Študija za Cistanche kemijskih profilov in metabolita

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Zhe Li, Lkhaasuren Ryenchindorj, Bonan Liu, Ji Shi, Chao Zhang, Yue Hua, Pengpeng Liu, Guoshun Shan & Tianzhu Jia

Povzetek

Ozadje: Predelava kitajske materie medice je prepoznavna in edinstvena farmacevtska tehnika v tradicionalni kitajski medicini (TCM), ki se uporablja za zmanjšanje stranskih učinkov in povečanje ali celo spreminjanje terapevtske učinkovitosti surovih zelišč. Za večjo učinkovitost zdravilnih rastlin so v prvi vrsti odgovorne spremembe esencialnih sestavin, ki jih povzroči optimiziran postopek predelave. Poživitveni učinek na ledvice-jang v riževem vinu kuhane Cistancha deserticola (C. deserticola) je bil močnejši od surovega C. deserticola (CD). Metode: Izvedena je bila primerjalna analiza z uporabo UPLC-Q-TOF-MSE z informacijsko platformo UNIFI za ugotavljanje vpliva procesiranja. Študije in vitro so bile izvedene za karakterizacijo sestavin inmetabolitiin vivo. Thekemičnakomponente so bile določene v CD in njegovih predelanih produktih. Multivariatne statistične analize so bile izvedene za ovrednotenje variacij med njimi, medtem ko je bil OPLS-DA uporabljen za parno primerjavo. Rezultati: Rezultati te študije so pokazali precejšnje razlike v feniletanoidnih glikozidih (PhG) in iridoidih po obdelavi. V ekstraktih CD-ja in njegovih predelanih produktih je bilo odkritih skupno 97 spojin. PhG s 4'-O-kafeoilno skupino v 8-O- -D-glukopiranozilnem delu, kot so akteozid, cistanozid C, kampneozid II, osmantusid, so se po predelavi zmanjšali, medtem ko so se PhG s 6'-O- kafeoilne skupine v 8-O- -D-glukopiranozilnem delu, kot so izoacetozid, izocistanozid C, izokampneozid I, izomartinozid, se je povečalo, zlasti v skupini CD-NP. Povečala se je tudi intenzivnost ehinakozida in cistanozida B, katerih struktura imata 6'-O- -D-glukopiranozilni del. V študiji in vivo je bilo 10 prototipnih komponent in 44metabolitiso odkrili v podganji plazmi, blatu in urinu. Dobljeni rezultati so pokazali, da obdelava vodi do precejšnjih variacij vkemičnasestavine CD in je vplivalo na razporeditev spojin in vivo, presnovni procesi faze II pa so ključne kaskade vsake spojine in večinametabolitiso povezani z ehinakozidom ali akteozidom. Zaključki: To je prva globalna primerjalna raziskava surovega in predelanega CD-ja. Te ugotovitve prispevajo k našemu razumevanju vpliva obdelave CD-jev in dajejo pomembne podatke za prihodnje preiskave učinkovitosti.

Študija cistanche kemijskih profilov in metabolita

Uvod

Obdelava s kitajsko materijo medico (CMM) je pokazala pomembno uporabnost v klinični praksi tradicionalne kitajske medicine (TCM) in že več stoletij velja za učinkovito zdravljenje. To je edinstvena farmacevtska tehnologija, ki izhaja iz teorije TKM. Po obdelavi znatne razlike v videzu,kemičnaUgotovljene so bile sestavine, značilnosti in medicinski pomen vseh vrst TKM, kar vodi do domneve, da bi predelava lahko izboljšala učinkovitost ali zmanjšala toksične učinke TKM.

Stotine let,Cistanche deserticola(Roucongrong v kitajščini, CD) se običajno uporablja v klinični praksi TCM za dopolnitev funkcij ledvic. Pomaga tudi pri vlaženju črevesja, kar vodi do sproščanja črevesja [1].Cistancheje bil prvič zabeležen v ShenNongBencaoJing. Običajno ga najdemo v sušnih in polsušnih habitatih v Evraziji in Severni Afriki, vključno z Iranom, Kitajsko, Indijo in Mongolijo [2]. Predelava CD-ja je bila izvedena s parjenjem z riževim vinom pod normalnim tlakom, kar je metoda priprave, dokumentirana v kitajski farmakopeji (Jiucongrong v kitajščini, v nadaljevanju "CD-NP"). In parjenje CD-ja z riževim vinom pod visokim pritiskom je učinkovitejša metoda priprave (v nadaljnjem besedilu "CD-HP") [3, 4]. Več študij je pokazalo, da se farmakološki učinki CD-ja razlikujejo od njegovih predelanih produktov [5]. CD lahko tonizira ledvični jang in sprosti črevesje, medtem ko bi se po kuhanju z riževim vinom okrepil učinek obnavljanja ledvičnega janga. V naši prejšnji študiji je bilo ugotovljeno, da lahko CD-NP poveča tonizacijo ledvic in podpira jang ter ublaži učinek vlaženja črevesja in defekacije [6,7,8]. V klinični praksi so predelani izdelki najpogosteje uporabljena oblika.

Do danes je več študij analiziralokemičnakomponente CD-ja, čemur je sledila izolacija in identifikacija več kot 100 spojin [9,10,11], kot so feniletanoidni glikozidi (PhG), iridoidi, lignani in oligosaharidi kot njegove glavne kemične sestavine. Poročali so tudi, da obstaja veliko farmakoloških aktivnosti PhG, vključno z imunomodulatornimi, nevroprotektivnimi, hepatoprotektivnimi, protivnetnimi, antioksidativnimi itd. [12,13,14]. Iridoidi imajo protivnetno delovanje [15, 16]. Prejšnje študije so tudi pokazale, da so nekatere kemične komponente med predelavo nihale [17,18,19,20]. Na podlagi teh poročil se lahko domneva, da bodo naknadna obdelava, razlike vkemičnasestava vodi do različnih farmakoloških učinkov, ki jih je treba še dodatno raziskati.

