Učinki Cistanche na apoptozo dopaminergičnih nevronov, ki jo povzroča nevrotoksin 1-metil-4 -fenilpiridinij (MPP)
Mar 10, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
Tian Jiyu, Chen Jianzong
(Tradicionalna kitajska medicina in kitajski raziskovalni center Materia Medica bolnišnice Xijing, FMMU, Xi'an 710032)
Povzetek
Cilj: Raziskati učinkeCistanche na celici apoptoze dopaminergičnih nevronov primarne kulture, inducirane z 1-metil-4-fenilpiridinijem (MPP plus ). Metoda: Za pripravo kunčjega seruma, sestavljenega izCistancheuporablja metodo serumske farmakologije. Nato preizkusite učinke zdravila Cistanche na celico apoptoze nevronov DA izMPP plusinduciranih modelov z uporabo morfološke, pretočne citometrije, barvanja TUNEL.Rezultat: Zdravljenje 200 μmol/LMPP plus24-urno ali dlje inducirano apoptozo v nevronih DA. PoMPP pluszdravljenih je razmerje apoptoze skupine, ki je vsebovala enak odmerek seruma Cistanche, 6,3 odstotka, skupinaMPP plussamozdravljenih je 30,2 odstotka. Število apoptoznih celic skupine B in C je bistveno manjše od skupine E (P<0.05).>Zaključek: Serum vsebujeCistanchezaščitena apoptoza DA nevronov, ki jo povzročajoMPP plus.
Ključne besede: Cistanche;1-metil-4-fenilpiridinij (MPP plus ); dopaminergični nevroni; apoptoza
Trenutno je glavna terapija zaParkinsonova bolezenje nadomestno zdravljenje s sestavljenimi pripravki levodope (L-dopa), ki ne morejo nadzorovati razvoja bolezni. Z napredovanjem bolezni odmerjanje povečujemo in na splošno v 3 do 5 letih se zdravilni učinek zmanjša, motorični simptomi nihajo in pojavijo se medikamentozne diskinezije. Nedavne študije so pokazale, da ima L-dopa učinek indukcije apoptoze na nevrone, gojene in vitro [1, 2], nato pa je bilo predlagano, da nevrotoksični učinek endogenega dopamina povzroči izgubo dopaminergičnih nevronov vParkinsonova bolezen. Eden od razlogov [3]. V dolgoletni klinični praksi uporabljamo kitajsko medicino zahranjenje jeter in ledvicv kombinaciji s pripravki levodope za zdravljenje PB in dosegli dobre rezultate [4-6]. Ta eksperiment je raziskoval zaščitni učinek tradicionalne kitajske medicine na apoptozo dopaminergičnih nevronov in njen mehanizem na molekularni in celični ravni.
1. Materiali in metode
1.1 Materiali
DMEM srednje,1-metil-4-fenilpiridinium, MPP plus, fetalni goveji serum kupljen pri podjetju Gibco.Citarabin, poli-l-lizin, PLL were purchased from Sigma Company. 24-well culture plate, 25cm2
Plastične steklenice za kultureso bili kupljeni pri podjetju NUNC.Kitajska medicinaki smo ga uporabljali, je bil kupljen pri Xi'an Decoction Piece Factory. Živali, ki smo jih uporabljali, je zagotovil šolski center za živali.https://www.xjcistanche.com/products
1.2 Priprava in eksperimentalno združevanje zdravilnega seruma
