu dobro, razen kontrolnim in modelnim skupinam in še 1 uro inkubirana v enakih pogojih. H2O2 (Sigma Chemical Co., MO, ZDA) je bil dodan za inducacijo apoptoze v celicah SH-SY5Y pri končni koncentraciji 200 mM 24 ur. Sposobnost preživetja celic je bila določena z MTT-om. MTT, raztopljen v fosfat-buffered raztopina, je bila dodana na koncu inkubacijske končna koncentracija 5,0 mg/ml (PBS), nato pa inkubirana pri 37 °C 4 ure. Če zavržete supernatant, je bil produkt formazana raztopen.

Rezultati in razprava

1 je bila pridobljena kot bledo rumena trdna. Molekulsko formulo je kot C28H37N3O2 določil HRESI-MS (opažen [MH] pri m/z 448.2951, imenovan [MH] C28H38N3O2, 448.2964). IR spekter je predlagal prisotnost NH (3433 in 3200 cm1 ) in karbonilnih skupin (1677 cm-1 ). Spekter 1 H-NMR (tabela 1), zabeležen v DMSO-d6, je pokazal tri metilne skupine (d H 0,62, 0,87, 0,98) in dva signala zamenljivega protona (d H 10,36 in 8,29). Poleg tega so trije ortosi skupaj z aromatičnimi signali (d H 6,90 dd, J 7.3, 7,3 Hz, 6,94 d, J7.3 Hz in 7,18 J 7,3 Hz) kazali na 1,2,3-trisubstituirano benzensko obročko. Metilenska protona (d H 3,23) skupaj z olefinskim protonom (d H 5,27), skupaj z dvema vinilnim metiloma (d H 1,67 in 1,70), sta navedla prisotnost 3-metil-2-butenil skupine v 1. Enovezne vezi teh protonov in še 14 methin in ali metilenov protonov so bile ugotovljene s HMQC eksperimentom. Spektra 13C-NMR in DEPT (tabela 1), ki sta razkrivala 28 signalov, sta potrdila tudi prisotnost teh dveh fragmentov [trisubstituirano benzensko obročko (dC 123,6 CH, 120,8 CH, 127,7 CH, 122,1 QC i 140,4 QC) i 3-metil-2-butenil (dC 28 CH2, 121,9 CH, 132,3 QC, 25,5 CH3, i 17,7 CH3)]; poleg tega dva karbonila (dC 183.1 in 172.3), štiri karbonske ogljikove sp3 (dC 46.5, Opaženo je i 58,7, 60,4 i 62,3), dva sp3 metina (dC 46.1 i 58.7), te šest sp3 metilena (dC 20,7, 31,8, 34.3, 35.2, 39.9 i 64.9). Ker je bilo obračunanih 6 od 12 nesavrednosti, se je ugotovilo, da 1 vsebuje šest obročov. Nadaljnja ocena teh spektralnih podatkov je skupaj z rezultati 1 H-1 H COSY in HMBC pokazala, da je 1 tesno povezan z marcfortinovo skupino glivičnih presnovkov [7]. Razlaga korelacije HMBC (slika 2) je nakazala prisotnost delne strukture A (KORELACIJE HMBC 1-NH do C-8 in C-9; H-6 do C-26; H-5 do C-7 in C-9; H-26 do C-28 in C-8 in H-27 do C-29 in C-30) in B (HMBC korelacije H-10 do C-3, C-22, C-21, C-11, C-12; H-20 do C-13, C-18, C-22, C-11 in 19-NH do C-13, C-10) in C, šestčlanski G obroč [8] z metilacijo ogljika pri C-17 (HMBC korelacije H-23 do C-17, C-16). Povezljivost podstrukture od A do B do C-3 so podpirale ključne korelacije HMBC od H-4 in 1-NH do C-3; H-10 na C-2 in C-9. Povezava med strukturo B in C z dušikovim atomom je bila odšteta s ključnimi korelacijami HMBC od H-12 do C-17 in C-13 ter primerjavo njihovih ustreznih kemičnih premikov C-12 in C-17 (dC 64.9 in 58.7). V zgornji analizi je bilo navedeno, da ima 1 podobno strukturo kot marcfortin A, razen razlik stranske verige pri benzenem obroču in metilu pri C-17 šestčlanske G obročke. Torej je bila bruto struktura 1 dodeljena, kot je prikazano na sl. 1.

