Izvleček Cistanche Deserticola poveča tvorbo kosti v osteoblastih--I. del

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^aet a

Povzetek
Cilji Raziskali smo učinekCistanchedeserticolaMa. (CD) vklopljenkostnastaneks kultiviranimi osteoblasti. Metode Test tvorbe mineraliziranih nodulov je bil uporabljen za preučevanje učinkov CD in vitro(Cistanchedeserticola)nakostnastanek. Ekspresija mRNA alkalne fosfataze (ALP), kostnih morfogenetskih proteinov (BMP) -2 in osteopontina (OPN) je bila analizirana s kvantitativno verižno reakcijo polimeraze v realnem času. Mehanizem delovanja CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt je bil raziskan z uporabo Western blottinga. Anti-osteoporotični učinek CD in vivo(Cistanchedeserticola)ekstrakta so ocenili pri miših z ovariektomijo.
Ključne ugotovitve

CD(Cistanchedeserticola)izvleček ni vplival na proliferacijo, migracijo ali celjenje ran gojenih osteoblastov, povečal pa je ALP, BMP-2 in OPN mRNA ter mineralizacijo kosti. Mitogen-aktivirana protein kinaza (MAPK) ali zaviralci jedrskega faktorja (NF)-kB so zmanjšali CD(Cistanchedeserticola)povzročeno z izvlečkitvorba kostiin izraz ALP, BMP-2 in OPN. Vendar CD(Cistanchedeserticola)izvleček ni vplival na osteoklastogenezo. Poleg tega CD(Cistanchedeserticola)izvleček preprečil izgubo kosti, ki jo je povzročila ovariektomija in vivo.
Sklepi

CD(Cistanchedeserticola)je lahko romantvorba kostisredstvo za zdravljenje osteoporoze.

Ključne besedetvorba kosti; Cistanchedeserticola; kitajsko zelišče; osteoblasti

Cistanche deserticolaje dobro zatvorba kosti

Uvod

Kost je kompleksno tkivo, sestavljeno iz več vrst celic, ki so podvržene neprekinjenemu procesu obnavljanja in popravljanja, imenovanemu "preoblikovanje kosti". Dve glavni vrsti celic, ki sta odgovorni za preoblikovanje kosti, sta osteoklasti, ki resorbirajo kost, in osteoblasti, ki tvorijo novo kost. Preoblikovanje kosti uravnavajo številni sistemski hormoni (npr. obščitnični hormon, 1, 25-dihidroksi vitamin D3, spolni hormoni in kalcitonin) in lokalni dejavniki (npr. dušikov oksid, prostaglandini, rastni faktorji in citokini).[1] Osteoporoza se pojavi, ko sta resorpcija in tvorba kosti neusklajeni in prekomerna razgradnja kosti presega izgradnjo kosti.[2] Trenutno zdravljenje osteoporoze vključuje bisfosfonate, kalcitonin in estrogen, ki so zaviralci resorpcije kosti, ki ohranjajo kostno maso z zaviranjem aktivnosti osteoklastov.[3] Vendar pa je učinek teh zdravil na povečanje ali okrevanje kostne mase razmeroma majhen, vsekakor ne več kot 2 odstotka na leto.[3] Zato obstaja potreba po sredstvih za izgradnjo kosti, kot je teriparatid, ki spodbujajo novokostnastanekin popraviti spremembo trabekularne mikroarhitekture, ki je značilna za ugotovljeno osteoporozo.[4,5] Ker je novakostnastanekje primarno funkcija osteoblastov, sredstva, ki delujejo tako, da povečajo proliferacijo celic osteoblastne linije ali inducirajo diferenciacijo osteoblastov, lahko povečajo tvorbo kosti [5,6].
Čeprav mehanizmi osteoporoze ostajajo nejasni, so verjetno povezani z zmanjšano razpoložljivostjo ali učinki faktorjev rasti kosti, kot so kostni morfogenetski proteini (BMP).[7] BMP, ki so strukturno povezani s superdružino transformirajočega rastnega faktorja-b, so bili prvotno identificirani po njihovi sposobnosti induciranja ektopičnegakost nastanekpri glodavcih.[8] BMP imajo pomembno vlogo prikostnastanekin diferenciacijo kostnih celic s spodbujanjem aktivnosti alkalne fosfataze (ALP) kot tudi sintezo proteoglikana, kolagena in osteopontina (OPN).[9] Nedavna študija je odkrila povezavo med osteoporozo in specifičnimi polimorfizmi v genih BMP-2, ALP in OPN, kar nakazuje, da so povezani z razvojem osteoporoze.[10]

