Jasno slikanje in kvantificiranje ledvice v 3D
Feb 27, 2022
Že desetletja meritveledvicamikroanatomija z uporabo 2-dimenzionalnih prerezov nam je zagotovila podrobno znanje o ledvica morfologija v fizioloških in patoloških pogojih. Vendar je hiter razvoj metod čiščenja tkiva v zadnjih letih v kombinaciji z razvojem novih 3-dimenzionalnih načinov slikanja omogočil nov vpogled vledvicastruktura in funkcija. Ta pregledni članek opisuje vrsto novih vpogledov vledvicarazvoja in bolezni, pridobljenih pred kratkim z uporabo teh novih metodoloških pristopov. Na primer v razvojuledvicati pristopi so zagotovili novo razumevanje morfogeneze razvejanja sečnice, proliferacije in predanosti matičnih celic nefrona, interakcij med celicami konice sečnice in matičnimi celicami nefrona ter vzpostavitev segmentacije nefrona. V celi odrasli mišiledvice, čiščenje tkiva v kombinaciji s svetlobno mikroskopijo lahko prikaže in kvantificira skupno število glomerulov, kar je velik preboj na tem področju. Podobni pristopi so zagotovili nove vpoglede v strukturo ledvične vaskulature in inervacije, tubulointersticijskega preoblikovanja, izgube in hipertrofije podocitov, tvorbe cist, razvoja celičnih polmesecev in strukture glomerularne filtracijske pregrade. Veliko več napredka v razumevanjuledvicabiologije in patologije lahko pričakujemo, ko se razvijajo dodatne tehnike čiščenja in slikanja, ki jih sprejema več raziskovalcev.
Ključne besede:3D slikanje; glomerul; razvoj ledvic; nefropatologija; čiščenje tkiva; tubule; ledvična
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DELOVANJE LEDVIC/LEDVIC
Skupno število nefronov pri vsakem normalnem človekuledvicase giblje od približno 200,000 do več kot 2 milijona, 1 v povprečju približno 1 milijon. Ti nefroni kot tudi druge komponenteledvicavključno z zbiralnimi vodi, krvnimi žilami, intersticijem in živčnimi vlakni, so urejeni z izjemno mikroanatomsko natančnostjo. 2 To natančno vzorčenje podpira normalnodelovanje ledvicin zdravje, ki je lahko resno moteno, če je arhitektura tkiva spremenjena zaradi glomerularne ali tubularne hipertrofije ali skrčenja, izgube nefrona, prirojenih nepravilnosti, redčenja žil in intersticijske fibroze. Vrsta slikovnih pristopov je prispevala k našemu celovitemu razumevanjuledvicamikroanatomijo med razvojem ter pri zdravem in bolnem odraslemledvica. Večinoma je to razumevanje izhajalo iz analize 2-dimenzionalnih (2D) rezov, ne glede na to, ali gre za svetlobne ali elektronsko mikroskopske fizične reze ali konfokalne optične reze. Kvantifikacija te mikroanatomije je bila večinoma odvisna od stereoloških analiz rezov, ki so zagotovile ocene števila, dolžin, površin in volumnov glomerulov, tubulov, žil, intersticija in njihovih celičnih komponent. 3,4 Do nedavnega je 3D vizualizacijaledvicaMikrostruktura je bila v veliki meri omejena na konfokalno mikroskopijo, ki omogoča optično rezanje in 3D rekonstrukcijo do globine od 50 do 80 m m. Na žalost lomne lastnosti beljakovinskih in lipidnih komponent v tkivu razpršijo svetlobo in močno zmanjšajo kakovost slike, ko se globina poveča. V zadnjih letih je bila razvita vrsta čistilnih metod za odstranjevanje vsebnosti lipidov in pigmentov v tkivu ter usklajevanje lomnih lastnosti tkiva in nosilnih medijev, da postane tkivo prozorno. 5 Metode čiščenja so kompleksne, od inkubacije tkiva v različnih raztopinah v obdobju nekaj ur do podaljšanih postopkov, ki vključujejo prilagojeno elektrokemično opremo. Bralce usmerjamo na nedavne preglede 5,6 za podroben pregled trenutnih metod in članke, navedene tukaj za posebne metode in primere uporabe.