Cistanche pripravimo kot liofiliziran prašek za konzerviranje in ga ob uporabi razredčimo z destilirano vodo. Živalski serum je bil pripravljen iz novozelandskega velikouhega belega zajcaserum, vsi so bili zdravi samci, težki 2.5-3.0 kg. Ekvivalentni odmerek živali se pretvori glede na telesno površino in naključno razdeli v serum slepe kontrolne skupine; 1/2 seruma skupine ekvivalentnega odmerka (odmerek z gavažo zdravilne surovine Cistanche 0.8g/kg); skupino z enakovrednim odmerkomserum(Gavažni odmerek je originalni medicinski material Cistanche cistanche 1,6 g/kg); 2-kratni ekvivalentni odmerekserum(odmerek z gavažo je originalni medicinski material Cistanche 3,2 g/kg). Gavaža dvakrat na dan skupno 3 dni, 1 uro po zadnji gavaži, karotidno krvavitev, čez noč pri 4 stopinjah, centrifugiranje pri 2500 vrt/min 25 minut, skrbno ločevanje seruma, inaktivacija pri 56 stopinji 30 minut in odsesavanje skozi filtrirno membrano 0,22 μm Odfiltrirajte bakterije in shranite pri -20 stopinjah. Pod enakimi pogoji je bil slepi kunčji kontrolni serum pripravljen z gavažo z enakim volumnom normalne fiziološke raztopine. Poskus je bil razdeljen na 5 skupin. Skupina A je bila prazen zajecserumskupina za kontrolo kulture; Skupina B je bila aserumska kultura plus MPPskupina za zdravljenje, ki vsebuje 2-kratni ekvivalentni odmerek; Skupina C je bila aserumska kultura plus MPPskupina za zdravljenje, ki vsebuje enak odmerek; Skupina D je bila kontrolna skupina s serumsko kulturo, ki je vsebovala 1/2 ekvivalentnega odmerka serumske kulture in skupina za zdravljenje z MPP; Skupina E je slepa kultura kunčjega seruma in skupina za zdravljenje z MPP.
Cistanche koristi
1.3 Gojenje dopaminergičnih nevronov srednjih možganov
Tri podgane SD, breje 14 dni, smo izbrali in ubili z neposrednim vbrizgavanjem zračne embolije v srce; embrionalne podgane smo vzeli ven v aseptičnih pogojih in jih dali v petrijevko, napolnjeno z ledeno raztopino D-Hanksa. Fetalno podganje možgansko tkivo smo secirali in ločili pod stereomikroskopom. Referenčna metoda [7] je bila nekoliko izboljšana. Meninge in vaskularno tkivo so bili odluščeni, tkiva v predelih A8, A9 in A10 ventralnega srednjega možganja pa ločena. Dodajte 1 ml 0,125-odstotnega pankreatina in ga postavite v inkubator pri 37 stopinjah za približno 20 minut, dodajte ustrezno količino gojišča, ki vsebuje 10 odstotkov fetalnega govejega seruma, da prekinete prebavo, in uporabite aspiracijo.
Epruveto odpipetiramo v enotno celično suspenzijo, centrifugiramo pri 1500r/min 5 minut pri sobni temperaturi, previdno odstranimo supernatant, 15-krat odpipetiramo s pipeto s tankim vratom in pustimo stati 5 minut. V 24-ploščo z vdolbinicami za kulturo lizina dodajte gojišče v vsako vdolbinico, da prilagodite gostoto celic na 2 × 105 celic/ml, dodajte gojišče do 0,5 ml na vdolbinico in dodajte citarabin po 3 dneh gojenja ( končna koncentracija je 10 μmol/L), zavirajo rast ne-nevronov.
