Cistanche Tubulosa inducira z reaktivnimi kisikovimi vrstami posredovano apoptozo primarnih in metastatskih človeških celic raka debelega črevesa

UVOD

Kolorektalni rak je eden najpogostejših rakov na svetu (Brenneret al., 2014), njegova incidenca pa nenehno narašča z ocenjenimi 2,4 milijoni primerov leta 2035 zaradi sodobne prehrane in načina življenja ter zmanjšane telesne dejavnosti. Sedanja prizadevanja ne zadoščajo za boj proti sedanji epidemiji raka debelega črevesa in danke, zato so potrebni novi pristopi za učinkovito preprečevanje in zdravljenje, vključno s spremembami življenjskega sloga v kombinaciji z varnejšimi alternativnimi posegi, kot je npr.Fitoterapevtiki (Weidneret al., 2015). Fitoterapija, uporaba zdravilnih rastlin za zdravljenje bolezni, je bila neizogiben del starodavne človeške zgodovine. Zdravilne rastline se že dolgo uporabljajo kot alternativni viri zdravljenja raka in predstavljajo več kot šestdeset odstotkov zdravil proti raku, ki se uporabljajo v konvencionalni medicini (Balunas in Kinghorn, 2005; Saibuet al., 2015). Nekateri najbolj znani primeri vključujejo izvlečke izCatharanthus roseusG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) in Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg in Newman, 2005; da Rochaet al., 2001). Izkazalo se je, da ima več zeliščnih izvlečkov in fitokemikalij protitumorske učinke pri raku debelega črevesa in danke, kar se pripisuje indukciji proizvodnje reaktivnih kisikovih vrst (ROS) in s tem povezani apoptozi rakavih celic, kot v primeru izvlečkov izMelissa officinalis(Weidneret al., 2015)

Med fitoterapevtskimi kandidati,Cistanche tubulosa, parazitska puščavska rastlina Orobanchaceae (Jiang et al., 2009), ki je široko razširjena v sušnih in polsušnih regijah Afrike, Azije in Sredozemlja, ima dokazano dragocene zdravilne lastnosti. Cistanche tubulosa se v veliki meri uporablja v tradicionalni medicini in domneva se, da ima zdravilne učinke pri odpovedi ledvic, boleči levkoreji, metroragiji, ženski neplodnosti in senilnem zaprtju (Jiang et al., 2009). Poleg tradicionalnih medicinskih uporab ima pomembno medicinsko Lastnosti Cistanche Tubulosa so bile v zadnjem desetletju intenzivno raziskane, vključno z vazorelaksantnimi (Yoshikawa et al., 2006), hepatoprotektivnimi (Morikawa et al, 2010), antihiperglikemičnimi in hipolipidemičnimi učinki (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa je bil predlagan tudi kot močan ojačevalec imunskega sistema, spodbujevalec tvorbe kosti ter sredstvo proti staranju in utrujenosti (Xu et al., 2014). Poleg tega se je pokazalo, da izvleček Cistanche tubulosa blokira odlaganje amiloida v modelu Alzheimerjeve bolezni (Wu et al., 2015). Kljub različnim terapevtskim uporabam učinek Cistanche Tubulosa kot potencialnega sredstva proti raku še ni raziskan.

V tem delu smo raziskali protirakav učinek Cistanche Tubulosa na dve primarni in dve metastatski celični liniji raka debelega črevesa ter možne mehanizme, na katerih temelji ta učinek.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIALI IN METODE