Podcelične strukture in celotne populacije celic je mogoče razrešiti znotraj očiščenih celih organov ali debelih rezov. Natančne značilnosti slikanja v očiščenem tkivu zahtevajo specializirane mikroskope in obdelavo slik za zajemanje in rekonstrukcijo volumetričnih podatkov iz vzorcev, ki so lahko veliki od sto mikronov do centimetrov. Konfokalni mikroskopi s točkovnim skeniranjem in vrtečim se diskom so bili učinkovito uporabljeni za slikanje funkcij znotraj očiščenegaledvicatkiva, vendar trpijo zaradi zmanjšane ločljivosti v osi Z in progresivnega zmanjšanja intenzivnosti fluorescence v globini zaradi ene same osi osvetlitve in slikanja. Tehnike mikroskopije s svetlobnimi ploščami so še posebej primerne za slikanje očiščenih tkiv, saj omogočajo hitro pridobivanje velikih 3D volumnov in lahko vključujejo večkotno osvetlitev in slikanje. Optična projekcijska tomografija je še en pristop, ki vključuje večkotno slikanje in digitalno rekonstrukcijo za izdelavo podatkov, v katerih so osi X, Y in Z vsakega voksla enake ločljivosti. Ne glede na specifičen pristop, čiščenje tkiva in slikanje cele montaže nudita novo priložnost za raziskovanje neoznačenih celičnih mikrookoljij in strukture tkiva višjega reda. V tem pregledu izpostavljamo nekaj novih vpogledov vledvicarazvoj, odrasliledvicastrukturo in patologijo, ki so posledica čiščenja tkiva, ki mu je sledila 3D kvantitativna analiza.
Nova spoznanja o razvoju ledvicDesetletja profiliranja genske ekspresije in študij izločitve so vodila do podrobnega razumevanja vrst celic, genskih regulacijskih mrež in signalnih poti, ki nadzorujejo sesalce.ledvicarazvoj. To znanje je informiralo o diagnozi prirojene bolezni in omogočilo proizvodnjoledvicavrste celic iz pluripotentnih matičnih celic. 7 Vendar pa velikost, motnost in kompleksnost razvojaledvicaje predstavljalo pomembno oviro za natančno merjenje morfogeneze tega organa in 3D porazdelitve celic in beljakovin v njem. Uporaba čiščenja tkiv in večstopenjskega slikanja vledvicaje omogočil vizualizacijo in kvantitativno analizo morfogeneze razvejanosti sečevodov, populacij matičnih celic in nefronske obdarjenosti znotraj intaktnih organov (slika 1). 8 Ti pristopi podpirajo novo zmogljivost za natančno fenotipizacijo in odpirajo poti za analizo celičnih in molekularnih gonilledvicarazvoj in prirojene bolezni.
Slikanje in analiziranje razvejane morfogeneze v 3D.Vzpostavitev ureteričnega drevesa je značilnostledvicarazvoj in je bil obsežno raziskan z uporabo genetike miši in sploščenledvicaeksplantacijske kulture. Vendar pa je razumevanje, kako posamezni geni prispevajo k rasti, obliki in vzorčenju te strukture razvejanega epitelijskega kanala in vivo, zahtevalo sposobnost slikanja in analize te kompleksne mreže v širokem razponu velikosti vzorcev. Kratek et al. 8 so te težave obravnavali z uporabo celotne imunofluorescence, čiščenja na osnovi topil (benzil alkohol benzil benzoat) in slikanja celih organov z optično projekcijsko tomografijo. Uporaba tega pristopa za zajemanje 3D posnetkov od začetka do sredineledvicaPri razvoju je ekipa razvila programsko opremo za analizo po meri, da bi pridobila podrobnosti brez primere o ureteričnem drevesu, vključno s številom konic, koti in dolžino vej, prostornino vej in številom generacij vej iz nepoškodovanih ureteričnih dreves (sliki 1c in d). 8 Prvotno uporabljen za karakterizacijo in identifikacijo novih vidikov razvejanja ledvic, 9,10 stalna prizadevanja skušajo definirati načela in ključne regulatorje, ki urejajo vzorčenje vej in vivo. 1
