Analiza absorbiranih komponent v podganji plazmi po peroralnem dajanju kvaziestrogenske frakcije Cistanche

Analiza absorbiranih komponent v podganji plazmi po peroralnem dajanju kvaziestrogenske frakcije Cistanche

Za več informacij: Ali.ma@wecistanche.com

Kliknite za prednosti in stranske učinke cistanche

Povzetek:

Za analizo in identifikacijo sestavin v podganji plazmi po peroralnem dajanju aktivne frakcijecistanche, so bile komponente v podganji plazmi odkrite s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti-elektrosprejna ionizacija-kvadrupolni čas letenja-masna spektrometrija (HPLC-Q-TOF MS)． Strukture komponent so bile razjasnjene s primerjavo njihovih retenzijskih časov in MS/MS spektrov s tistimi referenčnih spojin in objavljenimi podatki v literaturi. Identificiranih je 13 kemičnih sestav, vključno s 6 prototipnimi komponentami, kot so genipozidna kislina, salidrozid,Cistanozid A, Ehinakozid, Akteozid, Cistanozid D,7 komponente metabolitov, kot so 3,4-dihidroksifeniletanol glikozidi, metilacijski akteozid, acetilacijski cistanozid G,3,4-dihidroksifeniletanol, acetil tubulozid B, cistanozid B glukuronidni metabolit in metilacija-3,4 Dihidroksifeniletanol. Rezultati lahko zagotovijo bistvene podatke za osvetlitev terapevtske osnove kvazi estrogenske regulacijske aktivnosticistanche．

Ključne besede:

cistanche; zdravilo, ki vsebuje serum; kvazi estrogen; tekočinska kromatografija visoke ločljivosti-ionizacija z elektrosprejem-kvadrupolni čas letenja-masna spektrometrija (HPLC-Q-TOFMS)

Cistanche deserticolaje parazitska rastlina v koreninah puščavskih dreves (kot so haloxylon ammodendron, tamarix itd.). Kot nekakšna hranljiva in močna dragocena kitajska tradicionalna medicina ima različne farmakološke učinke, kot so negovanje ledvic Yang, uravnavanje imunosti, upočasnitev staranja, proti sevanju in zaščita centralnega živčnega sistema. Znan je kot "puščavski ginseng". Trenutno je večina študij o dejavnosti c. deserticola doma in v tujini so omejeni na vrednotenje farmakološkega delovanja, medtem ko osnove njegovih farmakodinamičnih učinkovin niso pojasnjene, kar resno ovira racionalen razvoj in uporaboCistanche deserticola.

Sestavine tradicionalne kitajske medicine so kompleksne in raznolike in šele po pravilni uporabi z absorpcijo in presnovo v telesu lahko sestavine končno preidejo v kri in postanejo farmakodinamična osnova tradicionalne kitajske medicine. Te učinkovine so lahko prototip ali presnovek TRADICIONALNE kitajske medicine, lahko pa so nove sestavine, ki nastanejo z medsebojno reakcijo različnih komponent v tradicionalni kitajski medicini, ali pa so endogene fiziološke učinkovine, ki nastanejo z neposrednim delovanjem zdravil. na telesu. Zato lahko te komponente krvi predstavljajo farmakodinamično osnovo tradicionalne kitajske medicine in sestavljene medicine. Analiza komponent in metabolitov, ki lahko po peroralnem dajanju preidejo v kri, ter iskanje pravil medsebojnega delovanja komponent lahko predstavlja določeno osnovo za temeljne raziskave farmakodinamičnih substanc.

Za pregled estrogenu podobnih aktivnih delov in odmerka cistanche deserticola sta bili uporabljeni metoda pridobivanja telesne mase miši in kolorimetrija MTT. Preliminarni eksperimentalni rezultati so pokazali, da se je maternični koeficient nezrelih miši znatno povečal z intragastričnim dajanjem etanolnega (95-odstotnega) izvlečka cistanche deserticola v odmerku 30 g/kg na dan, serum, ki je vseboval zdravilo, pa je pospešil proliferacijo celic McF-7 značilno (P <0,01), kar="" je="" bil="" aktivni="" del="" estrogenu="" podobnega="" učinka="" cistanche="">

V tej študiji je bila za analizo in identifikacijo krvnih komponent, prototipnih komponent in presnovkov aktivnih delov cistanche po uporabi cistanche z estrogenom in špekulirati o presnovni poti, da bi zagotovili osnovo za osnovne raziskave o farmakodinamičnih snoveh cistanche z estrogenom.

1 Eksperimentalni del

1.1 Instrumenti in reagenti

Waters-600 Tekočinski kromatograf: Waters Co., LTD., opremljen z gradientno črpalko s štirimi elementi, avtomatskim vzorčevalnikom, vakuumskim razplinjevalnikom, temperaturno škatlo kolone, detektorjem DAD, kemično delovno postajo Empower;

Masni spektrometer serije Q-TOF LC-MS Agilent-1290 6530: izdelki ameriškega podjetja Agilent;

Xw-80vrtinčni mešalnik: Shanghai Yugong Machinery Co., LTD.