Zbiranje in priprava rastlinskega izvlečka

Vzorci Cistanche tubulosa so bili zbrani v puščavskih območjih v Katarju leta 2014 in pristnost rastline je potrdil herbatolog. Vzorci vavčerjev so arhivirani na Toksikološkem in večnamenskem oddelku ADLQ. Na soncu posušene vzorce rastlin smo zmleti z Retsch Knife Mill Grindomix GM300 v fin prah. Dvajset gramov praška smo čez noč ekstrahirali z 200 ml ultra čiste vode pri 37 stopinjah na rotacijskem stresalniku pri 200 obratih na minuto. SurovoIzvlečki Cistanche tubulosa (CTE)smo centrifugirali 3 0 min pri 8000 obratih na minuto, da so se netopne spojine obložile, supernatant smo zbrali in liofilizirali s sušilnikom za zamrzovanje Labconco Freezone 6 plus. Posušen ekstrakt je bil rekonstituiran v Dulbeccovem modificiranem Eagle's Medium (DMEM, SIGMA, Nemčija) do koncentracije 20 mg/mL in sterilno filtriran skozi 0.2-mikronski membranski filter.

Celične linije in vzdrževanje celic

Celične linije človeškega karcinoma debelega črevesa CaCo2, SW620 in LoVo so bile pridobljene pri Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Nemčija), medtem ko je bila celična linija HCT 116 prijazno darilo oddelka za biološke in okoljske znanosti na katarski univerzi. CaCo2 in HCT11 sta bila pridobljena iz primarnega mesta karcinoma debelega črevesa, medtem ko sta bila SW620 in LoVo pridobljena iz metastatskega mesta. Celice SW620, HCT116 in LoVo smo gojili in vzdrževali v mediju DME, medtem ko smo celice CaCo2 vzdrževali v Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM, SIGMA, Nemčija). Celice smo gojili kot enoplastno gojene pri 37 stopinjah v ustreznem mediju, dopolnjenem z 10 % fetalnega govejega seruma (FBS, SIGMA, Nemčija) in 1 % penicilina/streptomicina (SIGMA, Nemčija) v vlažni atmosferi, ki je vsebovala 5 % ogljikovega dioksida.

Test viabilnosti celic

Za oceno citotoksične aktivnosti CTE podobno kot je opisano prej (Jaganjac et al., 2010). Gostota sejanja celic CaCo2, HCT116, SW620 in LoVo, gojenih v 96-ploščah z vdolbinicami, je bila 104 celice na vdolbinico. Celice smo nasadili v ustrezen medij, dopolnjen z 10 % FBS 24 ur pred obdelavo. Po 24 urah smo medij odstranili in celice obdelali z 0, 0,25, 0,5, 1 in 2 mg/mL CTE 24, 48 in 72 ur pri 37 stopinjah v vlažni atmosferi, ki je vsebovala 5 % CO2. Po obdelavi s CTE smo medij odstranili in v vsako vdolbino dodali 40 µL raztopine MTT (0,5 mg/mL).

Po 3 urah inkubacije smo raztopino MTT odstranili, produkt formazana raztopili v dimetilsulfoksidu (DMSO, SIGMA, Nemčija) in izmerili absorbanco pri 590 nm z bralnikom mikroplošč (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Švica) .

Test apoptoze

Apoptozo v celicah CaCo2, HCT116, SW620 in LoVo smo odkrili s kompletom za odkrivanje apoptoze PE Aneksin V I z 7-amino-aktinomicinom D (7-AAD) kot vitalnim barvilom (Becton Dickinson International, Belgija) v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko, celice so bile posejane v 24-plošče z vdolbinicami z gostoto 5×104 celic/vdolbinico v ustreznem mediju, dopolnjenem z 10 % FBS, 24 ur pred dodatkom CTE (0, 0,5 ali 1 mg/ml). Po inkubaciji 24 CTE so bile celice pobrane, dvakrat sprane s hladno fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom in obarvane s fikoeritrinom (PE) aneksinom V in 7-AAD 15 minut pri sobni temperaturi v temi. Obarvane celice so bile analizirane v 1 uri s pretočno citometrijo z uporabo FACS. Pretočni citometer Aria III in programska oprema FACSDiva (Becton Dickinson) pri nizkem pretoku z najmanj 104 celicami. Kot pozitivno kontrolo za test smo uporabili 4-urno obdelavo celic s 6 µM kamptotecina (SIGMA).