V trenutni študiji je bila za primerjalno analizo izvedena občutljiva in učinkovita metoda, tj. tekočinska kromatografija ultra visoke ločljivosti, povezana s TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE), za kvalitativno analizo ekstraktov pa so bile izvedene študije in vitro. CD, CD-NP in CD-HP za pojasnitev njihovih kemijskih profilov. Na splošno eksogenikemikalijez visoko izpostavljenostjo v ciljnih organih veljajo za učinkovite komponente. Zato so pri podganah peroralno dajali CD in njegove predelane produkte, čemur je sledila njihova karakterizacija. Obstoječa študija prvič razkriva primerjalno študijo (tako in vitro kot in vivo) surovega in predelanega CD-ja. Dobljeni rezultati bi razširili naše razumevanje učinka obdelave CD-jev, kar bi lahko bilo koristno za nadaljnje študije.

cistanche kemijskih profilov in metabolita

Materiali in metode

Materiali

Standardne spojine ajugola (180120) in 2'-aktilacetozida (M0601AS) je zagotovil Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Kitajska). Cistanozid F (MUST-17022620), ehinakozid (D1105AS), cistanozid A (M0906AS) in izoakteozid (M0106AS) je zagotovilo podjetje Must (Sichuan Kitajska); akteozid (O0618AS), salidrozid (J0526AS), katalpol (S0728AS), genipozid (A0407AS) in genipozidno kislino (MB6001-S) so pridobili pri Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, Kitajska). 8-epideoksiloganska kislina (B31123) je bila pridobljena pri Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Kitajska. Metanol in acetonitril sta bila razreda MS in sta bila pridobljena pri Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija. Metanojsko kislino (CH2O2) kakovosti HPLC je zagotovil Merck KGaA (Darmstadt, Nemčija). Voda, uporabljena v obstoječi študiji, je bila obdelana s sistemom Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, Ma, ZDA). Riževo vino je zagotovilo podjetje Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kitajska).

Cistanch deserticola je bil zbran iz Neimenggu wangyedicistancheCo. Ltd. Vzorce je identificiral prof. Yanjun Zhai (farmacevtska fakulteta Univerze Liaoning TCM). Vzorci so bili predloženi univerzi tradicionalne kitajske medicine Liaoning.

Živali

Podganje samce Sprague–Dawley (razred SPF) s 180–220 g skupne telesne teže je zagotovil Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Center za laboratorijske živalske vire province Liaoning, številka licence: SCXK-2015–0001). Te podgane so bile en teden nameščene v sobi za vzrejo z dobro vzdrževano temperaturo in vlažnostjo, tj. 20–26 stopinj, 50–70 odstotkov. Podgane so pred poskusom hranili z običajno laboratorijsko hrano in vodo. Živali so se čez noč postile, vendar jim je bila pred poskusom zagotovljena voda ad libitum. Podgane so usmrtili z 10-odstotnim anestetikom kloralhidrata. Institucionalni odbor za etiko živali provincialne bolnišnice kitajske medicine Liaoning je odobril vse eksperimentalne protokole (2019.3.25, 2019015).

Priprava ekstrakta CD, CD-NP in CD-HP

CD-NP, CD-HP sta bila obdelana iz iste serije Cistanch deserticola. Za pripravo CD-NP smo suhe kose CD-ja (debeline 5 mm, 100 g) navlažili z riževim vinom (30 ml) in jih 16 ur dušili pri 100 stopinjah, čemur je sledilo sušenje pri 55 stopinjah v sušilni pečici. Medtem ko je bil CD-HP pripravljen z infiltracijo suhih kosov CD-ja (5 mm debeline, 100 g) z riževim vinom (30 ml), čemur je sledilo parjenje pri 1, 25 atmosferskem tlaku 4 ure. in nato sušimo v sušilnici pri 55 stopinjah.

V 100 mL merilno bučko smo en gram praška presejali skozi sito #4, čemur je sledilo dodajanje 50 odstotkov metanola (50 mL) in nato tesno pokrito in premešano. To mešanico smo stehtali, čemur je sledilo pol ure. maceracija. Po maceraciji smo zmes obdelovali z ultrazvokom (moč 250 W, frekvenca 35 kHz) 40 minut, nato smo jo ohladili in ponovno stehtali. Izgubo teže smo nadomestili s 50-odstotnim metanolom, ustrezno premešali in pustili stati, čemur je sledilo filtriranje supernatanta in nato uporabljeni dobljeni filtrat kot preskusna raztopina.

MSE analiza aktivnih komponent

Priprava standardnih substanc: tubulozid-A (3.02 mg), ehinakozid (300 mg), 2'-acetilakteozid (2,34 mg), akteozid (2,45 mg), izoakteozid (0,61). mg), cistanozid-F (2,14 mg), salidrozid (3,39 mg), genipozid (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), katalpol (2,39 mg), genipozidna kislina (2,56 mg) in 8-epideoksiloganska kislina (2,34 mg) smo dodali v 10 ml merilno bučko, dodali stalen volumen metanola v merilu in konfigurirali v ustrezno referenčno raztopino koncentracije. Vsak od 100 μL je bil konfiguriran v mešano referenčno raztopino.

Pogoj MS analize: Masna vrednost je bila popravljena pred poskusom in uporabljen je bil način negativnih ionov. Razpon mase je bil 50–1200 Da, vzorec pa je bil vbrizgan s pretočno injekcijsko črpalko. Hitrost stožca je bila 100 L/h, pretok topila je bil nastavljen na 800 L/h. Kapilarna in stožčna napetost sta bili fiksirani na 2500 oziroma 40 V. Temperatura ionskega vira in plina topila je bila 100 stopinj oziroma 400 stopinj, frekvenca pridobivanja signala pa 0,5 S-1.

cistanche kemijskih profilov in metabolita

UPLC-Q-TOF-MSE analiza izvlečka CD

Kromatografske ocene so bile izvedene v sistemu Waters ACQUITY I-CLASS UPLC (Waters Corporation, Milford, MA, ZDA). Vključno s kolono ACQUITY UPLC® BEH C18 (50 × 2,1 mm, 1,7 μm, Waters). Mobilna faza je bila sestavljena iz vode, ki je vsebovala 0,1 odstotka mravljične kisline (A) in acetonitrila, ki vsebuje 0,1 odstotka mravljinčne kisline (B), elucijski pogoj je bil naslednji: 97 do 85 odstotkov A (0–5 min), 85 odstotkov do 75 odstotkov A (5–15 minut), 75 odstotkov do 65 odstotkov A (15–16 minut), 65 odstotkov do 55 odstotkov A (16–18 minut) . Hitrost pretoka je bila 0.3 mL min-1, medtem ko je bila temperatura prostora za samodejno vzorčenje in kolone 30 stopinj in 8 stopinj ločeno. Volumen injekcije je bil 1,0 μL.