Povezovanje dinamike progenitorja z morfogenezo organov z večplastnim slikanjem.Molekularne interakcije med celicami vrha ureterikta in matičnimi celicami nefrona igrajo pomembno vlogo pri vzpostavljanju komplementa nefronov, ki olajšadelovanje ledvicv odraslem življenju. Neinducirani predniki nefrona proizvajajo dejavnike, ki spodbujajoledvicarast skozi ureterično razvejanje, medtem ko prostorsko omejeni znaki znotraj ureterične konice ohranjajo stanje nefrona progenitorja in inducirajo podmnožico teh progenitorjev, da se diferencirajo v zgodnji nefron. Te interakcije poganjajo cikel razvejanja in indukcije nefrona, ki se prekine okoli rojstva, ko se diferencirajo preostali progenitorji nefrona. Pred metodami čiščenja tkiva je naše razumevanje dinamikeledvicamorfogeneza in relativna številčnost populacij matičnih celic skozi čas je bila močno omejena. To se je spremenilo z razvojem pristopov slikanja na več ravneh, ki uporabljajo razširjene protokole imunofluorescence, čiščenje tkiv in pristope slikanja za kvantificiranjeledvicarazvoj na celični (konfokalni) in celoorganski ravni (optična projekcijska tomografija, svetlobni list). 9,10 Postalo je očitno, da so stopnjeledvicarast dramatično variira s prvotno hitrimi stopnjami razvejanja in proliferacije, ki se zmanjšujejo v fazah, ki so v korelaciji z zmanjšanjem števila matičnih celic znotraj nefrogene niše. 10 Tridimenzionalno konfokalno slikanje očiščenega celega človeškega plodaledvice(11. teden) ali vzorcev izledvicakorteksa (tedni 11–23) potrjujejo, da se to zmanjšanje velikosti niše ohranja med vrstami. 12 Nadaljnja primerjalna analiza človeške in mišje nefrogene niše v očiščenem tkivu je privedla do novega modela nastajanja nefrona, ki temelji na času, kjer se matične celice postopoma dodajajo zgodnjemu nefronu in sprejmejo identiteto segmenta glede na vrstni red, v katerem prispejo. . 13 V drugi študiji, ki se je osredotočala na zavzetost prednikov nefrona, je bila za njegovo uporabo uporabljena metoda čiščenja tkiva na osnovi hidrogela (pasivno Clear Lipid-exchanged Acryl-amide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/In situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel [CLARITY] 14 ). sposobnost zadrževanja fluorescence endogenega poročevalca tdTomato. Analiza označevanja tdTomato v očiščenem tkivu je pokazala, da se lahko celice v zgodnjem zavezanem nefronu vrnejo v stanje prednikov, kjer so predhodni rezultati nakazovali, da je zavezanost enosmerna. 15 Čiščenje tkiv je torej izboljšalo naše razumevanje dinamičnih razvojnih procesov na lestvicah in vrstah.
Natančna fenotipizacija. Napredek pri čiščenju tkiv in kvantitativni analizi je omogočil novo zmogljivost za natančno fenotipizacijo. Statistično robustne spremembe v razvejanosti in številu nefronov so bile ugotovljene pri mišjih modelih s subtilnimi fenotipi, kot je Ret þ/? in Six2 þ/? miši (slika 2), ki so bile prej razvrščene kot "normalne". 10,16 Konfokalno slikanje visoke ločljivosti očiščenega Wnt11 ?/?ledviceidentificirali nov celični fenotip, pri katerem se nefronski progenitorji zdijo neorganizirani zaradi nezmožnosti oblikovanja stabilnih celičnih pritrditev s konico sečevodov in prezgodnje diferenciacije. 17 Te metode so bile uporabljene tudi za količinsko opredelitev vpliva novih regulatorjev stanja matičnih celic nefrona, kot so DNA metiltransferaza 1, mikroRNA Lin28 in Let7 ter TSC1.ledvicarazvoj in število nefrona. 18–20 Natančna fenotipizacija bo verjetno postala pomembno orodje pri naših prizadevanjih za razumevanje dodatnega učinka genetskih in okoljskih dejavnikov, ki prispevajo k nizkemu številu nefronov in nagnjenosti k kroničnimbolezni ledvic.
Matematično modeliranjeledvicamorfogeneza. Podatki, pridobljeni iz očiščenega razvojaledvicaspodbujajo val slikovnega matematičnega modeliranja, ki poskuša razbrati, kako makroskopska oblika in funkcija tkiva izhajata iz molekularnih interakcij med populacijami matičnih celic. 11,21–23 Nadaljnja uporaba slikanja celih organov v očiščenem tkivu bo ključnega pomena za razumevanje molekularnih in celičnih gonil 3D vzorčenja tkiv in je lahko ključ do izboljšanja strukture in natančnosti modelov matičnih celicledvica.