1.4 Imunocitokemično barvanje s tirozin hidroksilazo (TH).
Pri uporabi metode SABC razredčilo protiteles vsebuje goveji serumski albumin 1 g/100mL (Boster Company, Wuhan), 0,3 odstotka Triton-100 (Sigma, ZDA), NaN3 80mg/ 100 ml, razredčenega s PBS na 100 ml, naravnajte pH na 7,6. Kulturo smo prekinili 7. dan, sprali z D-PBS 5 minut 3-krat, sveže pripravljen 4-odstotni paraformaldehid smo fiksirali pri sobni temperaturi 30 minut in izprali z D-PBS 5 minut 3-krat; z 1:1:8 vodikovim peroksidom, metanolom in raztopino PBS Inkubirajte 30 minut pri sobni temperaturi, spirajte z D-PBS 5 minut, dodajte 5 odstotkov blokirnega kozjega seruma 30 minut pri sobni temperaturi, spirajte z D-PBS 5 minut minut in dodajte kozje protitelo proti mišjim TH, razredčeno z razredčilom protiteles (razredčitev 1:1000, Calbiochem)), čez noč pri 4 stopinjah, sperite z D-PBS 3 minute 3-krat, dodajte biotinilirani mišji protipodganji IgG, razredčen s protitelesi razredčilo (razredčeno 1:200, Sigma ZDA), delovati pri sobni temperaturi 4 ure, 3-krat spirati z D-PBS 3 min, dodati kompleks HRP, razredčen z razredčilom protiteles, 2 uri pri sobni temperaturi in spirati z D-PBS 3-krat po 3 minute. DAB razredčilo izpirajte 3 minute, dodajte za uporabo pripravljen kromogeni reagent DAB (Wuhan Boster Company) v celice in opazujte barvo pod invertnim mikroskopom.https://www.xjcistanche.com/
1.5 Ravnanje z zdravili
Morfološka opazovanja gojenih nevronov so izvajali vsak dan pod faznokontrastnim mikroskopom in spremembe beležili s fotografijami. Po 12-urnem gojenju smo celice opazovali pod invertnim mikroskopom in zdravila dodali tik pred sotočjem. Vsebnost seruma vsake skupine je bila 10 odstotkov. Po 3-dnevnem gojenju smo dodali MPP plus do končne koncentracije 200 μmol/L. Po 24-urnem inkubiranju v inkubatorju pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2 izvedite različne preglede.
Cistanche
1.6 Detekcija s pretočno citometrijo
Zdravljenje z zdravili je bilo enako kot prej. Po obdelavi vsake skupine smo adherentne celice PC12 razgradili s 0.125 odstotki tripsina in celice vzeli približno 1 × 106 PBS. Celice smo dvakrat sprali in dodali 490 μL vezavnega pufra, celice temeljito premešali in dodali 5 μL aneksina V. FITC in 10 μL raztopljenega PI v celični suspenziji, nežno premešamo, postavimo epruveto na 4 stopinje, inkubiramo 10 minut v temi in testiramo na pretočnem citometru COULTER EPICS (Beckman Coulter, ZDA).
1.7 Končno označevanje in situ (TUNEL) za odkrivanje celične apoptoze
Končno označevanje DNA in situ gojenih nevronov uporablja Bosterjev komplet za odkrivanje apoptoze (MK1022), koraki pa so naslednji: Vzemite dopaminergične nevronske celice vsake skupine po zdravljenju z MPP plus (stekelec pred primarno kulturo je predhodno kultiviran s polimerno obdelavo z lizinom), fiksiran s 4{{30}}g/L paraformaldehida 1 uro, sveža 3-odstotna ocetna kislina (pH 2,5) pri sobni temperaturi 10 minut, nevtralizira alkalno fosfatazo, dodamo 0,1 mol/L TBS (pH7,5) 1:200 sveže razredčeno razgradnjo proteinaze K pri 37 stopinjah 20 s, dodamo 1 μL TdT in DIG-d-UTP na vsako stekelce in 18 μL pufrske raztopine 2 uri pri 37 stopinjah; dodajte 50 μL raztopine za blokiranje na vsako stekelce pri sobni temperaturi 30 minut; dodajte 50 μL biotiniliranega protitelesa proti digoksigeninu, razredčenega z raztopino za blokiranje; reagirajte 30 minut v mokri škatli pri 37 stopinjah; dodajte 50 μL SABC-AP, razredčenega z 0,1 mol/L TBS, na vsako stekelce; Vzorcu smo dodali BCIP/NBT (0,1 mol pH 9,5 /L TBS, razredčenega 1:20), da se je za 30 minut razvila barva; istočasno alternativna kontrola (namesto mešanice TdT/biotin-dUTP je bil uporabljen pufer TdT) za fotomikrografijo in mikroskop z invertnim faznim kontrastom (200×) Opazujte apoptotične celice. Preštejte pozitivne celice pod mikroskopom s faznim kontrastom, preštejte 5 polj na vdolbino v vsaki skupini, za skupno 6 vdolbinic.
