Cistanosid A posreduje na poti P38/MAPK za zaviranje aktivnosti osteoklastov

Povzetek

OZADJE:cistanozid Aimaprotivnetni učinki, antioksidacija,zmanjševanje poškodb ledvic in proti osteoporozi, vendar njegov učinek nadiferenciacija osteoklastov, delovanje in osnovni molekularni mehanizmi ostajajo nejasni. CILJ: Raziskati učinekcistanozid Anaosteoklastdiferenciacijo inresorpcijo kostiinduciran z receptorskim aktivatorjem liganda jedrnega faktorja kapa-B (RANKL) in vitro in njegov mehanizem.

METODE: Makrofage kostnega mozga so pridobili iz stegnenice in golenice 4-6-teden starih miši C57BL/6. Citotoksični učinek cistanozida A (5, 10, 20, 40, 80 in 160 μmol/L) na viabilnost makrofagov kostnega mozga je bil raziskan z uporabo kompleta za štetje celic-8. Izvedeno je bilo barvanje s kislo fosfatazo, odporno na tartrat, da bi opazovali učinek različnih koncentracijcistanozid Ana diferenciacijo osteoblastov in določili njegovo učinkovito intervencijsko koncentracijo. Obstajala je pozitivna kontrolna skupina, skupine cistanozida A z nizkimi, srednjimi in visokimi odmerki (40, 80 in 160 μmol/L). Po pritrditvi celic smo dodali 50 ng/mL RANKL, da induciramo diferenciacijo osteoblastov, in ustrezen odmerek cistanozida A smo dodali skupinam z nizkim, srednjim in visokim odmerkom cistanozida A. Za odkrivanjeučinki cistanozida Ananastanek osteoklastov. Za opazovanje učinkov cistanozida A na kostno resorpcijsko funkcijo osteoklastov smo uporabili barvanje rezin kostne abrazije s toluidin modrim. Ekspresija gorvodnih in spodnjih proteinov poti JNK/MAPK je bila odkrita z Western blotom. Izražanje genov, povezanih z diferenciacijo osteoklastov in funkcijo resorpcije kosti, kot so kislinska fosfataza, odporna na tartrat, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk in c-Fos, je bila odkrita z RTqPCR. REZULTATI IN ZAKLJUČEK: Barvanje s kislo fosfatazo, odporno na tartrat, obarvanje s F-aktinskim obročem in test resorpcijske jamice je pokazalo, da cistanozid A pomembnozaviral diferenciacijo osteoklastov, ki jo povzroča RANKLinresorpcijo kostina način, odvisen od odmerka, v primerjavi s skupino pozitivne kontrole. Rezultati RT-qPCR so pokazali, da lahko v primerjavi s pozitivno kontrolno skupino tako skupine z visokimi kot nizkimi odmerki cistanozida A znatno znižajo ekspresijo mRNA kisle fosfataze, odporne na tartrat, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk in c-Fos na način, ki je odvisen od odmerka. Rezultati Western blot testa so pokazali, da je skupina z visokimi odmerki cistanozida A znatno zavirala izražanje proteina p-JNK po 10, 20, 30 in 60 minutah posega; v primerjavi s pozitivno kontrolno skupino je cistanozid A znatno zaviral izražanje proteinov Nfatc1 in c-Fos na način, ki je bil odvisen od odmerka. Za zaključek bi Cistanosid A lahko zaviral tvorbo in resorpcijo kosti osteoklastov z zmanjšanjem ravni proteina p-JNK, zaviranjem aktivacije poti MAPK in izražanja ključnih genov v osteoklastih.

Ključne besede: cistanozid A; osteoklast; MAPK; JNK; RANKL; RANG;osteoporoza; feniletanoidni glikozidi

CISTANCHE ZA DELOVANJE ZA ZAVIRANJE AKTIVNOSTI OSTEOKLASTOV

0 Uvod Uvod

Epidemiološke študije so pokazale, da bo z rastjo in staranjem svetovnega prebivalstva pojavnost osteolitičnih bolezni, kot sta osteoporoza in osteoartritis, še naraščala [1]. Sedanje raziskave kažejo, da bo v patogenezi osteolitičnih bolezni neravnovesje kostne resorpcije in rekonstrukcije kosti, ki ga povzroči prekomerna aktivacija delovanja osteoklastov, povzročilo znatno zmanjšanje volumna kosti, kostne gostote in kostne mikrostrukture. Škodljivo poslabšanje, vodi do povečane krhkosti kosti in povečanega tveganja za zlome [2-3]. Zato so osteoklasti glavna celična tarča za identifikacijo in razvoj učinkovitih sredstev za zdravljenje osteoporoze. Vendar imajo trenutno pogosto uporabljena zdravila, ki zavirajo osteoklaste, kot je denosumab (protitelo proti RANKL), bisfosfonati itd., neželene učinke, kot so nefrotoksičnost, osteonekroza, tveganje za raka endometrija in osteonekrozo čeljusti [4-5]. Zato je zelo klinično pomembno najti nova zdravila, ki lahko zavirajo aktivnost osteoklastov.