Dk-80 Električna termostatska vodna kopel: Shanghai Yiheng Technology Co., LTD.

Alc-110. 4 Analitična tehtnica: Shanghai Renhe Scientific Instrument Co., LTD.

Ultrazvočni oscilator H66MC: Ohaus Technology Co., LTD.

Cistanche deserticola: kupljeno na tržnici zdravilnih zelišč San Ke Shu, profesor Zhang Delian s komercialne univerze Harbin je identificiral kot Cistanche deserticola;

Mullein (št. serije 111530-200505), ehinozid (št. serije 111670-200503), salidrozid (št. serije 110736-200628): vse zagotavlja Kitajski nacionalni inštitut za nadzor farmacevtskih in bioloških izdelkov ;

Etilen stilbestrol: Guangzhou Hampden Pharmaceutical Co., LTD. Metanol in acetonitril: stopnja HPLC, izdelki Shandong Yuwang Reagent Co., LTD. Ostali reagenti so bili analitično čisti.

Eksperimentalna voda: čista voda.

Samice podgan Wistar: Številka serije SCXK-(JI) 2003 -- 2004, teža (220 ± 20) g, ki jo je zagotovil Center za eksperimentalne živali Changchun National Biological Industry Base.

1.2 Priprava intragastrične raztopine zdravila

Surovi prah cistanche deserticola smo ekstrahirali z refluksno ekstrakcijo s 95-odstotnim etanolom in nato ekstrahirali z 8-kratnim topilom 150 minut, 6-kratnim topilom 75 minut in 6-kratnim topilom 75 minut zaporedoma. Nato so tri ekstrakte združili in kondenzirali pod pritiskom, da so dobili ekstrakt, ki so ga shranili v hladilniku za kasnejšo uporabo. Pred uporabo smo z destilirano vodo pripravili intragastrično raztopino s koncentracijo 1,5 g/mL.

1.3 Priprava referenčne raztopine

Vzeli smo točno določeno količino mulleina, salidrozida in ehinakozida in jih popolnoma raztopili v metanolu, da smo pripravili 1 ml mešane kontrastne raztopine, od katere je vsaka vsebovala 0.2 mg treh referenčnih snovi. Prenesite raztopino referenčne snovi skozi 0.45 μm filtrirno membrano in jo postavite na stran.

1.4 Priprava zdravilnega seruma in slepega seruma

Priprava seruma, ki vsebuje zdravilo: stehtajte samice podgan Wistar, jim dajte 1 mL /100 g na dan oziroma jim dajte destilirano vodo in raztopino za gavažo dvakrat zjutraj in zvečer, 3 zaporedne dni, 60 minut po zadnjem odmerku, anestezirajte z 2 ml/kg 10-odstotnega kloralhidrata z intraperitonealno injekcijo. Kri je bila odvzeta iz jetrne portalne vene in centrifugirana pri 3 000 r/min 10 minut po popolni koagulaciji. Supernatant je bil nato serum, ki je vseboval zdravilo.

Priprava slepega seruma: podgane so bile intragastrične z enako količino destilirane vode vsak dan, druge metode priprave pa so bile enake kot pri serumu, ki je vseboval zdravilo.

Vzeli smo mL seruma, ki je vseboval zdravilo, dodali 5-kratno količino metanola in vrtinčili v centrifugalni epruveti 10 min. Centrifugiranje je bilo izvedeno pri 14 000 r/min 10 min, supernatant je bil absorbiran in topilo posušeno. Z mikropipeto smo dodali 0,5 ml metanola, da smo preostanek raztopili. Ostanek smo filtrirali z 0,22 μm mikroporozno membrano in analizirali s kromatografijo.

1.5 Eksperimentalni pogoji

Kromatografski pogoji: kolona Waters Symmetry ShieldTM RP18 (4,6 mm × 250 mm × 5 μm); Pred stolpec: Nova - PakC18 Guard - PakTM; Hitrost pretoka: 0,5 ml/min; Injekcijski volumen: 10 μL; Mobilna faza: acetonitril-0.2-odstotna vodna raztopina mravljinčne kisline; Pogoji gradienta: 0-35 min, 5 odstotkov -34 odstotkov acetonitrila, 35-65 min, 24 odstotkov -26 odstotkov acetonitrila; Temperatura kolone: ​​30 stopinj; Valovna dolžina zaznavanja: 254 nm.

Pogojni ionski vir masne spektrometrije: vir ionizacije z elektrosprejem (ESI) pri atmosferskem tlaku; Hitrost pretoka: {{0}},5 ml/min; Tlak plina za razprševanje: 0.2 MPa; Pretok suhega plina: 8. 0 L/min; Temperatura sušenja: 30 stopinj; Kapilarna napetost: 3,5 kV; Hitrost pretoka plaščnega plina: 12,0 L/min; Temperatura nožnice: 400 stopinj. Izbran je način skeniranja pozitivnih in negativnih ionov, območje skeniranja mase pa je m/z 100 ~ 3 000.