2. Eksperimentalni rezultati
2.1 Morfološko opazovanje gojenih nevronov
Opazovano s fazno-kontrastnim mikroskopom OlympusIX70: 5 ur po inokulaciji se večina celic drži stene, celice so razpršene, telo celice je okroglo, jedro je nevidno in lomni količnik je močan. Po 24-urnem gojenju so celične izbokline rasle in se postopoma podaljšale. Po 48 urah je večina celic štrlela z razvejanimi nitastimi izrastki. Celična morfologija je bila raznolika, ki je bila bipolarna, tripolarna in multipolarna in je postopoma oblikovala redko mrežo. Telo celice je bilo povečano, okroglo in eliptično. Po poškodbi MPP plus so celice najprej otekle, povečal se je lomni količnik, celice so bile v degenerativnem stanju, celice pa so se nazadnje skrčile in odpadle. Različni odmerki sestavljenega seruma, ki vsebuje kitajsko medicino, imajo zaščitne učinke na MPP in poškodbe. Potem ko je bila kultura obarvana z imunskimi celicami TH, je bilo razvidno, da so bile TH-pozitivne celice rjave z nevritnim izrastkom. Po dodajanju enakovrednega odmerka seruma tradicionalne kitajske medicine je delež TH-pozitivnihnevronilahko doseže 55 odstotkov -60 odstotkov .
2.2 Analiza rezultatov testa pretočne citometrije (glej sliko 1)
Fosfatidilserin (PS), ki se nahaja znotraj celične membrane v zgodnji fazi apoptoze, migrira na zunanjo stran celične membrane. Fosfatidil vezavni protein V (Aneksin V) je od kalcija odvisen fosfolipidno vezavni protein, ki ima visoko afiniteto za PS. Zato lahko aneksin V uporabimo kot sondo za odkrivanje PS, izpostavljenega na površini celične membrane. Hkrati v kombinaciji z metodo izključitve PI za dvojnoobarvanjeapoptotičnih celic je mogoče apoptotične celice zaznati s pretočno citometrijo. V spodnjem desnem kvadrantu slike 1 (FITC plus /PI-) so prikazane podrobnosti o apoptozi vsake skupine. Delež celic, stopnja apoptoze vsake skupine je bila 4,1 odstotka, 5,8 odstotka, 6,3 odstotka, 28,6 odstotka, 30,2 odstotka.
2.3 Analiza rezultatov barvanja TUNEL
Tiste z modro-vijoličnimi delci v jedru so pozitivne celice, torej apoptotične celice. Delež apoptotičnih celic v vsaki skupini smo prešteli pod svetlobnim mikroskopom. Število apoptotičnih celic na vidno polje v vsaki skupini je bilo: skupina A 2,13±0,34; Skupina B 4,92±0,67; Skupina C 6,20±1,47; Skupina D 10,33±1,51; Skupina E 12,74±2,51. Poanaliza t-testa,skupini B in C smo primerjali s skupino E (P<0.05). the="">rezultateso v osnovi skladni zrezultati pretočne citometrije.