CistanchedeserticolaMa. (Orobanchaceae; skrajšano CD)(Cistanchedeserticola)je avtohtona rastlina na Kitajskem in se pogosto uporablja v tradicionalni medicini kot terapevtsko sredstvo zaradi svojih sedativnih, analgetičnih in imunostimulacijskih lastnosti.[11] Sodobne farmakološke študije so pokazale, da CD(Cistanchedeserticola)izvlečki lahko stimulirajo imunost [12], lovijo proste radikale [13] in povečajo aktivnost superoksid dismutaze.[14] Protivnetna in antioksidativna sredstva imajo potencial za zdravljenje osteoporoze s povečanjemkost nastanekin/ali zaviranje resorpcije kosti [15,16] Vendar učinek CD(Cistanchedeserticola)na delovanje kostnih celic še ni bilo ugotovljeno. Tukaj poročamo o CD-ju(Cistanchedeserticola)izvleček ni vplival na proliferacijo, migracijo ali aktivnost celjenja ran gojenih osteoblastov, je pa povečal izražanje ALP, BMP-2 in OPN ter mineralizacijo kosti. Poleg tega smo pokazali, da so lahko signalne poti mitogen-aktivirane proteinske kinaze (MAPK) in jedrskega faktorja (NF)-kB vključene v povečanje izražanja genov in mineralizacije kosti, ki ga posreduje CD. Nasprotno pa CD(Cistanchedeserticola)izvleček ni zaviral osteoklastogeneze in vitro. Predvsem zdravljenje miši s CD(Cistanchedeserticola)izvleček je preprečil izgubo kosti, povzročeno z ovariektomijo in vivo. Naši podatki torej kažejo, da je CD(Cistanchedeserticola)se lahko uporablja za stimulacijokostnastanekza zdravljenje osteoporoze.

Cistanche deserticolaokrepiti imuniteto

Materiali in metode

Izvleček in materiali Cistanche deserticola

CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt je bil kupljen pri Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Tajvan). Ekstrakcija in izolacija CD-ja(Cistanchedeserticola)so sledili, kot je opisano prej (na podlagi spektralnih podatkov so identificirali kemično sestavo, vključno z beta-sitosterolom, daukosterolom, jantarno kislino, triakontanolom, akteozidom, betainom in polisaharidom).[17] Kunčja poliklonska protitelesa, specifična za p-ekstracelularne signalno regulirane kinaze (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminalne kinaze (JNK), JNK, p-p65 in p65, so bila kupljena pri Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, ZDA). Komplet osteokalcin ELISA je bil kupljen pri Biosource Technology (Nivelles, Belgija). C-terminalni telopeptidi kompleta kolagena tipa I ELISA so bili pridobljeni pri Cross Laps (Herlev, Danska). Dominantno negativni mutant p38 je zagotovil dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, ZDA). Dominantno negativni mutant JNK je zagotovil dr. M. Karin (Univerza v Kaliforniji, San Diego, ZDA). Dominantno negativni mutant ERK2 je zagotovil dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Vsi drugi reagenti so bili pridobljeni pri Sigma-Aldrich (St Louis, ZDA).

Kultura celic

Mišja celična linija osteoblastov MC3T3-E1 je bila kupljena pri American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, ZDA). Celice smo gojili v 95 odstotkih zraka, 5 odstotkih CO2 z a-MEM, ki je bil dopolnjen z 20 mm HEPES in 10 odstotki toplotno inaktiviranega fetalnega telečjega seruma, 2 mm glutamina, penicilina (100 U/ml) in streptomicina (100 mg). /ml).

Merjenje tvorbe mineraliziranih nodulov

Tvorba mineraliziranih nodulov je bila ovrednotena, kot je opisano.[18] Na kratko, osteoblaste smo gojili v mediju, ki je vseboval vitamin C (50 mg/ml) in b-glicerofosfat (10 mm) dva tedna, medij pa smo menjali vsake tri dni. Po inkubaciji s CD(Cistanchedeserticola)ekstrakta 12 dni, smo celice dvakrat sprali z 20 mm tris-pufrano slanico, ki je vsebovala 0,15 m NaCl (pH 7,4), fiksirali v ledeno mrzlem 75-odstotnem (v/v) etanolu 30 minut in zračno posušeno. Odlaganje kalcija je bilo določeno z barvanjem alizarin rdeče-S. Na kratko, celice in matriks, fiksirane z etanolom, smo 1 uro obarvali s 40 mm alizarin rdečim-S (pH 4,2) in izdatno spirali z vodo. Vezano barvilo smo eluirali z 10 odstotki (m/v) cetilpiridinijevega klorida in alizarin rdeče-S v vzorcih kvantificirali z merjenjem absorbance pri 550 nm in primerjali s standardno krivuljo. En mol alizarin rdečega-S selektivno veže približno dva mola kalcija.