Relativna stereokemija 1 se je izrekala na podlagi podatkov NOESY (slika 3). Prejšnje študije so pokazale, da so spojine 2-oksindolnega alkaloidnega tipa sprejele skladnost, v kateri je osrednji petčlanski obroč ortogonalen na ravnino podomedbe oksindola [9].

Korelacije NOESY med H-4 in H-10a, H-25 in med 19-NH in H-10a so pokazale, da sta oba na obrazu ciklopentanonega obroča, ki jih usmerja proti H-4, pri tem pa je bila relativna stereokemija pri C-3 določena, kot je prikazano. NoESY interakcije med H-21, H-12a, H-10b, H-23 in H-24 so ustrezne nadomestke dale skupaj na čelo ciklopentanonega obroča. Relativna stereokemija, predlagana za 1, se strinja z ustreznimi značilnostimi relativne stereokemije marcfortina A [7]. Bombažni učinek pri 200-250 nm izhaja iz n-p* prehoda vezi diketopiperazin amida, ki je diagnostičen za biciklo-[2.2.2] diazaoktano diketopiperazino jedro [10, 11]. Spekter CD 1 (sl. 4), povezan z ustreznimi regijami brevianamida A [11]. Torej absolutna stereokemija 1 bi morala biti 3S, 11S, 13S, 17S, 21R i dobila je ime krizogenamida A. Preliminarna evaluacija zaščitnog efekta krizogenamida A na neurocite je ovrednotena uporabom oksidativne stresom inducivane smrti celica u SH-SY5Y celicama testom MTT. Aktivnost prostega radikalnega ovčevanja krizogenamida A je bila prvič preučevana z uporabo DPPH kot dajalca prostih radikalov. V nasprotju z vitaminom C (IC50: 29,0 mM) krizogenamid A ni pokazal nobene sposobnosti (IC50 ≥100 mM) za razmah prostega radikala DPPH pri koncentraciji do 100 mM. Medtem smo testirali, ali so chrysogenamide A zaščitene celice pred oksidativno stresom induced celice smrti v SH-SY5Y človeški nevroblastoma

Celice. Oksidativni stres z vodikovim peroksidom je povzročil zmanjšanje sposobnosti preživetja celic za 43 % v primerjavi s kontrolno skupino. Krizogenamid A je zaviral celično smrt, ki jo je inducira vodikov peroksid z izboljšanjem sposobnosti preživetja celic za 59,6 % v koncentraciji 1*10-4 mM. Ti podatki kažejo, da je chrysogen amide A pokazal nevrocit zaščitni učinek pred oksidativnim stresom induced celično smrt, ne skozi njegovo antioksidativno aktivnost. Indolski alkaloidi, ki imajo nenavadno kolo [2.2.2] diazaoktanski obroč, so bili izolirani iz različnih rodov gliv, kot so Aspergillus [12, 9, 13], Penicillium [1416], in Malbranchea [17]. 1 je bil nov član te skupine spojin, imel je okostje, ki naj bi bil vmesni del biosineze citrinskih adminov A in B, o katerih so poročali kot nov razred pentacikličnih spiroinih dolinon alkaloidov leta 2005 [18]. S strukturnega vidika je pomembno iskati, da je 1 edinstvena struktura z metilacijo na položaju C-17 in 2-oksindolo moiety, ki ima enoto izofrena pri C-7. Nekateri od teh indolskih alkaloidov, izoliranih do danes, imajo močno antiparazitično aktivnost [19], zaviranje človeških tumorskih celic [13] in citotoksičnost [10]. Po našem vedenju je to prvo poročilo o nevrozaščiti s to vrsto alkaloida.

PriznanjeTo delo je finančno podprl kitajski nacionalni naravoslovni sklad (št. 30472136).