Intracelularna proizvodnja ROS

Znotrajcelično proizvodnjo ROS smo preučevali z uporabo 2,7- diklorodihidrofluorescein diacetata (DCFH-DA, SIGMA, Nemčija). DCFH-DA je nefluorescentna sonda, ki je oksidirana z znotrajceličnim ROS v fluorescenčno spojino 2,7- diklorofluorescein (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). Test DCFH DA smo izvedli podobno, kot smo opisali prej (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Na kratko, gostota sejanja celic CaCo2, HCT116, SW620 in LoVo, gojenih v 96-črnih ploščah z vdolbinicami, je bila 104 celice na vdolbinico. Celice smo nasadili v ustrezni medij, dopolnjen z 10 % FBS, za 24 ur. Pred obdelavo smo celice inkubirali z 10 µM DCFH-DA pri 37 stopinjah 30 minut v 5 % CO2/95 % zraku. Celice smo nato sprali in obdelali z 0, 0,5 in 1 mg/mL CTE v mediju brez fenol rdečega. Znotrajcelično tvorbo ROS smo spremljali neprekinjeno 25 ur pri 37 stopinjah in 5 % CO2 z uporabo bralnika mikroplošč z zgornjim modulom za nadzor fluorescence in plina (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Švica). Intenzivnost fluorescence je bila izmerjena z valovno dolžino vzbujanja 500 nm in detekcijo emisij pri 529 nm. Poljubne enote, relativne enote fluorescence (RFU), so temeljile neposredno na intenzivnosti fluorescence.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE DELOVANJA LEDVIC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Nastajanje mitohondrijskega superoksida

Sposobnost CTE, da inducira nastajanje superoksida v mitohondrijih, je bila ocenjena z uporabo za celice prepustne, na mitohondrije usmerjene sonde MitoSOX Red (Life Technologies) in Hoechst 33342 za jedrsko obarvanje (Life Technologies). CaCo2, HCT116, SW620 in LoVo celice so bile zasejane v 96-plošče z vdolbinicami z gostoto 104 celic na vdolbino v ustreznem mediju, dopolnjenem z 10 % FBS, za 24 ur . Celice smo nato za 20 minut naložili s 4 µM MitoSOX in 2 µM Hoechst 33342, odvečno barvilo sprali in vdolbinice obdelali z 0, 0,5 in 1 mg/mL CTE 24 ur pri 37 stopinjah in 5 % CO2. Intenzivnost fluorescence je bila izmerjena z valovno dolžino vzbujanja 510 nm in detekcijo emisije pri 580 nm za MitoSOX ter valovno dolžino vzbujanja 350 nm in detekcijo emisije pri 461 nm za Hoechst 33342 z uporabo bralnika mikroplošč z najvišjo fluorescenco (Infinite 200 PRO, Tecan Trading). AG, Švica)

Statistična analiza

Opisna statistika je bila prikazana kot povprečje +/− SD. Pomembnost razlik med skupinami smo ocenili s Studentovim t-testom in hi-kvadrat testom. Ko smo primerjali več kot dve skupini, smo uporabili enostransko ANOVA z ustreznim post hoc testiranjem. Uporabljen je bil SPSS 11.01 za Mircosoft Windows. Razlike s P manj kot 0,05 so veljale za statistično pomembne.