Masno spektrometrično vrednotenje je bilo izvedeno prek Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, ZDA), ki je vseboval vir ESI. Hitrost pretoka dušikovega plina je bila fiksirana na 800 L·hrs−1 s temperaturo 400 stopinj, temperatura vira je bila fiksirana na 100 stopinj in stožčasti plin je bil nastavljen na 50 L h−1. Napetost stožca in kapilare je bila ustrezno nastavljena na 40 in 2000 V. Energija trka rampe je bila uporabljena v območju 20–30 V. Centroidni podatki vseh vzorcev so bili pridobljeni od 50 do 1200 Da, s 5-časom skeniranja 0,5 s v času analize 10 minut . LockSpray TM je bil uporabljen za validacijo natančnosti mase. [M–H]– ion levcinskega enkefalina (200 pg·μL–1 hitrost pretoka infuzije 10 μL min–1) pri m/z 554,2615 je bil uporabljen kot masa zaklepa. Programska oprema MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, ZDA) je bila uporabljena za natančno maso, sestavo prekurzorskih ionov in izračun fragmentnih ionov.

Analiza podatkov v platformi Masslynx

Poleg tega je bila na podlagi literature vzpostavljena interna knjižnica, ki vsebuje ime spojine, njeno strukturo in molekulsko formulo (v mol.). Vse spojine smo zapisali v posebno predlogo, izdelano v Excelu. Poleg tega so bile datoteke mol (Chemdraw Ultra 8.0, Cambridge soft, ZDA) in datoteke Excel vseh posameznih struktur spojin shranjene tudi na lokalnem računalniku. Vzpostavljen Excel-list s pomembnimi podatki je bil neposredno uvožen v znanstveno knjižnico v UNIFI.

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Združeno kraljestvo je bil uporabljen za vrednotenje strukturnih značilnosti, zlasti za značilne fragmente in fragmentacijo MS. Za 2D zaznavanje vrhov je bilo nastavljeno najmanjše območje vrha 500. Med razkrivanjem 3D vrhov je bila izbrana nizka energijska konična intenzivnost več kot 300 štetij in povišana energijska konična intenzivnost več kot 80 štetij. Ugotovljeno je bilo, da je napaka mase do ± 10 ppm za znane spojine, toleranca retencijskega časa pa je bila nastavljena v območju ± 0,1 min. Izbrali smo negativne adukte, ki vsebujejo –H in HCOOH. Obdelava neobdelanih podatkov, pridobljenih iz MS, je bila izvedena prek poenostavljene programske opreme UNIFI za hitro določitevkemičnakomponente, ki so izpolnjevale standarde z lastno izdelano bazo podatkov in lastno knjižnico tradicionalne medicine.

Nato preveritekemičnaV strukturi vsake ciljne spojine so se izomeri razlikovali po značilnih vzorcih fragmentacije MS, ki so bili razkriti v poročanih študijah, in s primerjavo retenzijskih časov referenčnih standardov.

Metabolomska analiza na podlagi multivariatne statistične analize

Pred obdelavo neobdelanih podatkov so bili nastavljeni parametri, kot so masa v razponu od 150 do 1200 Da, razpon retencijskega časa (0 do 20 min), intenzivnost praga ( 2000 štetij), masna toleranca, tj. 5 mDa, medtem ko sta bila okno mase in retencijskega časa 0,20 min oziroma 0,05 Da. Na naslednjem seznamu baze podatkov je bil identifikator ionov pari RT-m/z glede na njihove elucijske čase. Enake vrednosti za RT in m/z v različnih serijah vzorcev so bile obravnavane kot ista spojina.

Izvedena je bila multivariatna statistična analiza za ovrednotenje učinkovitih biomarkerjev, ki so znatno prispevali k razlikam med različnimi skupinami. Med analizo je bila uporabljena analiza glavnih komponent (PCA) za prikaz največjih razlik in prepoznavanje vzorcev za pridobitev pregleda in klasifikacije. OPLS-DA je orodje za modeliranje, ki zagotavlja vizualizacijo napovedne obremenitve komponent OPLS-DA za pomoč pri vrednotenju modela. Spremenljivka pomembnosti za projekcijo (VIP) je bila uporabljena za ocenjevanje vrednotenja različnih komponent inmetabolitiwith VIP values >1.0 in P-vrednost< 0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r2/q2="" values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

cistanche kemijskih profilov in metabolita

Poskusi na živalih

Podgane so bile naključno razvrščene v štiri skupine (n = 6 za vsako skupino), čemur je sledilo peroralno dajanje različnih izvlečkov: (1) Slepa kontrolna skupina: podgane so dobile običajno fiziološko raztopino (2 ml/100 g); (2) skupina CD: podgane so dobile ekstrakt CD (2 mL/100 g); (3) skupina CD-NP: podgane so dobile ekstrakt CD-NP (2 ml/100 g); (4) Skupina CD-HP: podgane so dobile ekstrakt CD-HP (2 mL/100 g). Nadaljnja kategorizacija vseh skupin je bila ustrezno izvedena v tri podskupine za plazmo, urin in blato. Dve uri pozneje so vsaki podgani peroralno dali isto in enako količino izvlečkov.

Po dajanju je bil odvzem vzorcev krvi izveden po 1.0 h, 2.0 h in 4.0 h v hepariniziranih 1,5 ml polietilenskih epruvetah (iz orbitalnih ven) , čemur je sledilo centrifugiranje (pri 4500 rpm) vseh vzorcev 15 minut.