Cistanche deserticolaje dobro zatvorba kosti

Kvantitativna verižna reakcija polimeraze v realnem času

Celotno RNA smo ekstrahirali iz osteoblastov z uporabo kompleta TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Tajvan). Reverzna transkripcija je bila izvedena z uporabo 2 mg celotne RNA in oligo(dT) primerja [19,20] Kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (qPCR) v realnem času smo izvedli z uporabo TaqMan® enostopenjske PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, ZDA). Dodali smo skupno cDNA (100 ng na 25-ml reakcije) s primerji, specifičnimi za zaporedje, in sondami Taqman®. Vsi primerji ciljnih genov in sonde so bili komercialno kupljeni, vključno z b-aktinom kot notranjim nadzorom (Applied Biosystems). Testi qPCR so bili izvedeni v treh izvodih na sistemu za odkrivanje zaporedja StepOnePlus (Applied Biosystems). Pogoji cikla so bili 10-minutna aktivacija polimeraze pri 95 stopinjah, čemur je sledilo 40 ciklov 95 stopinj za 15 s in 60 stopinj za 60 s. Prag je bil nastavljen nad kontrolnim ozadjem brez šablone in znotraj linearne faze pomnoževanja ciljnega gena za izračun številke cikla, pri katerem je bil odkrit transkript (označeno CT).

Western blot analiza

Celične lizate smo pripravili, kot je opisano prej [21, 22] Proteine ​​smo ločili s SDS-PAGE in jih prenesli na polivinil difluoridne membrane Immobilon (Millipore, Billerica, ZDA). Blote smo blokirali s 4 odstotki govejega serumskega albumina 1 uro pri sobni temperaturi in nato testirali s kunčjimi protitelesi proti človeku proti p-65 ali p-p65 (1: 1000) 1 uro pri sobni temperaturi. Po treh izpiranjih smo madeže inkubirali z oslovskim anti-kunčjim sekundarnim protitelesom (1: 1000), konjugiranim s peroksidazo, 1 uro pri sobni temperaturi. Blote smo vizualizirali s povečano kemiluminiscenco z uporabo filma X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, ZDA).

Osteoporoza, povzročena z ovariektomijo

Za to študijo so bile uporabljene samice miši ICR, stare štiri tedne, 22 ~ 28 g. Miši so bile obojestransko ovariektomirane pod anestezijo s trikloroacetaldehidom (100 mg/kg), kontrolne miši pa so bile lažno operirane (Sham) za primerjavo. Mineralno gostoto kosti in vsebnost mineralov v kosteh so izmerili po peroralnem dajanju različnih koncentracij CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt vsaka dva dni štiri tedne. Celotno telesno mineralno gostoto kosti in vsebnost mineralov v kosteh sta določili z rentgenskim absorpciometrom z dvojno energijo (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, ZDA) z uporabo načina za majhne osebe, kot je opisano prej.[18, 23] Vsi protokoli so bili v skladu z institucionalnimi smernicami in jih je odobril Odbor za nego živali Kitajske medicinske univerze.

Statistična analiza

Statistična analiza je bila izvedena s programsko opremo Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., San Diego, ZDA). Podane vrednosti so povprečje SEM. Statistična analiza med dvema vzorcema je bila izvedena s pomočjo Studentovega t-testa. Statistične primerjave več kot dveh skupin so bile izvedene z uporabo enosmerne analize variance z Bonferronijevim posthoc testom. V vseh primerih je P <0,05 veljalo="" za="">