REZULTATI

Učinek CTE na proliferacijo celičnih linij človeškega raka debelega črevesa je prikazan na sliki 1. Vse testirane koncentracije CTE so pokazale močan zaviralni učinek na celično linijo CaCo2 v odvisnosti od koncentracije in časa (slika 1A). Dvainsedemdeseturno zdravljenje s CTE je zaviralo rast celic CaCo2 za več kot 60% v primerjavi s kontrolo (p < 0.05 za vse koncentracije). Pomemben vpliv zdravljenja s CTE na rast celic HCT116 je bil zaznan tudi v vseh časovnih točkah pri dveh najvišjih koncentracijah (1 mg/mL in 2 mg/mL), pri čemer je pri zadnji koncentraciji dosegel več kot 70% zmanjšanje (slika 1B, p < 0,05). Čeprav sta dve nižji koncentraciji CTE (0,25 in 0,5 mg/mL) pomembno zmanjšali rast celic HCT116 po 24 urah (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). Od časa in koncentracije odvisno zaviranje proliferacije s CTE je bilo dodatno potrjeno v celicah LoVo za več kot 60% pri najvišji koncentraciji (p < 0.05) (slika 1C), in vse štiri testirane koncentracije CTE so zmanjšale rast celic SW620 po 48 urah (slika 1D, p < 0.05 za vse). Po 72 urah zdravljenja so enak učinek opazili le pri dveh najvišjih koncentracijah (p < 0,05), medtem ko koncentraciji 0,25 in 0,5 mg/mL nista pokazali pomembnega učinka v primerjavi s kontrolo (p > 0,05). Vpliv zdravljenja z 0,5 in 1 mg/ml CTE na indukcijo apoptoze je bil dodatno testiran na vseh štirih celičnih linijah (slika 2). V HCT116 in LoVo so po 24--urnem zdravljenju z 0,5 mg/mL odkrili povečano število celic v zgodnji apoptozi (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Slika 1:UčinekCistanche tubulosao sposobnosti preživetja celičnih linij raka debelega črevesa. Viabilnost celic, izmerjena s testom MTT celic (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo in (D) SW620, je predstavljena kot odstotek kontrolne nezdravljene celične linije raka debelega črevesa. Podane so srednje vrednosti (±SD) za 5 ponovitev reprezentativnega poskusa: (*) signifikantnost p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Slika 2: Vodni izvleček Cistanche tubulosa inducira apoptozo v človeških rakavih celicah debelega črevesa. Analize pretočne citometrije Annexin-V-FITC celic (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo in (D) SW620 so predstavljene kot odstotek kontrolne nezdravljene celične linije raka debelega črevesa. Podane so srednje vrednosti (±SD) za 3 ponovitve reprezentativnega poskusa: (*) signifikantnost p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Slika 3: Vodni izvleček Cistanche tubulosa inducira znotrajcelično proizvodnjo ROS v odvisnosti od časa in odmerka. Proizvodnja ROS, izmerjena s testom DCFH-DA v celicah (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo in (D) SW620, je predstavljena kot povprečne vrednosti RFU (±SD) za ustrezne 5-podvojitve reprezentativen poskus. (*) Pomen str<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Slika 4: Vodni izvleček Cistanche tubulosa inducira proizvodnjo mitohondrijskega superoksida v človeških rakavih celicah debelega črevesa. Intenzivnost fluorescence mitohondrijsko usmerjene sonde MitoSOX Red v celicah A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo in (D) SW620 je predstavljena kot odstotek kontrolne nezdravljene celične linije raka debelega črevesa. Podane so srednje vrednosti (±SD) za 5 ponovitev reprezentativnega poskusa: (*) signifikantnost p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DISKUSIJA

Čeprav so prejšnje študije poročale o številnih zdravilnih lastnostih Cistanche tubulosa, je to prvo poročilo o njenem antiproliferativnem učinku na maligne celice. Bioaktivne spojine Cistanche tubulosa, ekstrahirane z vodo, zelo polarnim topilom, so pokazale močno bioaktivnost proti raku. Pred tem smo primerjali učinkovitost Cistanche tubulosa, raztopljenega v vodi, proti drugim topili, kot sta metanol in etil acetat, vendar so vodni izvlečki pokazali najbolj obetavne protirakave aktivnosti (podatki niso prikazani).