Za vzorce urina in iztrebkov so podgane držali v kletkah za presnovo, nato pa zbiranje vzorcev urina in iztrebkov izvajali 24 ur po dajanju. Centrifugiranje vzorcev urina je potekalo pri 4500 obratih na minuto 15 minut, medtem ko so bili vzorci blata posušeni v senci, zmleti v prah, nato vzeti 0,2 g in dodani v 0,5 ml fiziološke raztopine. raztopino, ultrazvok 5 minut in centrifugiranje pri 12,000 rpm 15 minut. Vsi biološki vzorci so bili do analize shranjeni pri -80 stopinjah.

Priprava bioloških vzorcev

Dodatek vzorcev plazme, urina in blata je bil izveden s 3 volumni metanola, čemur je sledilo vrtinčenje 3 minute. Nato je bilo izvedeno centrifugiranje (pri 12,000 rpm) mešanic 10 minut, čemur je sledil prenos supernatanta v EP epruveto in nato posušen z dušikom pri 37 stopinjah. Poleg tega je bil izveden dodatek 200 μL raztopine HCN-H2O (50 odstotkov). Nato je bil vrtinec uporabljen za mešanje (1 min), čemur je sledilo centrifugiranje (pri 12,000 rpm) 5 min. Supernatant (5 μL) obdelanih vzorcev smo vbrizgali v sistem UPLC-Q-TOF-MSE.

Stanje tekočinske kromatografije in masne spektrometrije

Analiza zametabolitiizvedel tudi instrument Waters UPLC prek vmesnika ESI. Ločevanja smo izvedli s kolono Acquity UPLC HSS T3 (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm), mobilna faza je bila 0.1 odstotkov mravljinčne kisline (A): Acetonitril (B), pogoj gradientne elucije je bil 0–3 minute (99,8 odstotka → 98 odstotkov A), 3–5 minut (98 odstotkov → 95 odstotkov A), 5–8 minut (95 odstotkov → 90 odstotkov A), 8 –12 min (90 odstotkov → 85 odstotkov A), 12–17 minut (85 odstotkov → 70 odstotkov A), 17–22 minut (70 odstotkov → 60 odstotkov A), 22–23 minut (60 odstotkov → 58 odstotkov A) , 23–25 min (58 odstotkov A), 25–32 minut (58 odstotkov → 45 odstotkov A) in 32–37 minut (45 odstotkov → 35 odstotkov A), 0,4 ml min-1 je bil pretok. Temperatura za kolono in prostor za vzorce je bila nastavljena na 40 stopinj oziroma 8 stopinj. Uporabljeni so bili zgoraj navedeni pogoji masne spektrometrije.

Strategija sistematične analize metabolitov v bioloških vzorcih

Za obdelavo podatkov je bila uporabljena programska oprema UNIFI (1.8.2). Za identifikacijo učinkovitih metabolitov je bila uporabljena funkcija Binary Compare. Ocenjeni metaboliti niso obstajali v enakovrednem kontrolnem vzorcu ali obstajajo pri nizki intenzivnosti ionov. Prag relativne intenzivnosti je bil nastavljen na 3 ali 5 inmetabolitiki so izpolnjevali podčrtana merila, je bilo mogoče oceniti. Običajno in predvidljivometabolitijih je nato določil EIC. Za iskanje dvofaznih metabolitov je bila uporabljena funkcija NLF. Na primer, v programski opremi UNIFI bi lahko parametre nastavili na 176,0321 za iskanje možnih konjugatov glukuronske kisline. Po obdelavi je mogoče v metodi nastaviti ali identificirati nevtralno izgubo. MassFragment je bil uporabljen za določanje ali karakterizacijo odkritegametaboliti' strukturah je funkcija spektralne interpretacije UNIFI glavna funkcija, ki se uporablja za analizo sekundarne fragmentacije nadrejenih komponent. To funkcijo lahko uporabite za hitro preverjanje, ali je pot fragmentacije smiselna.

cistanche kemijskih profilov in metabolita

Rezultati

Pravilo množične fragmentacije feniletanoidnih glikozidov in iridoidov

Glavni so feniletanoidni glikozidikemičnasestavine CD-ja. Vzete so bile standardne raztopine izoakteozida, cistanozida F, tubulozida A, ehinakozida, akteozida in 2'-aktilakteozida, čemur je sledila zagotovitev drugačne ravni energije trka (tabela 1), nato pa so bile pridobljene ustrezne karte MS2 (slika 1) .

Slika 1 Masni spektrogram in pot cepitve feniletanoidnih glikozidov. A izoakteozid; B cistanozidF; C tubulozidA; D ehinakteozid; E akteozid; F 2'-aktilakteozid

Tabela 1 Energija trka za standardne snovi

Masna spektrometrična analiza je pokazala, da imajo feniletanoidni glikozidi podobne vzorce fragmentacije masnega spektra, poti cepitve v načinu negativnih ionov vključujejo predvsem: (1) cepitev estrske vezi: izguba nevtralne kafeoilne skupine (C9H3O6, 162,03) in nevtralne acetilne skupine (C2H2O). , 42.00); (2) Glikozidna cepitev: izguba nevtralnih ostankov ramnoze (C6H10O4, 146,05) in nevtralnega ostanka glukoze (C6H10O5, 162,05). Iz masne spektrometrije visoke ločljivosti je bilo mogoče razlikovati kofeoil (162,03) in ostanek glukoze (162,05).

Vzeli so standardne raztopine iridoidov ajugola, katalpola, genipozidne kisline, genipozida in 8-epideoksiloganske kisline, čemur je sledilo zagotavljanje različnih energij trkov in pridobljeni so bili ustrezni zemljevidi MS2 (slika 2).

Slika 2 Masni spektrogram in pot cepitve iridoidnih glikozidov. A Ajugol, B katalpol, C genipozidna kislina, D genipozid, E 8-epideoksiloganska kislina

Iridoidni glikozidi imajo podobne vzorce fragmentacije masnega spektra, poti cepitve v načinu negativnih ionov v glavnem vključujejo (1) glikozidno cepitev: izguba nevtralnega ostanka glukoze (C6H10O5, 162,05); (2) Izguba nevtralnega CO2 (43,99) in H2O (18,01).