3. Razprava
Parkinsonova bolezenspada v kategorijo "tremor sindrom" v kitajski medicini. Tradicionalna kitajska medicina verjame, da je pojav PB večinoma niz manifestacij postopnega izčrpavanja jeter in ledvic pri starejših ter izgube prehrane meridiana možganskega mozga. Glavno zdravljenje jeneguje jetra in ledvice, pomirjajo jetra in odpravljajo vetrove. Tradicionalna kitajska medicina lahko igra namen "zmanjšanje toksičnosti in povečanje učinkovitosti" pri zdravljenjuParkinsonova bolezen, vendar njegov mehanizem delovanja trenutno ni zelo jasen. Veliko število eksperimentalnih dokazov v sodobni medicini kaže, da je oksidativni stres eden od dejavnikov, ki povzročajo odmiranje živčnih celic PB [3]. Študije so pokazale, da lahko skupni glikozidi cistanche učinkovito odstranijo različne reaktivne kisikove proste radikale in zaščitijo DNA pred oksidacijo, ki jo povzroča OH[8]. Ekstrakt Cistanche tubuloside B lahko zmanjša citotoksičnost, ki jo povzročaMPP plus,oslabijo kopičenje reaktivnih kisikovih zvrsti v celici in imajo antagonističen učinek na apoptozo in oksidativni stres, ki ga povzročajoMPP plus[9]. Tradicionalna kitajska medicina lahko aktivira in okrepi lastno zaščitno signalno pot, se upre zunanjim poškodbam in vzpostavi ravnovesje. To je eden od ciljev modernizacije tradicionalne kitajske medicine. Po dopaminskem nadomestnem zdravljenju ljudje zdaj na splošno cenijo nevroprotektivno zdravljenje, kar imenujemo druga revolucija pri zdravljenjuParkinsonova bolezen. V tem poskusu so izolirane srednjemožganske dopaminergične živčne celice gojili s kitajsko medicino, ki je vsebovala serum, in ugotovili, da ima Cistanche določen nevroprotektivni učinek. V tem poskusu sta bili uporabljeni dve detekcijski metodi pretočne citometrije in barvanje TUNEL, da bi hkrati ugotovili, da lahko serum skupine z ekvivalentnim odmerkom in serum skupine z 2-kratnim ekvivalentnim odmerkom medicirane serumske kulture Cistanche zmanjšata primarno gojen dopaminski živec v srednjem možganu, ki ga povzročaMPP plusŠtevilo apoptotičnih celic ima določen zaščitni učinek na apoptotične celice. Tradicionalna kitajska medicina lahko zaščiti dopaminergične nevrone pred poškodbami v zgodnji fazi, kar je pomembnejši ukrep kot druge terapije. V tem smislu je celostno zdravljenje kitajske medicine zdravilo za temeljni vzrok in ga je mogoče obravnavati kot eno od nevroprotektivnih zdravljenj, ki jih ljudje trenutno cenijo.
Reference
1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, et al. Levodopa inducira apoptozo v kultiviranih nevronskih celicah - možen pospeševalnik nigrostriatalne degeneracije pri Parkinsonovi bolezni? Mov Disord, 1997, 12(1):17
2. Jenner PG, Brin MF. Nevrotoksičnost levodope: eksperimentalne študije v primerjavi s klinično pomembnostjo. Neurology, 1998, 50 (6 Suppl 6): S39
3. Maruyama W, Naoi M. Celična smrt pri Parkinsonovi bolezni. J Neurol, 2002, 249 (dodatek 2): II6
4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian et al. Klinično opazovanje zdravljenja Parkinsonove bolezni z delovanjem jeter in ledvic: poročilo o 60 primerih. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 1999, 22(3): 14
5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang itd. Klinično opazovanje 40 primerov Parkinsonove bolezni, zdravljenih z metodo hranjenja jeter in ledvic. Raziskave v kitajski medicini, 1998, 14(3): 10
6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron, et al. Pingchan št. 1 peroralna tekočina pri zdravljenju 40 primerov Parkinsonove bolezni. Journal of Anhui College of Traditional Chinese Medicine, 1999, 18(2): 9
7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A, et al. Visok odstotek donosa celic, pozitivnih na tirozin hidroksilazo, iz podganje E14 mezencefalne celične kulture. Brain Res, 1992, 586 (2): 319
8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming, et al. In vitro odstranjevanje prostih radikalov in zaščitni učinki na poškodbe DNA, ki jih povzročajo OH, ki jih povzročajo skupni glikozidi cistanche. Kitajska farmacevtska revija, 2001, 36(1): 29
9. Sheng G, Pu X, Lei L, et al. Tubulozid B iz Cistanche salsa Rešuje nevronske celice PC12 pred apoptozo in oksidacijo, ki jo povzroča 1-metil-4-fenilpiridinijev ion. Stres. Planta Med, 2002, 68 (11): 966