Dokazali smo sposobnost CTE pri 1 mg/mL in 2 mg/mL, da zavira 60 % rasti primarnih in metastatskih celičnih linij raka debelega črevesa, kar razkriva potencialno pomembno vlogoCistanche tubulosakot zdravljenje raka debelega črevesa. V primerjavi z normalnimi celicami je za rakave celice na splošno značilna motnja v redoks homeostazi in običajna strategija trenutnih terapij proti raku je povečanje celičnega oksidativnega stresa (Yang et al, 2013). Čeprav imajo fiziološko nizke ravni ROS pomembno vlogo kot signalne molekule, lahko prekomerna proizvodnja ROS prispeva k nestabilnosti in malignosti raka (Liou in Storz, 2010). Paradoksalno je, da to neravnovesje v celični redoks homeostazi povzroči, da so rakave celice bolj ranljive za celično smrt, ki jo povzroči ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira in Hay, 2013). Protiproliferativni učinek CTE, o katerem so poročali v tej študiji, je lahko posredovan z različnimi zunajceličnimi in znotrajceličnimi mehanizmi znanih in neznanih spojin v ekstraktu, usmerjenih na več poti, ki igrajo bistveno vlogo pri apoptozi. Da bi razlikovali med različnimi načini celične smrti, smo raziskali potencialni mehanizem, ki je odgovoren za opaženo citotoksičnost, ki jo povzroča CTE.

IZVLEČEK CISTANCHE TUBULOSA Proti Alzhermerjevi bolezni PHGS 75 % ECH 30 % ACT 12 %

Naši podatki kažejo, da CTE poveča znotrajcelično proizvodnjo ROS in posledično celično smrt, ki jo povzroči ROS. Redox stanje celice ima prav tako ključno vlogo pri uravnavanju apoptoze in mitohondrijska transportna veriga elektronov je eno od glavnih mest celične generacije ROS (Trachootham et al., 2008). Poleg tega lahko intracelularni ROS povzroči celično apoptozo prek poti, odvisnih od mitohondrijev, in neodvisnih (Sinha et al., 2013). Naši podatki dejansko tudi kažejo, da je eksternalizacija fosfatidilserina, ki jo povzroči CTE, pogost učinek pri apoptozi, tako v primarnih kot metastatskih celičnih linijah raka, kar kaže, da mehanizem smrti, ki jo povzroči CTE, posreduje apoptoza in ne nekroza. Aktivacija apoptoze v rakavih celicah je korektivna strategija in mnoga zdravila proti raku imajo lahko apoptotične učinke v rakavih celicah.

Spojine ali izvlečki s pro-apoptotičnim delovanjem v rakavih celicah so torej potencialno uporabni pri raziskavah zdravil proti raku (Wong, 2011). Da bi ugotovili, ali pro-apoptotični učinek, ki ga povzroča CTE, posreduje mehanizem ROS, ki ga povzroča mitohondriji, smo izmerili proizvodnjo superoksida z uporabo fluorescentne sonde, usmerjene v mitohondrije, v celicah, obdelanih s CTE. Naši podatki jasno kažejo, da CTE stimulira proizvodnjo mitohondrijskega superoksida, kar kaže na to, da je aktivnost proti raku Cistanche tubulosa vsaj delno posredovana z mehanizmom ROS, ki ga povzročajo mitohondrije.

SKLEPI

Naši podatki na koncu kažejo, da lahko vodni izvleček puščavske rastline Cistanche tubulosa predstavlja obetavnega kandidata za pristop proti raku v kombinaciji z drugimi običajnimi terapijami za preprečevanje in zdravljenje raka debelega črevesa. Dokazujemo tudi, da je toksičnost rastlinskega izvlečka proti rakavim celicam posredovana s povečano intracelularno produkcijo ROS in, vsaj delno, z mitohondrijsko odvisno apoptozo. Nadaljnje študije potekajo za izolacijo in karakterizacijo posameznih biološko aktivnih sestavin, odgovornih za delovanje proti raku.

Potrebnih je več raziskav, da bi ocenili potencialno uporabo tega izvlečka kot učinkovitega kemopreventivnega sredstva in razumeli mehanizme delovanja na rakave celice debelega črevesa na molekularni ravni. Potrebne so tudi nadaljnje predklinične in klinične študije za potrditev opaženih koristnih učinkov na zdravjeCistanche tubulosa za preprečevanje raka.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE COFFE IZBOLJŠA SPOMIN PROTI UTRUJENOSTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%