Identifikacija spojin v ekstraktih CD, CD-NP in CD-HP

UPLC-QTOF-MS E analiza

Izvedena je bila optimizacija kromatografskih pogojev. Nato spojineCistancheHerba je bila ocenjena tako v načinu negativnih kot pozitivnih ionov z visokimi in nizkimi CE. Dobljeni rezultati so pokazali, da je bila združljivost negativnega načina višja glede na pozitivni način za te spojine. Slika 3 prikazuje kromatogram MS z osnovnimi vrhovi ionov (BPI), označen z oštevilčenimi vrhovi. Intenzivnost vsakega zaznanega iona v analizi UPLC-Q-TOF-MSE je bila normalizirana glede na celotno število ionov za generiranje podatkovne matrike, ki je vsebovala vrednost m/z, normalizirano površino vrha in retencijski čas.

Slika 3 Osnovna največja intenzivnost (BPI) vzorcev. 1.CD, 2. CD-NP, 3. CD-HP

Ocenjevanje komponent iz CD-ja in njegovih predelanih produktov na platformi UNIFI

Skupaj 97 spojin je bilo identificiranih z načinom -SEM (n = 6) iz CD-ja in njegovega predelanega produkta (tabela 2), vključno s feniletanoidnimi glikozidi (PhG), iridoidi, lignani in oligosaharidi. Komponente 95, 91 in 94 so bile ustrezno odkrite v CD, CD-NP in CD-HP. Med njimi je bilo 64 feniletanoidov, 13 iridoidov in 20 drugih vrst spojin. Podobnost je bila vkemičnasestava CD-ja in njegovega predelanega proizvoda, vendar je bilo ugotovljeno, da se količina komponent med CD-jem in njegovim predelanim proizvodom razlikuje.

Tabela 2 Vrednotenje spojin, pridobljenih iz CD in njegovih predelanih produktov z UPLC-Q-TOF-MSE

Različice vkemičnasestavine predelanih proizvodov

Za analizo multivariatne podatkovne matrike je bila uporabljena programska oprema Simca-P 13.0. Pred PCA so bile vse spremenljivke srednje centrirane in pareto skalirane, čemur je sledila identifikacija potencialnih diskriminantnih spremenljivk. V grafu rezultatov PCA je vsaka točka pokazala posamezen vzorec. Vzorcev, ki sta pokazala podobnost v svojemkemičnakomponente so bile raztresene ena ob drugi, medtem ko so bile tiste, ki so kazale razlike v svojih komponentah, razdeljene. Kot je razvidno iz PCA (slika 4), je bila skupina CD-HP ločena od skupin CD in CD-NP.

Slika 4 PCA CD-ja in njegovih različnih predelanih izdelkov

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs. 5, 6, 7) The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP >1 in P< 0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Slika 5 OPLS-DA/permutacijski test/S-plot/toplotni zemljevid, ki kaže intenzivnosti potencialnih biomarkerjev med CD-NP in CD-HP spojinami 9, 10, 14, 32, 59, 60, 68, 70, 74, 75, 80, 81, 82 in 84 so diferencialne komponente CD-NP, medtem ko so spojine 11, 15, 16, 45, 48, 66 in 72 diferencialne komponente CD-HP.

Slika 6 OPLS-DA /permutacijski test/ S-plot/toplotni zemljevidi, ki kažejo intenzivnosti učinkovitih biomarkerjev med CD in CD-NP spojinami 13, 15, 16, 37, 49, 63, 66, 72, 74, 75 in 85 so diferencialne komponente CD, medtem ko so spojine 10, 11, 32, 59, 60, 68, 70, 71, 80, 81 in 82 diferencialne komponente CD-NP.

Slika 7 OPLS-DA/permutacijski test/S-plot/toplotni zemljevidi, ki razkrivajo intenzivnosti učinkovitih biomarkerjev med CD in CD-HP spojinami 9, 14, 16, 59, 63, 66, 72, 74, 75, 80, 82 , 84, 85 in 94 so diferencialne komponente CD, 11, 15, 45, 49, 50, 60 in 71 pa diferencialne komponente CD-HP.

Na sliki 8 smo ugotovili intenzivnost akteozida (54), cistanozida C (74), kampneozida II (43), osmantusida (75) in 2'-aktilakteozida (80), ki imajo 4'-O-kafeoilno skupino v 8-O- -D-glukopiranozilni del (glej sliko 9) se je zmanjšal po obdelavi z riževim vinom, medtem ko se je intenzivnost izoacetozida (60), izocistanozida (71), izokampneozida I (69) , izomartinozid (86), ki ima 6'-O-kafeoilno skupino (glej sliko 9), povečano, zlasti za skupino CD-NP. Čeprav ima tubulozid B (72) 6'-O-kafeoilno skupino, enako kot izoakteozid, se je intenzivnost zmanjšala zaradi njegove 2'-aktilne skupine. Povečala se je intenzivnost ehinakozida (38) in cistanozida B, ki imata skupine 6'-O- -D-glukopiranozilnih delov, zmanjšala pa se je intenzivnost tubulozida A (55) tudi zaradi njegove 2'-aktilne skupine.

Slika 8 Intenzivnost predvsem PhG v CD in njegovih predelanih produktih

Slika 9KemičniStrukture predvsem PhG v CD in njegovih predelanih izdelkih.

Naša raziskovalna skupina je preučevala tudi toplotno stabilnost akteozida in izoakteozida in ugotovila, da je akteozid nestabilen v vodi, metanolu in raztopini rumenega riževega vina in ga je mogoče delno pretvoriti v izoakteozid v pogojih segrevanja. Vendar je bila termostabilnost izoakteozida boljša, zlasti v raztopini rumenega riževega vina. Slika 10 prikazuje možne spremembe PhG v CD med obdelavo:

Slika 10 Možna reakcija za PhG med obdelavo

Identifikacija metabolitov pri podganah

Iz podatkov masne spektrometrije visoke ločljivosti je natančna molekulska masa in elementarna sestava zametabolitiin protomolekulske spojine so bile analizirane in primerjane. Ker so iste vrste spojin v TCM pokazale podobnost v presnovnih spremembah, se lahko korelacije fitokemičnih sestavin in vitro razširijo na njihove metabolite in vivo. Medtem so na podlagi običajnih poti biotransformacije sklepali o razumni spremembi molekulske mase. Končno,metabolitiidentificirali z analizo MSE masnih spektrov presnovkov in poti fragmentacije proto-spojin v masnem spektru [21, 22]. V primerjavi s slepim vzorcem so bile njegove komponente identificirane in vivo na podlagi informacij, ki jih je zagotovil kromatogramski masni spekter, možnost presnovne reakcije, značilnosti strukture spojine in pravila fragmentacije njenega masnega spektra. Glej tabelo 3.

