Celovita analiza regulatorjev piroptoze in tumorskega imunskega mikrookolja pri svetloceličnem karcinomu ledvičnih celic

Za več informacij. stiktina.xiang@wecistanche.com

Povzetek

Ozadje: Vse več dokazov kaže, da bi piroptoza lahko uravnavalatumorsko imunsko mikrookolje(TIME), da vpliva na razvoj tumorja. Kot visoko imunogeni tumor ima svetlocelični ledvičnocelični karcinom (ccRCC) koristi od imunoterapije, vendar so sorodne raziskave o piroptozi v ČASU ccRCC še vedno pomanjkljive.

Metode: Razpoložljivi podatki, pridobljeni iz baz podatkov TCGA in GEO, so bili analizirani, da bi identificirali različne profile izražanja piroptoze v ccRCC in normalnih tkivih, korelacija regulatorjev piroptoze s TIME pa je bila ocenjena v cCRCC.

Rezultati: Glede na soglasno analizo grozdenja sta bili ugotovljeni dve diferencialni stopnji izražanja podtipov, ki vplivata na prognozo bolnika in sta bili povezani s stopnjo in stopnjo histološkega tumorja. Imunske celice smo izračunali z algoritmom CIBERSORT. Višje infiltrirane ravni naivnih celic B, celic T v mirovanju spomina CD4, celic NK v mirovanju, monocitov in makrofagov so opazili v skupini 1, medtem ko so bile v skupini 2 opažene višje infiltrirane ravni celic CD8 plus T, celic T folikularnih pomočnic in Tregs. Analiza obogatitve nabora genov je pokazala, da je bil grozd 2 obogaten z več imunsko povezanimi potemi, vključno s signalno potjo JAK-STAT. Poleg tega je bila čezmerna ekspresija osmih imunskih kontrolnih točk povezana z razvojem ccRCC, zlasti v skupini 2. Kot štirje potencialno ključni regulatorji piroptoze je bilo potrjeno, da so AIM2, CASP5, NOD2 in GZMB regulirani navzgor v ccRCC z analizo RT-qPCR in dodatno preverjeni z Baza podatkov HPA. Nadaljnja analiza pan-raka je pokazala, da so bili ti štirje regulatorji piroptoze različno izraženi in povezani s ČASOM pri več vrstah raka.

Zaključek: Ta študija je zagotovila celovit pogled na regulatorje piroptoze v ČASU ccRCC, kar lahko zagotovi potencialno vrednost za imunoterapijo.

Ključne besede: svetlocelični ledvičnocelični karcinom, piroptoza, tumorsko imunsko mikrookolje, imunske kontrolne točke, imunoterapija

Kliknite, če želite izvedeti, kako herba cistanches zdravi delovanje ledvic

Ozadje

Karcinom ledvičnih celic(RCC) je najpogostejši maligni solidni tumor ledvic pri odraslih, ki predstavlja približno 3 odstotke vseh malignih obolenj pri odraslih in 90 odstotkov malignih obolenj ledvic [1]. Trenutno je število smrti zaradi RCC vsako leto po vsem svetu preseglo 1,00,000, stopnji obolevnosti in umrljivosti pa naraščata za 2-3 odstotkov vsakih 10 let [2]. Glede na različico patološke klasifikacije RCC WHO iz leta 2004 je incidenca svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic (ccRCC) približno 70 odstotkov [3]. Čeprav je kirurška resekcija še vedno najboljše zdravljenje ccRCC, trenutno ni učinkovitega pooperativnega adjuvantnega zdravljenja in ccRCC ni občutljiv na radioterapijo in kemoterapijo. Po literaturi se pri 20-40 odstotkih bolnikov po operaciji ponovi [4]. Kot visoko imunogeni tumor lahko ccRCC koristi imunoterapijo.