Funkcijo diferenciacije in resorpcije kosti osteoklastov v glavnem regulirata dve signalni molekuli, faktor stimulacije kolonije makrofagov in receptorski aktivator liganda jedrnega faktorja κB (RANKL) [6]. Kolonije stimulirajoči receptor faktorja 1 (c-fms) na celični membrani prekurzorja osteoklasta se veže na makrofagni kolonije stimulirajoči faktor in spodbuja izražanje receptorskega aktivatorja jedrnega faktorja kapa B (RANK). Vezava RANKL in RANK na celično površino aktivira transkripcijske faktorje, kot so jedrski faktor κB, JNK, p38 in JNK, ti pa aktivirajo transkripcijski faktor c-Fos, jedrski faktor aktiviranih celic T c1 (Nfatc1) itd. jedro, aktiviranje uničenja kostnih prekurzorskih celic, tvorijo večjedrne celice in se sčasoma diferencirajo v osteoklaste [7-9].

Cistanche deserticolaje eden najpogosteje uporabljenih kitajskih medicinskih materialov v klinični praksi. To je posušeno mesnato steblo z luskastimi listi Cistanche deserticola ali Cistanche tuberosum iz rastline Orobanchiaceae [10]. Tradicionalna medicina meni, da je sladka sladica topla, sladkega in slanega okusa ter se vrača v meridiane ledvic in debelega črevesa. Ima učinke hranjenja ledvičnega janga, dopolnjevanje esence in krvi, vlaženje črevesja in odvajalo ter se uporablja za zdravljenje impotence, neplodnosti, mišic in kosti, ki jih povzročajo nezadostni ledvični jang in esenca ter pomanjkanje krvi. Bolezni, kot je šibkost, so v skladu z metodami toničnega zdravljenja jeter in ledvic, ki se uporabljajo v tradicionalni medicini za zdravljenje osteolitičnih bolezni. Farmakološke študije so pokazale, da je glavna aktivna sestavina Cistanche deserticola feniletanoidni glikozid, ki ima dobro varnost in obsežne medicinske funkcije [11]. Cistanosid A (molekulska formula: C36H48O20) je naravna feniletanol glikozidna spojina, izolirana in prečiščena iz tradicionalne kitajske medicine Cistanche deserticola. Deluje protivnetno, antioksidativno in protitumorsko [12-14]. Študije so pokazale, da lahko Cistanche deserticola A zmanjša raven c-Fos v primarnih celicah miši z akutno poškodbo jeter, ki jo povzroča etanol [15]. Druge študije so pokazale, da lahko Cistanche A izboljša strukturne parametre trabekularne kosti pri ovariektomiranih osteoporotičnih miših prek poti faktorja 6, povezanega z receptorjem RANKL/TNF (TRAF6) [16]. Vendar pa ni nadaljnjih raziskav o učinku cistanhezida A na diferenciacijo osteoklastov in potencialne molekularne mehanizme. Namen te študije je raziskati učinek cistanhezida A na diferenciacijo osteoklastov in funkcijo resorpcije kosti in vitro ter potencialne molekularne mehanizme, da bi odkrili nova potencialna zdravila za zaviranje diferenciacije osteoklastov.

1 Materiali in metode Materials and methods

1.1 Oblikovanje

Za celične poskuse in vitro sta bila izvedena t-test in enosmerna ANOVA.

1.2 Čas in kraj

Dokončano od decembra 2022 do decembra 2023 v laboratoriju za popravilo poškodb kosti in mehkih tkiv druge bolnišnice medicinske univerze Shanxi.

1.3 Materiali

1.3.1 Poskusne živali

SPF stopnje 4-tedenske stare miši C57BL/6, samci ali samice, so bile kupljene pri Eksperimentalnem centru za živali Medicinske univerze Shanxi, številka dovoljenja za proizvodnjo: SCXK (Jin) 2019-0004. Poskusne miši so bile v standardnem okolju: sobna temperatura 26 stopinj, vlažnost približno 55%, izpostavljenost svetlobi 12 ur na dan, prosto gibanje in samostojno prehranjevanje. Eksperimentalni protokol je odobril odbor za dobro počutje eksperimentalnih živali in etiko druge bolnišnice medicinske univerze Shanxi (št. odobritve: DW2023031).