Tabela 3 UgotovljenoMetabolitiv plazmi, urinu in blatu vodnega ekstrakta v CD in njegovih predelanih produktih

Identifikacija metabolitov, povezanih s feniletanol glikozidi

Za obdelavo je bila uporabljena platforma UNIFI. Slika 11 prikazuje TIC kromatograf urina, blata in plazme za CD in njegove predelane produkte. V primerjavi s slepimi vzorci je bilo pri podganah identificiranih skupno 54 metabolitov, vključno z 10 prototipnimi komponentami in 44metaboliti, pri čemer jih je bilo 24, 49 in 6 v blatu, urinu in plazmi.

Slika 11 Kromatografija TIC. A vzorec urina v skupini BC; B Vzorec urina v skupini CD; C Vzorec urina v skupini CD-NP; D Vzorec urina v skupini CD-HP; E Vzorec blata v skupini BC; F Vzorec blata v skupini CD; G Vzorec blata v skupini CD-NP; H Vzorec blata v skupini CD-HP; I vzorec plazme v skupini BC; J Vzorec plazme v skupini CD; K Vzorec plazme v skupini CD-NP; M Vzorec plazme v skupini CD-HP

Na podlagi natančne mase, kaskade fragmentacije in predvidljivih nevtralnih izgub z biotransformacijo je skupno 35 feniletanoidnih glikozidov povezanihmetabolitiso bili okvirno ocenjeni. Sorodni presnovki feniletanoidnih glikozidov imajo podobne vzorce fragmentacije masnega spektra, kot tipičen dekafeoilni fragment m/z 461.1605, ki se nato nadalje hidrolizira z glikozidnimi in estrskimi vezmi in vivo ter presnovi v hidroksitirozol (HT) (m/ z 153,0504, C8H10O3, 4,73 min) in kofeinske kisline (CA) (m/z 179,0389, C9H7O4, 0,77 min), glej sliko 12A.

M11 je pokazal [M–H]− pri m/z 153,0504 s formulo tj. C8H10O3 in identificiran kot HT. M16 je predstavljal [M–H]− pri m/z 329,0851, kar je bilo za 176 Da povišano kot pri HT, kar je razkrilo, da je morda glukuronidirani metabolit HT. [M–H]- M26 je bil pri m/z 343,1037, 14 Da višji kot pri HT-glukuronidu. Zato je bil M26 identificiran kot HT-metiliran glukuronid. M17 je bil identificiran kot HT-sulfat na podlagi njegovega [M–H]− pri m/z 233,0112, 80 Da nad HT, ki bi ga bilo mogoče nadalje metilirati, nato pa je proizvedel M22, ki je pokazal m/z 247,0278, kar kaže, da je bil HT-metilirano sulfatiranometabolit. M7 (m/z 167,0335) in M5 (m/z 167,0762) sta bila obravnavana kot oksidacijski produkt oziroma metilirani HT (slika 12B).

M1 je pokazal [M–H]− pri m/z 179,0389, pojasnjena molekulska formula je bila C9H7O4 in identificirana kot kofeinska kislina (CA). M25 je pokazal [M–H]− pri m/z 355,0704, ki je bil za 176 Da povišan kot pri CA, kar kaže, da je morda glukuronidmetabolitCA. M27 je imel m/z 258,994, kar je bilo 80 Da višje od vrednosti CA, zato smo ga razjasnili kot CA sulfat in lahko proizvede M35 (m/z 273,0064). Ker M4 daje [M–H]- pri m/z 193,0524, kar je 14 Da višje od CA, je bil identificiran kot CA metiliran metabolit. M39 je bila dehidroksilacija CAmetabolit, z m/z 163,04, in ga je mogoče sulfatirati v M32 (m/z 242,9951).

M33 (m/z 181.0491, C9H10O4, 9,06 min) je bil redukcijski produkt CA, to je 3,4-dihidroksibenzenpropionske kisline, ki se lahko metilira v M19 (m/z 195,0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 je mogoče dehidroksilirati v M43, to je 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min), in M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) in M29 (m/z 245,0125, C9H10O6S, 8,52 min) so bili glukuronidirani in sulfatirani produkti (slika 12C).

Za feniletanoidne glikozide, povezanemetaboliti, so bile ključne presnovne kaskade presnovne reakcije faze II, tj. glukuronidacija, metilacija in sulfatacija. Predlagane presnovne kaskade feniletanoidov so prikazane na sliki 13.

Sl. 12 Masni spekter nekaterihmetabolitiv CD-jih

Slika 13 Možna presnovna pot feniletanoidov

Identifikacija metabolitov, povezanih z iridoidi

Z analizo elementarne sestavemetaboliti, fragmentacijo MSE in povezano literaturo, je bilo okvirno ovrednotenih skupno 19 metabolitov, povezanih z iridoidom. Iridoidni glikozidi so bili hidrolizirani z glikozidnimi vezmi, da so nastali njihovi ustrezni aglikoni. M/z 185,117 je bil za M8, 162 Da manj kot ajugol, ki je nastal zaradi izgube ostanka glukoze.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) je bil deglikoziliran produkt katalpola. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) je bil manjši od 30 Da deglikoziliranega katalpolametabolit, in je bil identificiran kot odstranitev molekule metabolita CH2O. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), je bila nadaljnja izguba H2Ometabolit.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) je bil deglikoziliran presnovek genipozida, M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) pa deglikozilacija 8-epideoksiloganske kisline. Presnovne reakcije za iridoide bi lahko razkrili kot metabolizem faze I deglikozilacije (slika 12D).