3D morfologija in patologija odrasle ledviceZapletena morfologija odraslegaledvicaomejuje uporabo 2D morfoloških orodij, saj lahko posredujejo nepopolne ali zavajajoče zaznave 3D strukture. Tukaj razpravljamo o nekaterih pomembnih metodoloških napredkih v zadnjih letih, ki zdaj omogočajo robustno 3D analizo struktur pri odraslihledvica, od nepoškodovanegaledvicevse do komponent bariere glomerularne filtracije (Slika 3). 2
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO OKVARJO
Število in velikost nefrona.Človeškoledvicakaže visoko stopnjo variabilnosti znotraj in med posamezniki v številu in volumnu nefrona, kar je bilo opisano v študijah obdukcije oseb brez očitnegabolezni ledvic1,30,31 in je bila povezana z razvojnimi motnjami. Že desetletja je zlato standardno orodje za kvantifikacijo števila nefronov v eksperimentalnih in človeških vzorcih metoda disektorja/frakcionarja, stereološka metoda, ki temelji na zasnovi. 3,4 Čeprav je ta pristop natančen in natančen, je tudi praktičen, dolgotrajen in zahteva veliko usposabljanja. Iz tega razloga so bili predlagani alternativni pristopi za oblikovanje učinkovitih metod, ki lahko zagotovijo visokokakovostne končne točke: 32 na primer kombinacije metod optičnega čiščenja, vključno s hidrofobnimi (prej znanimi kot na osnovi topil), hidrofilnimi ali na osnovi hidrogela, z naprednimi svetlobna mikroskopija (npr. konfokalna, večfotonska ali svetlobna mikroskopija).
Kolikor nam je znano, so prvo poročilo, ki je združevalo optično čiščenje in mikroskopijo svetlobnih listov za analizo števila in velikosti nefrona, objavili Klingberg et al. 24 v pomembnem dokumentu, ki je vseboval več pomembnih napredkov. Prvič, to poročilo je predstavilo etil cinamat, nenevarno topilo, ki bi lahko nadomestilo strupene kemikalije, kot je benzil alkohol–benzil benzoat, ki se je do takrat redno uporabljal v protokolih hidrofobnega čiščenja. Drugič, preiskovalci so izvedli štetje nefrona pri nepoškodovani mišiledvice in agresiven in progresiven model imunsko posredovanegabolezni ledvic, ugotavljanje izgube nefrona med potekom bolezni. Poleg tega so bili uvedeni pomembni koraki v smeri računalniške avtomatizacije algoritmov za segmentacijo slike, kar je omogočilo znatno izboljšanje učinkovitosti. Pred kratkim sta Østergaard et al. 25 je predstavil podobno hidrofobno metodo čiščenja v kombinaciji s svetlobno mikroskopijo in avtomatizirano segmentacijo slike, ki zagotavlja skupno število nefronov in enojni glomerularni volumen v mišjem modelu diabetične nefropatije. Poleg tega je ta študija pokazala elegantno funkcionalno označevanje proksimalnih tubulov z in vivo injekcijo albumina za vizualizacijo glomerulartubularnega spoja in preprost protokol za korelativno histopatologijo v istih optično očiščenih vzorcih. To poročilo prikazuje prilagodljivost teh protokolov, ki postajajo večplastni cevovodi za celovito profiliranje tkiv.
Ledvična vaskulatura in inervacija.Sledenje sledi razvejanega ožilja ali živčnih vlaken pri odraslihledvicaskoraj nemogoče v 2D konvencionalni histologiji, saj velikost organa in kompleksnost strukturne porazdelitve zahtevata obsežno in strokovno serijsko rezanje. Pred kratkim sta Huang et al. 33 so poročali o kationskem bližnjem infrardečem fluorescentnem barvilu (MHI148-PEI) za specifično označevanje krvnih žil, ki ga je mogoče kombinirati s spremenjenim in pospešenim protokolom čiščenja na osnovi etil cinamata za skrajšanje časa obdelave tkiva. Ta pristop odpira nove poti za vaskularne raziskave vledvica,še posebej, če je potrebno slikanje visoke ločljivosti v 3D. Podobno Hasegawa et al. 26 je uporabil Clear Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) skupaj s po meri izdelanim mikroskopskim sistemom s svetlobnimi ploščami, da bi identificiral porazdelitev simpatične inervacije v nedotaknjeni mišji ledvici. Simpatični živci so bili predvsem razporejeni okoli arterij. Po 10 dneh ishemije ali reperfuzijske poškodbe se je gostota simpatične inervacije znatno zmanjšala, kar je v korelaciji z znižanimi ravnmi norepinefrina vledvičnega tkiva. Te spremembe so delno vztrajale 28 dni po začetni poškodbi, kar nakazuje, da lahko med napredovanjem kroničnebolezni ledvic.