Piroptoza je vrsta programirane celične smrti, ki jo spremljavnetjeki jih sproži okužba s patogenimi mikroorganizmi ali drugi škodljivi signali [5]. Za piroptozo je značilno predvsem otekanje celic, liza in sproščanje citoplazemske vsebine. Ustrezna piroptoza je pomemben mehanizem za gostitelja, da se upre okužbi s tujimi patogenimi mikroorganizmi. Vendar je prekomerna piroptoza za gostitelja škodljiva ali celo usodna. Vse več raziskav je pokazalo, da ima piroptoza pomembno vlogo tudi pri nastanku tumorjev [6]. Piroptoza ustvari okolje, ki zavira tumor, s sproščanjem vnetnih dejavnikov. Vendar pa lahko piroptoza tudi oslabi imunsko funkcijo telesa na tumorske celice in pospeši rast tumorjev pri različnih oblikah raka. Nekatere študije so pokazale, da je učinkovit protivnetni učinek piroptoze povezan z regulacijo tumorskega imunskega mikrookolja [7]. Te ugotovitve kažejo, da ima piroptoza pomembno vlogo pri razvoju tumorja in protitumorskem procesu. Vendar učinek piroptoze na prognozo ccRCC ni jasen. Še vedno manjka celovito razumevanje piroptoze pri ccRCC, vključno s preslušavanjem med regulatorji piroptoze in tumorskim imunskim mikrookoljem.

V tej študiji smo izvedli obsežno retrospektivno analizo, ki temelji na zbirki podatkov The Cancer Genome Atlas (TCGA) in zbirki podatkov Gene Expression Omnibus (GEO), da bi ocenili vpliv piroptoze na TIME in nadalje raziskali osnovne mehanizme med piroptozo in posameznim TIME. karakterizacije na podlagi analize soglasnih grozdov. Poleg tega je ta študija preverila tudi razmerje med piroptozo in izražanjem imunske vroče kontrolne točke.

Materiali in metode

Zajem podatkov in identifikacija diferencialne ekspresije

Podatki sekvenciranja RNA (RNA-seq) 539 tkiv ccRCC in 72 normalnihledvicatkiva in ustrezne klinične značilnosti iz baze podatkov TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov/). Podatki GSE46699 in GSE53757 iz baze podatkov GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) so bili zbrani in uporabljeni za oceno izražanja regulatorja piroptoze. Poleg tega so bili podatki o ekspresiji genov TCGA pan-cancer za 33 vrst malignih tumorjev in ustrezni klinični podatki, kot so rezultati stebla na podlagi mRNA (RNAss) in metilacije DNA (DNAss), kot tudi imunski podtipi, pridobljeni z univerze. Baza podatkov California Santa Cruz (UCSC Xena, http://xena.ucsc.edu/). 37 regulatorjev piroptoze je predstavljenih v dodatni datoteki 4: tabela S1 in so bili izvlečeni iz prejšnjih raziskav [8, 9]. Z uporabo paketa "limma" več kot dvakratne spremembe in stopnja lažnih odkritij (FDR, prilagojena p-vrednost)<0.05 is="" considered="" differential="" gene="" expression.="" the="" immunohistochemistry="" (ihc)="" staining="" images="" of="" pyroptosis="" regulators="" in="" normal="" kidney="" and="" tumor="" tissues="" were="" analyzed="" and="" obtained="" from="" the="" hpa="" database="" (http://www.proteinatlas.org/).to="" compare="" the="" expression="" between="" normal="" and="" tumor="" samples,="" all="" tissues="" were="" selected="" using="" the="" same="">

Konsenzno združevanje

Univariatna Coxova regresijska analiza je bila uporabljena za ekstrakcijo regulatorjev piroptoze preko vrednosti p "preživetja" paketa R<0.05). consensus="" clustering="" was="" performed="" to="" explore="" the="" potential="" molecular="" subtype="" between="" the="" bca="" patients="" using="" the="" r="" package"consensus="" cluster="" plus".="" the="" cluster="" count="" (k)="" was="" set="" from="" 1="" to="" 9,="" and="" the="" best="" optimal="" k="" value="" was="" selected="" for="" further="">

Ocena tumorskega imunskega mikrookolja

CIBERSORT, orodje za analizo, ki temelji na podpisu imunskega gena LM22, je bilo uporabljeno za oceno ravni tumorske imunske infiltracije ccRCC. Algoritem je bil izveden za 1000 permutacij in vzorcev ccRCC z izhodom P<0.05 were="" selected="" for="" further="" analysis.="" the="" "estimate"="" package="" in="" r="" was="" used="" to="" evaluate="" the="" immune="" score="" and="" the="" stromal="" score.="" moreover,="" 8="" com-mon="" immune="" checkpoint="" genes,="" including="" pd-1,="" pd-l1,="" pd-l2,="" ctla4,="" siglec15,="" tigit,="" tim3,="" and="" lad3,="" were="" extracted="" and="" evaluated="" for="" their="" correlations="" with="" pyroptosis="" regulators="" in="">