Primerjava presnovnega profiliranja v plazmi, urinu in blatu med CD in njegovimi predelanimi produkti

Primerjali smo 2 prototipa v plazmi, 7 v urinu in 3 v blatu. V CD je bilo 7 prototipov, 7 prototipov v CD-NP in 8 prototipov v CD-HP. M21 je bil odkrit samo v fecesni skupini CD-NP, M38 in M51 pa samo v urinskih skupinah CD-HP. V primerjavi z metaboliti identičnametabolitiv plazmi, urinu in blatu so bili 4, 42 oziroma 21. V skupini CD je bilo absorbiranih 34 metabolitov, 39 v CD-NP in 40 v skupini CD-HP. M5, M7, M40 in M52 so bili odkriti samo v skupinah CD-NP, medtem ko so bili M24, M41 in M48 samo odkriti v skupinah CD-HP.

Opazili so razlike v absorpciji in presnovi aktivnih spojin v različnih predelanih produktih CD. Na sliki 14 smo ugotovili, da je bila intenzivnost HT-sulfatne konjugacije (M17) najvišja v urinu, sledila ji je 3-HPP sulfatna konjugacija (M29), metilirana HT sulfatna konjugacija (M22), dehidroksilirani CA sulfat konjugacija (M32) in konjugacija 3,4-dihidroksi benzenpropionske kisline sulfata (M19). Vsebnost presnovnih produktov v predelani skupini je bila višja kot v skupini CD, predvsem pri M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Njihove prekurzorske spojine, kot je hidroksitirozol, imajo protitumorske, protivnetne, antibakterijske, protivirusne in protiglivične lastnosti [23]. Kofeinska kislina ima protivnetno, protirakavo in protivirusno delovanje [24]. Bilo je skladno s klinično uporabo CD-ja in njegovih predelanih izdelkov.

Diskusija

CD je TCM in njegove glavne bioaktivne sestavine, vključno s PhG, iridoidi in polisaharidi, so bile dokumentirane z različnimi raziskovalnimi študijami. V klinični praksi TKM se predelani produkti CD pogosto uporabljajo v primerjavi s surovimi. Thekemičnasestava se bo med predelavo spremenila, kar lahko povzroči spremembe v zdravilnih učinkih (slika 14).

Slika 14 Intenzivnost glavnegametabolitiv urinu

PhG so vrsta fenolne spojine, za katero je značilna -glukopiranozidna struktura, ki nosi hidroksifeniletilni del kot aglikon. Te spojine pogosto vsebujejo kofeinsko kislino in ramnozo, pritrjeno na glukozni ostanek preko estrske oziroma glikozidne vezi. V trenutni študiji so bile izvedene kvalitativne analize CD, CD-NP in CD-HP in identificiranih je bilo skupno 97 spojin, vključno s feniletanoidnimi glikozidi (PhG), iridoidi itd. Dobljeni rezultati so pokazali razlike vkemičnasestava pred in po obdelavi. Intenzivnost PhG s 4'-O-kafeoilno skupino v 8-O- -D-glukopiranozilnem delu, kot so akteozid, cistanozid C, kampneozid II, osmantusid, se je po obdelavi zmanjšala, medtem ko so PhG s 6 '-O-kafeoilna skupina v 8-O- -D-glukopiranozilnem delu, kot so izoacetozid, izocistanozid, izokampneozid I, izomartinozid, se je povečala, zlasti v skupini CD-NP. Povečala se je tudi intenzivnost ehinakozida in cistanozida B, katerih struktura imata 6'-O- -D-glukopiranozilni del. PhG z 2'-aktilno skupino se je pogosto zmanjšal zaradi reakcije hidroze med procesom, kot je tubulozid B, 2-acetilakteozid.

Preiskava ometabolitiAbsorpcija in vivo je bila izvedena po peroralni uporabi CD-ja in njegovih predelanih produktov. Presnovni procesi faze II so bili ključni kaskadi in večina presnovkov je bilo sulfatnih, glukuronidnih in metiliranih konjugatov. Feniletanolni glikozidi imajo nizko peroralno absorpcijo in izkoristek. Težko se absorbirajo v kri in delujejo kot predniki, ki igrajo svojo vlogo po presnovni aktivaciji in vivo. Feniletanoidi, proizvedeni v feniletanolaglikon, kot sta hidroksitirozin (HT) in kofeinska kislina (CA) ter njen derivat 3-hidroksifenilpropionska kislina (3-HPP), se lahko ti presnovki lažje absorbirajo v plazmo in imajo boljši zdravilni učinek. učinek.

Večino odmetabolitiso bili najdeni v nižjih koncentracijah ali niso bili odkriti v plazmi podgan, vendar so opazili višjo koncentracijo v urinu, kar kaže, da bi se presnovki zlahka izločili z urinom. Kot je prikazano v tabeli 3, so bile iste spojine določene v različnih skupinah, medtem ko so bile ugotovljene precejšnje razlike v koncentracijahmetabolitikar bi lahko bilo povezano z neenako učinkovitostjo CD-ja in njegovih predelanih produktov. HT-sulfatna konjugacija (M17) ima največjo intenzivnost v urinu, sledi 3-HPP sulfatna konjugacija (M29), metilirana HT sulfatna konjugacija (M22), dehidroksilirana CA sulfatna konjugacija (M32) in 3,{{ 7}}dihidroksi benzenpropionska kislina sulfatna konjugacija (M19). Vsebnost presnovnih produktov v predelani skupini je bila višja kot v skupini CD, predvsem pri M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Na splošno so lahko učinkovite komponente, ki imajo visoko izpostavljenost v ciljnih organih. Zadostna količina feniletanoidov in njihovih derivatov je bila ocenjena in določena in vitro. Akteozid je značilna spojina, katere vsebnost se je po obdelavi z riževim vinom zmanjšala, vsebnost izoakteozida, izocistanozida C in izokampneozida I pa se je ustrezno povečala. Razgradne produkte PhG, kot so derivati ​​CA in HT, je mogoče ovrednotiti v bioloških vzorcih, predelava riževega vina pa lahko poveča absorpcijometabolitiin vivo.