Tubulointersticijsko preoblikovanje.Ledvični tubularni sistem je še posebej težko analizirati v 3D. Zapletena in zapletena morfologija predstavlja številne izzive za konvencionalne metode, ki temeljijo na serijski rezini in standardni svetlobni mikroskopiji. Vendar pa optično čiščenje omogoča analizo nedotaknjenih tubulov in njihovega okoliškega mikrookolja. Saritas et al. 34 izvedli kombinacijo hidrogelnega in hidrofobnega optičnega čiščenja, ki mu je sledila napredna svetlobna mikroskopija in polavtomatska 3D analiza za karakterizacijo distalnega tubularnega preoblikovanja zaradi pomanjkanja kalija v prehrani. Raziskovalci so kvantificirali tubularno hiperplazijo in zaznali povečanje proliferirajočih celic v tubulointersticiju. Ta študija je uporabila vsestranskost tako optičnega čiščenja kot
Slika 3| Tridimenzionalna (3D) morfometrija pri odraslih ledvicah. (a) Štetje nefronov v celih ledvicah z uporabo označevanja endotelijskih celic s CD31. Plošča prikazuje 3D rekonstrukcijo (levo), optični prerez v dvodimenzionalnem (2D) pogledu (na sredini) in posebna področja, ki prikazujejo posamezne glomerule v primerjavi med svetlobno mikroskopijo (LSFM) in konfokalno ter 2- fotonska (2P) mikroskopija. Prilagojeno z dovoljenjem Ameriškega združenja za nefrologijo iz Journal of the American Society of Nephrology, Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidnes Using Lightsheet Microscopy, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al ., letnik 28, številka 2, 2017; dovoljenje, posredovano preko Copyright Clearance Center, Inc. 24 (b) Določitev velikosti glomerulov s prostorsko registracijo – barvno kodiranje predstavlja velikost glomerulov, kjer je rdeč največji predmet, roza pa najmanjši. Prirejeno z dovoljenjem Ameriškega združenja za nefrologijo, iz Kidney360, Avtomatizirane analize slik glomerularne hipertrofije v mišjem modelu diabetične nefropatije, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., zvezek 6, izdaja 6 , 2020; dovoljenje posredovano preko Copyright Clearance Center, Inc. 25 (c) Sledenje vaskulaturi in inervaciji, ki prikazuje 3D rekonstrukcijo nepoškodovane ledvice z imunskim označevanjem simpatičnih živcev (zeleno), vaskulature (magenta) in združenih (levo). Prirejeno iz Kidney International, zvezek 96, številka 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T, et al., Celovita tridimenzionalna analiza (CUBIC-kidney) vizualizira nenormalne ledvične simpatične živce po ishemiji/reperfuzijski poškodbi, strani 129–138, Copyright ª 2019, z dovoljenjem Mednarodnega združenja za nefrologijo. 26 (d) Morfometrija podocitov v posameznih glomerulih z uporabo imunskega označevanja za podocitno specifični marker p57 (zeleno) in marker DNA 4 0,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Plošče prikazujejo (levo) 3D rekonstrukcijo in (desno) upodobljene površine. Prilagojeno z dovoljenjem Ameriškega združenja za nefrologijo iz Journal of the American Society of Nephrology, Validation of a Three-Dimensional Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., letnik 27, številka 10, 2016; dovoljenje posredovano preko Copyright Clearance Center, Inc. 27 (e) Celična dinamika z uporabo sledenja rodu, ki prikazuje podocite (skrajno levo), parietalne epitelne celice (PEC), ki tvorijo celične polmesece v 3D (sredina-levo), 2D pogled na PEC, ki napadajo glomerularna stran z žilno poškodbo (sredina-desno) in 2D vizualizacija tubularnega izhoda (skrajno desno). Prirejeno po Kidney International, zvezek 96, številka 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L, et al., Nova 3D analiza z uporabo optičnega čiščenja tkiva dokumentira razvoj hitro napredujočega glomerulonefritisa pri miših, strani 505–516, Copyright ª 2019, International Society of Nephrology, pod licenco CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Vizualizacija režne diafragme pri naraščajočih povečavah od leve proti desni. Prirejeno po Kidney International, zvezek 99, številka 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, et al., Hiter in preprost protokol čiščenja in otekanja za 3D in situ slikanje ledvic po lestvicah, strani 1010–1020 , Copyright ª 2021, International Society of Nephrology, pod licenco CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Če želite optimizirati ogled te slike, si oglejte spletno različico tega članka nawww.kidney-international.org.