Analiza funkcionalne obogatitve

Analiza genske ontologije (GO) in analiza signalne poti Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sta bili izvedeni z uporabo paketa "cluster Profiler" v R. Poleg tega je bila izvedena analiza obogatitve genskega nabora (GSEA) za identifikacijo razlik v nizu geni, izraženi med obema grozdoma pri obogatitvi poti KEGG. Število permutacij je bilo izvedeno 1000-krat za

vsako analizo in poti s prilagojeno p-vrednostjo<0.05 and="" q="" values=""><0.05 were="" considered="" statistically="">

Napoved odziva na zdravilo

Na podlagi informacij, pridobljenih iz baze podatkov Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) (https://www.cancerrxgene.org/), so bile izračunane kemoterapevtske občutljivosti za ccRCC. Za napovedovanje kemoterapevtskega odziva so bila izbrana tri pogosta klinična zdravila, paket R "pRRophetic" pa je bil uporabljen za oceno kemoterapevtskega odziva, določenega s polovično največjo inhibitorno koncentracijo (IC50).

Celične linije in analiza RT-qPCR

Človeški celični liniji ccRCC, 786-O in Caki-1, je zagotovil Haixiang Shen, normalno celično linijo epitelija ledvične skorje, HK-2, pa Yanhong Ma.RPMI Za gojenje celic je bil uporabljen medij 1640 (Gibco), dopolnjen z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS, Gibco). In vse celice so bile gojene pri 37 stopinjah s 5 odstotki ogljikovega dioksida. Celotne RNA smo ekstrahirali iz celic s kompletom Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Prva veriga (cDNA) je bila reverzno prepisana in uporabljena kot predloga za analizo qPCR, kot je opisano prej [10]. Stopnje izražanja regulatorjev piroptoze (AIM2, NOD2, GZMB in CASP5) so bile izmerjene z uporabo SYBR Green qPCR Kit (Takara, Japonska). Ime gena in sekvence primerjev so navedene v Dodatni datoteki 5: Tabela S2. Ravni mRNA vseh genov so bile normalizirane na GAPDH (endogena normalizacijska referenca).

Statistična analiza

Statistična analiza je bila izvedena s programsko opremo R (http://www.R-project.org, različica 4.0.3), programskim jezikom PERL (različica 5.32.1.1, https://www.perl. org). /) in GraphPad Prism 8.0. Korelacijski koeficienti so bili izračunani s Spearmen in analizo korelacije razdalje. Narisane so bile Kaplan-Meierjeve krivulje in za izračun pomembne razlike v preživetju je bil uporabljen test log-rank. Za analizo zveznih spremenljivk je bil uporabljen Wilcoxonov test s predznakom, medtem ko je bil za analizo kategoričnih podatkov uporabljen test hi-kvadrat. Rezultati RT-qPCR so bili izraženi kot povprečje ± SEM. Razlike med skupinami so bile ocenjene z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil ad hoc Dunnettov test večkratnih primerjav za primerjavo z normalnimi ledvičnimi celicami. P-vrednost, manjša od 0,05, je veljala za statistično pomembno za vse analize.

Rezultati

Identifikacija in klasifikacija regulatorjev, ki so različno povezani s piroptozo