Cistanche deserticolaje dobro zatvorba kosti

Rezultati

Cistanche deserticolaizvleček poveča mineralizacijo kosti z osteoblasti. Dodatek CD(Cistanchedeserticola)ekstrakta 24 ali 48 ur ni vplival na proliferacijo celic mišjega osteoblasta MC3T3-E1 v testu MTT (podatki niso prikazani). Ker je diferenciacija osteoblastov kompleksen proces, ki vključuje celično proliferacijo in migracijo, smo testirali tudi migracijsko sposobnost celic MC3T3-E1 po zdravljenju s CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt. Z uporabo Transwella in testov celjenja ran smo ugotovili, da CD(Cistanchedeserticola)izvleček ni vplival na migracijo osteoblastov (podatki niso prikazani). Tvorba mineraliziranih nodulov je eden od markerjev zorenja osteoblastov. Barvanje z alizarin rdečim S je pokazalo, da so mineralizirani noduli nastali, ko so bili osteoblasti dva tedna gojeni v mediju, ki je vseboval vitamin C (50 ug/ml) in -glicerofosfat (10 mm), kar je odvisno od koncentracije z dodatkom CD(Cistanchedeserticola)(Slika 1a). Zato CD(Cistanchedeserticola)izvleček povzroči nastanek kostnih nodulov s kultiviranimi osteoblasti, ne pa njihove proliferacije ali migracije. Preverili smo tudi vlogo CD-ja(Cistanchedeserticola)ekstrakta pri osteoklastogenezi, ki jo povzroča RANKL, vendar niso ugotovili nobenega učinka (podatki niso prikazani).

Izvleček Cistanche deserticola poveča izražanje alkalne fosfataze, kostnega morfogenetskega proteina-2 in osteopontina v gojenih osteoblastih

Diferencirani osteoblasti kažejo povečano aktivnost ALP, kar je v korelaciji z visokimi stopnjami izražanja encimov.[18] Ugotovili smo, da je zdravljenje s CD-jem(Cistanchedeserticola)ekstrakta 72 ur znatno povečala aktivnost ALP osteoblastov (slika 1b). Glede na ključno vlogo BMP-2, ALP in OPN pri diferenciaciji osteoblastov smo testirali, ali CD(Cistanchedeserticola)izvleček vpliva na diferenciacijo osteoblastov z uravnavanjem izražanja BMP-2, ALP in OPN. Zdravljenje celic s CD(Cistanchedeserticola)ekstrahira povečano izražanje mRNA ALP, BMP-2 in OPN na način, ki je odvisen od koncentracije (slika 1c), kar dokazuje, da CD(Cistanchedeserticola)izvleček inducirane diferenciacije osteoblastov z uravnavanjem izražanja ALP, BMP-2 in OPN.

Izvleček Cistanche deserticola poveča tvorbo kostnih nodulov po poti protein kinaze, aktivirane z mitogenom

Poročali so, da ima MAPK pomembno vlogo prikostnastanek[24,25], zato smo nato preučili, ali je ta signalna pot vključena v CD(Cistanchedeserticola)z ekstraktom povzročeno mineralizacijo kosti. Predhodna obdelava celic z zaviralcem ERK U0126, zaviralcem p38 SB203580 ali zaviralcem JNK SP600125 je zmanjšala CD(Cistanchedeserticola)z ekstraktom povečana mineralizacija kosti (slike 2a, 3a in 4a). Poleg tega so zaviralci blokirali tudi CD(Cistanchedeserticola)ekspresija ALP, BMP-2 in OPN, povzročena z ekstraktom (sliki 2b–4c). Transfekcija celic z ERK2, p38 ali JNK mutant zmanjšano CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt - povečanje ekspresije mRNA ALP, BMP-2 in OPN (slike 2c, 3c in 4c). Nato smo neposredno pregledali aktivacijo ERK, p38 in JNK po CD-ju(Cistanchedeserticola)zdravljenje z izvlečki. Inkubacija celic s CD(Cistanchedeserticola)fosforilacijo ERK, p38 in JNK, povzročeno z ekstraktom (slike 2d, 3d in 4d). Zato ERK, p38 in JNK posredujejo povečanokostnastanekki jih povzroča CD(Cistanchedeserticola)zdravljenje osteoblastov.

Izvleček Cistanche deserticola poveča tvorbo kostnih nodulov po poti jedrnega faktorja kB

Kot že omenjeno, je aktivacija NF-kB potrebna zakostnastanek[26,27] Nato smo osteoblaste obdelali z zaviralcema NF-kB pirolidin ditiokarbamatom (PDTC) in N-tozil-L-fenilalanin klorometil ketonom (TPCK), kupljenima pri Calbiochem (Darmstadt, Nemčija), da bi ugotovili, ali je aktivacija NF-kB vključeni v CD(Cistanchedeserticola)z ekstraktom povzročeno mineralizacijo kosti. Slika 5a prikazuje, da je predhodna obdelava osteoblastov s PDTC ali TPCK zavirala CD(Cistanchedeserticola)z izvlečkom povzročeno tvorbo kostnih nodulov in tudi zmanjšalo povečanje izražanja ALP, BMP-2 in OPN (sliki 5b in 5c). Fosforilacija podenote NF-kB p65 je pokazatelj aktivacije NF-kB;[28] v skladu s tem smo ugotovili, da CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt poveča fosforilacijo p65 v osteoblastih (slika 5d). Ti rezultati so pokazali, da je aktivacija NF-kB pomembna za ekspresijo ALP, BMP-2 in OPN ter tvorbo kostnih nodulov, ki jih povzroči ekstrakt CD.