svetlobno mikroskopijo za izvedbo tubularne analize v nepoškodovanih ledvicah z uporabo hidrogelne vgradnje in mikroskopije s svetlobnimi ploščami ter kvantifikacijo ene celice v rezinah ledvic z uporabo hidrofobnega čiščenja in konfokalne mikroskopije, saj je bila vsaka kombinacija bolj primerna za specifično raziskovalno vprašanje. Kombinacije optičnega čiščenja in napredne svetlobne mikroskopije so uporabili Tahaei et al. 35, ki je označil spolni dimorfizem v dolžini distalnega zvitega tubula, ki lahko določa njegovo sposobnost prilagajanja fiziološkemu stresu, in Schuh et al. 36, ki je razkril aksialne razlike v privzemu liganda proksimalnega tubula in endolizosomski funkciji, pri čemer je poudaril, da je segment S1 visoko specializiran za reabsorbiranje proteinov preko receptorsko posredovane endocitoze. V nedavni študiji so Blanc et al. 2 analiziral model nastanka ciste, ki je pokazal, da so se ciste razvile samo v specifičnih segmentih nefrona, ki so določali njihovo obliko in so se nahajale v bližini normalnih nedilatiranih tubulov. Na splošno imamo zdaj več primerov neposredne uporabe optičnega čiščenja za sistematično analizo tubulointersticijskega predela.
Izguba in hipertrofija podocitov.Glomerul je edinstven primer za analizo nedotaknjenih funkcionalnih enot znotraj organa. Zlasti študija izčrpavanja podocitov je imela neposredno korist od tega tehnološkega napredka, saj metodologije, ki temeljijo na zlatem standardu, zahtevajo znatne naložbe časa in virov. 37 Prvo orodje za 3D morfometrično analizo podocitov intaktnih mišjih glomerulov kombinirano imunsko označevanjeledvicarezine z uporabo modificiranega protokola posredne imunofluorescence, hidrofobnega optičnega čiščenja in konfokalne mikroskopije, ki je olajšal kvantifikacijo skupnega števila podocitov v celih posameznih glomerulih z znano prostornino. Menimo, da je ta pristop idealen za preučevanje procesov, ki vplivajo na določeno podskupino struktur (npr. izguba podocitov, ki vodi v žariščno in segmentno glomerulosklerozo). 27 Ista tehnika je bila kasneje uporabljena za opredelitev vloge hipertrofije podocitov kot kompenzacijskega odziva po izgubi podocitov, mehanizma, ki ga posreduje tarča signalne poti rapamicina pri sesalcih. 38 Medtem ko sta se ti dve študiji osredotočali na analizo glomerulnih podocitov, se lahko ta cevovod, ki temelji na običajnem imunskem označevanju, uporabi za karakterizacijo morfoloških sprememb katere koli vrste celice pri visoki prostorski ločljivosti.