1.3.2 Reagenti in zdravila

Cistancheside A (čistost 98 %, CAS 93236-42-1) je bil kupljen pri Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; fetalni goveji serum in gojišče MEM z visoko vsebnostjo glukoze sta bila kupljena pri HyClone Company iz Združenih držav; raztopina za razgradnjo tripsina-EDTA 0.25 %, raztopina za lizo rdečih krvnih celic, 1 × PBS, mešanica penicilin-streptomicin (×100), raztopina za barvanje s toluidin modrim (1/100, boratna metoda), z rodaminom označen faloidin prstan

Peptid (kat. št. CA1610) in barvilo DAPI (pripravljeno za uporabo) sta bila kupljena pri Beijing Solebao Technology Co., Ltd., mišji rekombinantni makrofagni kolonije stimulirajoči faktor in naddružina liganda mišjega rekombinantnega faktorja tumorske nekroze RANKL pa sta bila kupljena pri Beijing Ze Xiyuan Biotechnology Co., Ltd.; Komplet CCK-8 je bil kupljen pri MCE Company iz Združenih držav Amerike, komplet za obarvanje s kislo fosfatazo, odporno na tartart (TRAP) je bil kupljen pri Sigma-Aldrich Company iz Združenih držav Amerike, RNAiso Plus, reagenti za reverzno prepisovanje vrste Premix, TB Green® Hitra mešanica qPCR,

Prime Script TM RT Master Mix in Trizol sta bila kupljena pri Takara Company v Združenih državah; transmembranski protein, specifičen za dendritične celice (DC-STAMP), TRAP, CTSK, c-Fos, NFATc-1 specifični PCR primerji so bili kupljeni pri Sangon Bioengineering (Shanghai) Co., Ltd.; protitelesa proti aktinu, protitelesa c-Fos, protitelesa Nfatc1, protitelesa JNK in protitelesa p-JNK, m-IgG Fc BP-HRP so bila kupljena pri Santa Cruzu v ZDA.

Biotehnološka korporacija.

1.4.6 Poskus resorpcije kosti za testiranje sposobnosti osteoklastov za resorpcijo kosti

Makrofage kostnega mozga so bili posejani v 96-ploščo z vdolbinicami s steriliziranimi rezinami goveje kosti, ki so bile vnaprej nameščene z gostoto 7×103/vdolbinico. V vsako vdolbinico smo dodali 100 μl gojišča in razdelili na pozitivno kontrolno skupino in Cistanche A z majhnim odmerkom. skupini (40 μmol/L) in skupini z visokimi odmerki cistanhezida A (160 μmol/L), vsaka skupina je bila opremljena s 5 večkratnimi luknjami, od katerih so bile 3 večkratne luknje nameščene z rezinami goveje kosti, drugi 2 večkratni luknji pa sta bili uporabljeni za opazovanje izražanja makrofagov kostnega mozga. Tvorba adhezivov in osteoklastov. Ko so se celice prilepile, pozitivna kontrolna skupina in cistanče

Vsem skupinam smo dodali RANKL pri 50 ng/mL, da bi inducirali diferenciacijo osteoklastov. Skupinam z nizkimi in visokimi odmerki cistanhezida A smo dodali 40 μmol/L oziroma 160 μmol/L cistanhezida A za intervencijo, medij pa smo zamenjali vsakih 48 ur. Po 14-dnevnem gojenju vzemite rezine goveje kosti, dvakrat operite rezine kosti s PBS, dodajte 70 % izopropilni alkohol in 15-minutno čiščenje z visokozmogljivim ultrazvokom, da izperete preostale celice, dodajte toluidinsko modro (1 %, raztopljeno v vodi) raztopino barvila in 2 sekundi obarvajte pri sobni temperaturi. Po 1 minuti sperite delce kosti z dvojno destilirano vodo, da odstranite preostalo barvilo. Obarvane kostne rezine smo opazovali in fotografirali s stereomikroskopom, območje kostnih resorpcijskih praznin pa smo prešteli s programsko opremo Image J.

1.4.7 RT-PCR

Za odkrivanje znotrajcelične funkcije resorpcije kosti in izražanja genov, povezanih z osteoklasti, smo makrofage kostnega mozga zasejali v 6-ploščo z vdolbinicami po 1,5 × 105/vdolbinico in v vsako vdolbinico dodali 100 μL gojišča kulture ter razdeljeni v pozitivno kontrolno skupino, skupino z nizkim odmerkom Cistanche A (40 μmol/L) in skupino z visokim odmerkom Cistancheside A (160 μmol/L). Tako pozitivni kontrolni skupini kot skupini Cistancheside A je bil dodan 50 ng/mL induktorja RANKL.