Zaključek

V tej študiji je bilo odkritih 97 spojin v izvlečkih CD in njegovih predelanih produktih. Pri povišani temperaturi je prišlo do razgradnje nekaterih glikozidov in posledično so bili sintetizirani nekateri novi izomeri in kompleksi. V študiji in vivo so prototipne komponente (10) inmetaboliti(44) so ​​določili ali okvirno ovrednotili v podganji plazmi, blatu in urinu. Presnovni procesi faze II so bili ključni kaskadi, večinametabolitiso bili povezani z ehinakozidom ali akteozidom, kot sta HT, CA in njuni derivati ​​3-hidroksifenilpropionska kislina 3-HPP. Ti metaboliti se lahko lažje absorbirajo v plazmo in imajo boljši zdravilni učinek. Dobljeni rezultati so pokazali, da jekemičnasestava CD je bila različna in je vplivala na razporeditev spojine in vitro in in vivo.

Dostopnost podatkov in materialov

Nabori podatkov, uporabljeni in/ali analizirani med trenutno študijo, so na razumno zahtevo na voljo pri ustreznem avtorju.

Okrajšave

PhG: feniletanoidni glikozidi

CD:Cistanche deserticola

CMM: Kitajska Materia Medica

TKM: Tradicionalna kitajska medicina

CD-NP:Cistanche deserticolaObdelano s parjenjem z riževim vinom pod normalnim pritiskom

CD-HP:Cistanche deserticolaObdelano s parjenjem z riževim vinom pod visokim pritiskom

UPLC-Q-TOF-MSE: Tekočinska kromatografija ultra visoke ločljivosti skupaj s TOF-MSE

PCA: Analiza glavnih komponent

VIP: spremenljiv pomen za projekcijo

CA: kofeinska kislina

HA: hidroksitirozol

Študija cistanche kemijskih profilov in metabolita

Reference

1. Komisija za kitajsko farmakopejo. Farmakopeja Ljudske republike Kitajske, vol. I. Peking: China Medical Science Press; 2020. str. 140.

2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. HerbaCistanche(Rou Cong-Rong): eno najboljših farmacevtskih daril tradicionalne kitajske medicine. Front Pharmacol. 2016; 7:41.

3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Učinki različnih načinov obdelave sušenja za FreshCistanche deserticolana vsebino njegovih sestavnih delov. J Chin Med Mater. 2020; 10: 2414–8.

4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimizacija postopka parjenja pod visokim pritiskom za Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019; 11: 2576–80.

5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. UčinkiCistanchesherba pred in po predelavi na funkcijo proti staranju in imunsko funkcijo starajočih se podgan, ki jih povzroča D-galaktoza. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11: 2882–2885.

6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Študija odvajalnih sestavin v Cistanche deserticola YC Ma. Modern Chin Med. 2015; 17 (4): 307–10.

7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Študija o nevroendokrini imunski funkcijiCistanche deserticolain njegovi izdelki za kuhanje riževega vina v modelu podgan, ki ga povzročajo glukokortikoidi. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;22:5321976.

8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Izboljšanje poživitvene funkcije ledvic v modelu miši z rastlino Cistanches herba, hitro posušeno pri srednje visoki temperaturi. J Med Hrana. 2019; 22 (12): 1246–53.

9. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Puščavski ginseng": pregled. Am J Chin Med. 2012; 40 (6): 1123–41.

10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: Pregled njegove kemije, farmakologije in farmakokinetične lastnosti. J Etnofarmakol. 2018; 219: 233–47.

11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. HerbaCistanche(Rou Cong Rong): pregled njegove fitokemije in farmakologije. Chem Pharm Bull. 2020; 68 (8): 694–712.

12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Nevroprotektivni učinki ehinakozida v mišjem MPTP modelu Parkinsonove bolezni. Eur J Pharmacol. 2007; 564: 66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Zaščitni učinek tubulozida B na apoptozo, ki jo povzroča TNF alfa v nevronskih celicah. Acta Pharmacol Sin. 2004; 25 (10): 1276–84.

14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Protivnetni iridoidi iz stebelCistanche deserticolagojen v puščavi Tarim. Chin J Nat Med. 2016; 14 (1): 61–5.

15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Feniletanoidni glikozidi s protivnetnimi aktivnostmi iz stebel Cistanche deserticola, gojenih v puščavi Tarim. Fitoterapija. 2013; 89: 167–74.

16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoidni in aciklični monoterpenski glikozidi, kankanozidi L, M, N, O in P izCistanchetubuloza. Chem Pharm Bull. 2010; 58 (10): 1403–7.

17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. Nova strategija za hitro raziskovanje potencialakemičnaoznačevalci za razlikovanje med surovim in predelanim Radix Rehmanniae z UHPLC-TOF-MS z multivariatno statistično analizo. J Pharm Biomed Anal. 2010; 51 (4): 812–23.

18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Spremembe ravni feniletanoidnih glikozidov, antioksidativne aktivnosti in drugih kakovostnih lastnosti vCistanche deserticolarezine s parno obdelavo. Chem Pharm Bull. 2016; 64: 1024–30.

19. Ma ZG, Tan YX. Spremembe vsebine šestih feniletanoidnih glikozidov med kuhanjem na pari z vinom v Desertliving Cistanche. Chin Trad Patent Med. 2011;33(11):1951–4.

20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Vpliv postopka parjenja na kakovost po žetvicistanche deserticolaza medicinsko uporabo med sušenjem na soncu. Biol Pharm Bull. 2016; 39 (12): 2066–70.

21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W.Metabolitiprehranskega akteozida: profili, izolacija, identifikacija in hepatoprotektivne sposobnosti. J Agric Food Chem. 2018; 66 (11): 2660–8.

22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Sistematična karakterizacijametabolitiehinakozida in akteozida izCistanchetubulosa v podganji plazmi, žolču, urinu in blatu na podlagi UPLC-ESI-Q-TOF-MS. Biomed Chromatogr. 2016; 30 (9): 1406–15.

23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroxytyrosol: naravna spojina z obetajočimi farmakološkimi aktivnostmi. J Biotechnol. 2020; 309: 29–33.

24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Kofeinska kislina, vsestranski farmakofor: pregled. Mini Rev Med Chem. 2011; 11 (8): 695–713.