Evolucija celičnih polmesecev.Še eno pomembno orodje, ki ga je bilo treba uspešno integrirati v orodje za 3Dledvicamorfometrija je sledenje genetske linije. Večina metod optičnega čiščenja običajno povzroči določeno stopnjo dušenja fluorescence (ki se razlikuje od blage do hude). 6 Nedavno smo predstavili protokol, ki združuje sledenje liniji, optično čiščenje in večfotonsko mikroskopijo za celovito analizo izgube podocitov in aktivacije parietalnih epitelijskih celic. 28 V tej študiji je bila izguba podocitov opredeljena kot značilnost eksperimentalnega polmesečastega nefritisa z uporabo presnovnega označevanja podocitov z okrepljenim zelenim fluorescenčnim proteinom. Razvoj celičnih polmesecev je bil vizualiziran in kvantificiran na podlagi proliferacije in migracije parietalnih epitelijskih celic, ki so bile prav tako označene z okrepljenim zelenim fluorescenčnim proteinom in sledile med potekom eksperimentalnega modela polmesečastega nefritisa. Analiza nepoškodovanih glomerulov je omogočila identifikacijo žariščne izgube podocitov in nastanek lezije, ki je napredovala do tubularnih okluzij s parietalnimi epitelijskimi celicami, kar je povzročilo nastanek atubularnih glomerulov. Ta študija utira pot prihodnjim študijam kompleksnih imunsko-epitelnih interakcij znotraj nepoškodovanegaledvice.
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DIALIZO LEDVIC/LEDVIC
Glomerularna filtracijska pregrada.Pomembno diagnostično orodje za rutinsko oceno bolezni glomerulov je ultrastrukturna analiza biopsij ledvic z elektronsko mikroskopijo. Alternativo elektronski mikroskopiji lahko najdemo na področju ekspanzijske mikroskopije, katere cilj je po definiciji povečati optično ločljivost s povečanjem dimenzij tkiva. Z leti sta Unnersjo-Jess et al. 39,40 so zagotovili več protokolov za vizualizacijo nanometrskih struktur vledvica.Pred kratkim so ti raziskovalci poročali o hitrem in preprostem postopku za 3D vizualizacijoledvicamorfologijo, ki združuje koncepte optičnega čiščenja in širjenja tkiva za razrešitev nanometrskih struktur z uporabo običajne konfokalne mikroskopije. 29 Ta protokol je bil uporabljen za vizualizacijo in kvantifikacijo več patoloških značilnosti pri miših in ljudehledvicabiopsije, vključno z izbrisom stopalnega procesa, spremembami glomerularne bazalne membrane, dolžino reže diafragme, depoziti IgG in značilnostmi klasične patologije (npr. glomeruloskleroza, tubulointersticijska fibroza in tubularna atrofija). Če povzamemo, ta metoda omogoča večstopenjsko vizualizacijo in kvantifikacijo ledvične patologije z uporabo preproste metode in dostopnih orodij za analizo slike. Razširljivost in implementacija tega pristopa v klinični praksi bosta verjetno določeni s potrebo po napredni opremi za svetlobno mikroskopijo in razvojem avtomatiziranih orodij za analizo slike.
Zaključek
Trenutni spekter metod čiščenja tkiv vključuje preproste tehnike, ki jih je mogoče uporabiti v večini laboratorijev za izboljšanje 3D slikanja na običajno dostopnih mikroskopih. Ko bodo priložnosti, ki jih ponujajo ti novi pristopi, postale očitne, pričakujemo širšo uporabo specializiranih mikroskopskih sistemov za učinkovito slikanje očiščenega tkiva pri visoki ločljivosti ter razvoj prilagojenih raziskovalnih in kliničnih delovnih tokov za reševanje specifičnih vprašanj. Področje nevroznanosti je služilo kot testni poligon za čiste metode in aplikacije slikanja tkiv. V tem kontekstu so bili razviti avtomatizirana analiza slik, novi pristopi k preučevanju celične povezljivosti in projekti atlasa ekspresije genov in beljakovin v celotnem tkivu. Verjetno bodo podobni pristopi prinesli nove vpoglede v celično anatomijo in soodvisnost celičnih populacij v razvoju in odraslihledvica.
Praktične omejitve teh napredkov vključujejo stroške strojne opreme za slikanje in težave pri rokovanju, shranjevanju in analiziranju velikih naborov podatkov. Druge omejitve izhajajo iz pomanjkanja ponovljivosti obarvanja s tkivi, na katera različno vplivajo pogoji fiksacije in označevanje protiteles. Posledično obstaja potreba po novih 3D analizah, ki jih je treba kritično oceniti in primerjati z uveljavljenimi metodami. Kljub osupljivemu napredku pri ocenjevanjuledvicarazvoj in odrasliledvicastrukture in bolezni, poudarjenih v tem pregledu, verjamemo, da najboljše čiščenje tkiv in 3D slikanje šele prihaja in bo verjetno vznemirljivo področje rasti zaledvicaraziskovanje v prihodnjih desetletjih.