2 Rezultati in razprava

2.1 HPLC-ESI-Q-TOF MS/MS analiza kemičnih sestavin v serumu estrogensko aktivnih delov Cistanche deserticola

Kvalitativno analizo smo izvedli na vzorcih seruma podgan, ki vsebujejo zdravilo, v estrogensko aktivnem delu Cistanche deserticola z detektorjem ESI-MS. Za skeniranje sta bila uporabljena način pozitivnih ionov in način negativnih ionov, rezultati pa so prikazani na sliki 1. S primerjavo diagramov pretoka skupnih ionov prve stopnje masne spektrometrije obeh načinov skeniranja na sliki 1 je bilo ugotovljeno, da skupni ion tok, pridobljen v načinu negativnih ionov, je imel močne značilnosti in visoko občutljivost, zato je bilo v tem poskusu izbrano skeniranje v načinu negativnih ionov.

V načinu negativnih ionov je bil detektor esI-MS uporabljen za izvedbo kvalitativne analize seruma podgan po dajanju estrogenskega aktivnega dela Cistanche deserticola. S primerjalno analizo prvostopenjskega diagrama skupnega ionskega toka s skeniranjem slepega seruma in seruma za dajanje je bilo označenih skupno 13 vrhov molekularnih ionov, kot je prikazano na sliki 2. Za vrhove 2, 3, 5, 7, 9 in 10 se domneva, da so prototipne komponente, za vrhove 1, 4, 6, 8, 11, 12 in 13 pa se domneva, da so presnovne komponente.

Glede na vrhove molekularnih ionov, ki jih zazna vsak kromatografski vrh v načinu negativnih ionov, in relativno molekulsko maso, podano z ustreznim značilnim fragmentom, je bilo označenih skupno 13 ms vrhov. Kemijske sestavine 13 vrhov so bile identificirane s primerjavo informacij UV-MS za vsako standardno snov in sklicevanjem na sestavine, navedene v literaturi, ki so bile navedene v tabeli 1.

Šest prototipnih komponent je bilo genipozid, salidrozid, Cistanche glikozid a, Echinacea glikozid, Mullein glikozid in Cistanche glikozid D;

Sedem presnovnih komponent je bilo 3,4-dihidroksi fenil etanol glikozid, metiliran Mullein glikozid, acetiliran Cistanche glikozid g, 3,4-dihidroksi fenil etanol, acetil tubulozid B, Cistanche glikozid B metabolit glukuronske kisline in metiliran{{ 4}},4-dihidroksi fenil etanol. Med sedmimi presnovki se domneva, da so vrh 1 (3,4-dihidroksifeniletanol), vrh 8 (3,4-dihidroksifeniletanol) in vrh 13 (metiliran 3,4-dihidroksifeniletanol glikozid). hidrolitični fragmenti feniletanolnih glikozidov v Cistanche deserticola; Vrh 4 (metiliran mullein glikozid) je metabolit mullein glikozida; Vrh 6 (acetiliran Cistanche glikozid g) je metabolit Cistanche glikozida G; Vrh 11 (acetil gvanozin b) je metabolit gvanozina B; Vrh 12 (presnovek glukonske kisline Cistanche glikozida b) je metabolit Cistanche glikozida B.

Kitajski znaki razširijo razlago:

质谱信息 predstavlja informacije o masnem spektru.

相对分子质量 predstavlja relativno molekulsko maso

化合物推测结果 predstavlja rezultate špekulacij spojin

代谢 predstavlja presnovne komponente

原型 predstavlja komponente prototipa

2.2 Diskusija

V tem poskusu je bil hplc-q-tof MS uporabljen za identifikacijo 13 glavnih kromatografskih vrhov v serumu po dajanju estrogenu podobnega aktivnega dela Cistanche deserticola. To so lahko neposredno delujoče snovi Cistanche deserticola in vivo. Hkrati pa tudi odraža, da je učinkovitost tradicionalne kitajske medicine rezultat večkomponentnega usklajevanja, komplementarnosti ali omejevanja. Z analizo 13 prehodnih komponent v krvi je bilo dokazano, da so feniletanol glikozidi glavne učinkovine Cistanche deserticola. V nadaljnji študiji bo vzpostavljeno ustrezno razmerje učinkov spektra, da se preuči korelacija učinkov zdravila, da se dodatno razjasni materialna podlaga učinka zdravila in določi razmerje med odmerkom, časom in učinkom večkomponent v različnih časih. točk v telesu, da bi razkrili presnovno pot in način presnove Cistanche deserticola.

3 Sklepi

V tem poskusu je bila uporabljena tehnologija hplc-esi-q-tof MS / MS za analizo krvnih komponent estrogena, kot so aktivni deli Cistanche deserticola, in identificiranih je bilo 13 kemičnih komponent, kar je zelo pomembno za razjasnitev farmakodinamične materialne osnove estrogenu podobnih aktivnih sestavin Cistanche deserticola in lahko zagotovi tudi zanesljivo podlago za nadaljnje raziskave in klinično zdravljenje Cistanche deserticola.