Slika 4 Vpletenost c-Jun N-terminalnih kinaz (JNK) vCistanchedeserticola(CD) z ekstraktom povzročena mineralizacija kosti v osteoblastih. (a) Celice smo nasadili v 24-plošče z vdolbinicami in dva tedna gojili v mediju, ki je vseboval vitamin C (50 mg/ml) in b-glicerofosfat (10 mM). Celice so bile sočasno obdelane s CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt (26 mg/ml) plus SP600125 (3 mM). Tvorba mineraliziranih nodulov je bila ocenjena z obarvanjem alizarin rdeče-S (n=5). (b, c) Celice so bile predhodno obdelane s SP600125 30 minut ali transficirane z mutantom JNK ali 24 ur, čemur je sledila stimulacija z ekstraktom CD in aktivnostjo alkalne fosfataze (ALP) in ALP, kostnim morfogenetskim proteinom (BMP) -2 in Ekspresija mRNA osteopontina (OPN) je bila izmerjena s kompletom ALP in kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času. ( d ) Celice smo obdelali z ekstraktom CD v navedenih časovnih intervalih in ekspresijo p-JNK pregledali z Western blottingom. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)skupina, zdravljena z ekstraktom.

Zaviranje izgube kosti z izvlečkom Cistanche deserticola pri miših z ovariektomijo

Za preučitev učinka CD-ja(Cistanchedeserticola)izvlečka o izgubi kosti je bila osteoporoza inducirana pri mišjih samicah z ovariektomijo. Kot je bilo pričakovano, so miši z ovariektomijo pokazale zmanjšano celotno telesno mineralno gostoto kosti in vsebnost mineralov v kosteh (sliki 6a in 6b). Zdravljenje s CD(Cistanchedeserticola)ekstrakta štiri tedne zaviral izgubo mineralne gostote kosti in vsebnosti mineralov v kosteh na način, ki je bil odvisen od odmerka (sliki 6a in 6b). Koncentracije ALP v krvi lahko odražajo osteoblastno aktivnost.[29] Kot je prikazano na sliki 6c, CD(Cistanchedeserticola)izvleček je zaviral zmanjšanje aktivnosti ALP v serumu, ki ga povzroči ovariektomija. Poleg tega CD(Cistanchedeserticola)izvleček je povečal tudi raven osteokalcina, označevalcakostnastanek, in zmanjšal raven C-terminalnih telopeptidov kolagena tipa I, označevalca resorpcije kosti (sliki 6d in 6e). Te ugotovitve tako podpirajo moč in učinkovitost CD-ja(Cistanchedeserticola)ekstrakt pri preprečevanju izgube kosti in vivo.

Slika 6 Zaviranje zmanjšanja kostne mineralne gostote in vsebnosti mineralov v kosteh zaradi ovariektomijeCistanchedeserticola(CD) izvleček. Samice miši ICR so dobile navidezno operacijo ali so jim odstranili jajčnike. Miši z ovariektomijo so bile zdravljene z navedenimi koncentracijami CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt z oralnim hranjenjem. Celotna telesna mineralna gostota kosti (a), mineralna vsebnost kosti (b), aktivnost alkalne fosfataze (ALP) v serumu (c), serumski osteokalcin (d) in serumski C-terminalni telopeptidi kolagena tipa I (e) so bili določeni štiri tedne po operaciji. Podatki so predstavljeni kot povprečje SE, n=8–10 miši/skupino. *P < 0.05,="" v="" primerjavi="" s="" lažnim;="" #p=""><0,05 v="" primerjavi="" z="" ovariektomirano="">

DISKUSIJA

Kliknite tukaj za informacije o II. delu (Razprava in zaključek) tega članka.

Od: 'Cistanchedeserticolaekstrakt povečakostnastanekv osteoblastih' poTe-Mao Li^aet al

---© 2012 Avtorji. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Revija za farmacijo in farmakologijo, 64, str. 897–907