Prevent Alzheimer's disease

nevroprotektivna cistanche deserticola: anti-Alzheimerjeva bolezen

Cistanche deserticola ima veliko učinkov, kliknite tukaj, da veste več

Sklicevanja

Li LL, Wang XW, Wang XF. Antilipid peroksidacijo in antiradiacinsko delovanje glikozidov vherba cistanches. Kitajska J Chin Mater Med 22: 364–367 (1997)
Xie JH, Wu CF. Učinek etanolnega ekstraktaCistanche deserticolao vsebnosti monoaminih nevrotransmiterjev v podganah. Brada trad herb droge 24: 417–419 (1993)
Dai JR, Carte BK, Sidebottom PJ, Yew ALS, Ng SB, Huang Y, Butler MS. Circumdatin G, nov alkaloid iz glive Aspergillus ochraceus. J Nat Prod 64: 125–126 84 Sl. 2 Ključ HMBC in 1 H-1 H COSY korelacije 1. Sl. 3 NOESYs iz 1. Sl. 4 CD spekter 1. (2001)
Kettering M, Sterner O, Anke T. Antibiotiki v kemični komunikaciji gliv. Zeitschrift fuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences 59: 816–823 (2004)
Trifonov LS, Bieri JH, Prewo R, Dreiding AS, Hoesch L, Rast DM. Izoliranje in struktura elucidacija treh presnovkov iz Verticillium intertextum: sorbicillin, dihidrosorbicillin in bisvertinoquinol. Tetraedron 39: 4243–4256 (1983)
Zhang GL, Xing QY, Zhang MZ. Glikolipidi iz Mirabilis Himalaje. Fitokemija 45: 1213–1215 (1997)
Polonsky J, Merrien MA, Prange T, Pascard C, Moreau S. Izoliranje in struktura (rentgenska analiza) marcfortina A, novega alkaloida iz Penicillium roqueforti. J C S Chem Comm 13: 601–602 (1980)
Lee BH, Kornis GI, Cialdella JI, Clothier MF, Marshall VP, Martin DG, McNally PL, Mizsak SA, Whaley HA, Wiley VH. Mikrobiološka hidroksilacija pri šestih posameznih ogljikovih atomih marcfortina A. J Nat Prod 60: 1139–1142 (1997)
Whyte AC, Gloer JB, Wicklow DT, Dowd PF. Sclerotiamide: Nov član paraherkvamidnega razreda z močnim delovanjem antiinsektana iz skleroze Aspergillus sclerotiorum. J Nat Prod 59: 1093–1095 (1996)
Kato H, Yoshida T, Tokue T, Nojiri Y, Hirota H, Ohta T, Williams RM, Tsukamoto S. Notoamides AD: prenylated indole alkaloids izolirani od morske gljivice, Aspergillus sp. Angew Chem Int Ed 46: 2254–2256 (2007)
Williams RM, Kwast E, Coffman H, Glinka T. Izjemno, enantio-divergentna biogeneza brevianamida A in B. J Am Chem Soc 111: 3064–3065 (1989)
Banks RM, Blanchflflower SE, Everett JR, Manger BR, Reading C. Nove anthelmintic metaboliti iz vrste Aspergillus: aspergillimides. J Antibiotik 50: 840–846 (1997)
Qian-Cutrone J, Haung S, Shu YZ, Vyas D, Fairchild C, Menendez A, Krampitz K, Dalterio R, Klohr SE, Gao Q. J Am Chem Soc 124: 14556–14557 (2002)
Wilson BJ, Yang DTC, Harris TM. Študije proizvodnje, izolacije in predhodne toksičnosti brevianamida A iz kultur Penicillium Viridicatuma. Appl Microbiol 26: 633–635 (1973)
Breza AJ, Russell RA. Študije v zvezi z biosynthesis XLIV. Strukturne elucidacije brevianamidov B, C, D in F. Tetraedron 28: 2999–3008 (1972)
Liesch JM, Wichmann CF. Nove antinematodalne in antiparazitične agente iz Penicillium Charles. II. Določitev strukture paraherkvamidov B, C, D, E, F in G. J Antibiot 43: 1380–1386 (1990) 17. Martinez-Luis S, Rodriguez R, Acevedo L, Gonzalez MC, Lira-Rocha A, Mata R. Malbrancheamide, novi zaviralec kalmodulina iz glive Malbranchea aurantiaca. Tetraedron 62: 1817–1822 (2006)
Mishima T, Tsuda M, Kasa Y, Ishiyama H, Fukushi E, Kawabata J, Watanabe M, Akao K, Kobayashi J. Absolutna stereokemija citrinadinov A in B iz morske glive. J Org Chem 70: 9430–9435 (2005)
Lopez-Greta MP, Gonzalez MC, Ciavatta L, Ayala I, Moya P, Primo J. Insekticidno delovanje paraherquamides, paraherquamides, vključno paraherquamide H in paraherquamide I, Two New Alkaloids Izoliran iz Penicillium cluniae. J Agric Food Chem 54: 2921–2925 (2006)