Za induciranje diferenciacije osteoklastov je bilo za intervencijo dodanih 40 μmol/L ali 160 μmol/L Cistanhezida A skupinam z nizkimi in visokimi odmerki Cistanhezida A. Medij smo menjali vsakih 48 ur. Opazovanje je bilo izvedeno pod invertnim mikroskopom tri ali štiri dni po indukciji. Pod mikroskopom so opazili, da so se makrofagi kostnega mozga pravkar združili. Dodajte TRIzol za lizo celic, dodajte kloroform, postavite na led za 10 minut in aspirirajte mešanico

V 1,5 ml EP epruvete dodajte 200 μL kloroforma v vsako epruveto, stresajte 15 s, nato pustite stati na ledu 15 minut, centrifugirajte pri 4 stopinjah, 12 000 r/min 10 minut, vzemite supernatant, dodajte enako količino izopropilnega alkohola in postavite na led. Pustite stati 10 minut, supernatant zavrzite, centrifugirajte pri 4 stopinjah pri 120,000 vrt/min, sperite s 75 % raztopino etanola z volumskim deležem sterilne vode brez encimov in posušite na zraku, da dobite skupna RNA. Uporabite komplet za reverzno transkripcijo Prime ScriptTMRT Master mix, da konfigurirate 20 μL sistem za reverzno transkripcijo za sintezo cDNA. Nato konfigurirajte delovni sistem PCR v skladu z navodili za komplet in izvedite detekcijo v fluorescenčnem kvantitativnem PCR instrumentu. Reakcijski pogoji PCR so bili: preddenaturacija pri 95 stopinjah 5 minut; denaturacija pri 95 stopinjah za 10 s, žarjenje in podaljšanje pri 60 stopinjah za 30 s, skupaj 40 ciklov. Zaporedje primerjev je prikazano v tabeli 1.

Po dodajanju enostavnega medija -MEN in 3-urnem stradanju je bila za intervencijo dodana tudi skupina Cistancheside A s 160 μmol/L Cistancheside A. Po koncu stradanja smo vsaki skupini za stimulacijo dodali 100 ng/mL RANKL. Časi stimulacije so bili 0, 10, 20, 30 in 60 minut. Po končanem času stimulacije smo gojišče zavrgli in trikrat sprali s predhodno ohlajenim 1 × PBS. Ekstrahirane beljakovine smo uporabili za odkrivanje ekspresije proteinov p-JNK, JNK in -aktina.

Ko je ekstrakcija proteina končana, z gelsko elektroforezo ločite protein in ga prenesite na PVDF membrano. Dodajte 5 % govejega serumskega albumina (BSA) za blokiranje pri 4 stopinjah 1 uro. Zavrzite raztopino za blokiranje, 3-krat sperite membrano s pufrom TBST in dodajte primarno protitelo. (protitelo Nfatc1 1:1000, protitelo c-Fos 1:1000, protitelo p-JNK 1:1000, protitelo JNK 1:1000, protitelo proti aktinu 1:1000), inkubiramo pri 4 stopinjah 14-16 h, speremo membrano 3-krat s pufrom TBST, dodamo sekundarno protitelo (m-IgG Fc BP-HRP, razmerje redčenja 1:5000), inkubiramo 2 uri pri sobni temperaturi, po izpiranju dodamo fluorescentno raztopino in razvijemo pod sistemom za slikanje z gelom, Slika Lab Programska oprema analizira sivo vrednost dobljenih trakov in uporablja -aktin kot notranjo referenco za izračun relativne ekspresije ciljnega proteina.

1.5 Glavni kazalniki opazovanja

① Rezultati diferenciacije osteoklastov, ki jo povzroča RANKL, po posegu s cistanhezidom A; ② Tvorba aktinskih obročev na površini osteoklastov in spremembe v funkciji osteoklastne resorpcije kosti po posegu s cistanhezidom A; ③ Ključ do osteoklastov po posegu Cistancheside A Izražanje genov; ④ Ekspresija spodnjih proteinov poti JNK/mitogen-aktivirane proteinske kinaze (MAPK) in proteina p-JNK po posegu s cistanhezidom A.

1.6 Statistična analiza

Za statistično analizo in risanje je bila uporabljena programska oprema GraphPad Prism 9. Vsi podatki so bili izraženi kot x-±s. Za primerjavo med skupinama sta bila izbrana t test in enosmerna analiza variance. P < 0.05 je bilo opredeljeno kot pomembna razlika. Statistične metode tega članka je razvil statistični oddelek medicinske univerze Shanxi.

Domači pregled.