Ekspresija 37 genov, povezanih s piroptozo, je bila primerjana v kohorti TCGA-KIRC in 11 genov je bilo identificiranih kot različno izraženi geni (slika 1A). Po uporabi dveh neodvisnih nizov podatkov iz baze podatkov GEO za zunanjo ponazoritev izražanja teh 11 genov v ccRCC se je pokazalo, da je šest regulatorjev, povezanih s piroptozo (AIM2, CASP5, NLRP3, NOD2, GZMA in GZMB), močno izraženih v ccRCC (slika .1B). V kombinaciji s prognostičnimi informacijami o pacientu, prenesenimi iz naborov podatkov TCGA, je bila nato uvedena univariatna Coxova regresija za pregled genov iz teh 6 regulatorjev in štirje od njih (AIM2, CASP5, NOD2 in GZMB) so bili pomembno povezani s prognozo bolnika s ccRCC (slika 1C) . Za nadaljnjo raziskavo razmerja med izražanjem teh 4 regulatorjev in podtipi ccRCC je bila izvedena soglasna analiza združevanja v skupine s kohortnimi bolniki TCGA-KIRC. Analiza soglasnega združevanja je bila izvedena pri bolnikih s ccRCC na podlagi teh štirih regulatorjev piroptoze in rezultat je pokazal, da je bila spremenljivka združevanja (k) =2 identificirana kot najvišja stabilnost združevanja od k =1 do 9, kar kaže na da bi lahko bolnike s ccRCC razdelili v dve skupini z najvišjimi korelacijami znotraj skupine in najnižjimi korelacijami med skupinami (slika 1D). Poleg tega so imeli bolniki v skupini 1 ugodno skupno preživetje (OS) v primerjavi s tistimi v skupini 2 (slika 1E).

ČASOVNA analiza grozdov glede na regulatorje piroptoze

Da bi raziskali, katere poti so obogatene v grozdih, je bila izvedena analiza GSEA za identifikacijo pomembnih poti KEGG, povezanih z dvema grozdoma. Rezultati so pokazali, da interakcija citokinskega receptorja, signalna pot receptorja celice T, procesiranje in predstavitev antigena, signalna pot kemokina, citotoksičnost, ki jo posredujejo celice naravne ubijalke, signalna pot receptorja, podobnega tollu, signalna pot receptorja celice B in signalizacija JAK-STAT poti so bile pomembno povezane z grozdom 2 (dodatna datoteka 1: slika S1), kar kaže, da so bili grozdi, ki vsebujejo regulatorje piroptoze, povezani s tumorskim imunskim mikrookoljem. Da bi torej raziskali razlike v imunski funkciji med obema skupinama, so izračunali rezultate ESTIMATE in pokazali, da je imela skupina 2 znatno višje ocene ESTIMATE, stromalne in imunske ocene v primerjavi s skupino 1 (slika 2A), štirje regulatorji piroptoze pa so bili pozitivni povezanih s temi rezultati (slika 2B). Poleg tega sta obe skupini pokazali pomembne razlike v infiltraciji imunskih celic (slika 2C). Skupina 1 je imela višje infiltrirane ravni naivnih celic B, celic T v mirovanju spomina CD4, celic NK v mirovanju, monocitov, makrofagov M0, makrofagov M2, aktiviranih dendritičnih celic in mirujočih mastocitov, medtem ko je bila skupina 2 višja povezane s plazemskimi celicami, T-celicami CD8, T-celicami, aktiviranimi spominom, T-celicami folikularnimi pomočnicami, T-celicami regulacijskimi (Tregs), T-celicami gama delta in aktiviranimi NK-celicami. Analiza korelacije med štirimi regulatorji in vrstami imunskih celic je pokazala, da so imeli štirje regulatorji pozitivno ali negativno korelacijo z večino tipov imunskih celic (slika 2D). Zanimivo je, da je nadaljnja preiskava diferencialne ekspresije imunskih genov med dvema grozdoma pokazala, da je bila množica imunskih genov regulirana navzgor v skupini 2, medtem ko je bilo samo 5 genov reguliranih navzdol (dodatna datoteka 2: slika S2A). Za analizo korelacije je bilo izbranih 10 genov, ki so bili najbolj regulirani navzgor in navzdol, rezultat pa je prikazan v dodatni datoteki 2: slika S2B. GO analiza bioloških procesov je pokazala, da je bila diferencialna ekspresija imunskih genov med grozdi obogatena z aktiviranjem signalne poti receptorjev celične površine in transdukcijo signalaimunski odziv. Analiza celične komponente je pokazala, da je bilo v imunoglobulinskem kompleksu veliko različno izraženih imunskih genov. Analiza molekularne funkcije je pokazala, da različno izraženi imunski geni vključujejo vezavo antigena. Analiza KEGG je pokazala, da so bili različno izraženi imunski geni obogateni z interakcijami citokin-citokin receptor (dodatna datoteka 2: slika S2C, D). Ti rezultati so pokazali, da so skupina 2 in štirje regulatorji vpleteni v tumorsko imunsko mikrookolje.

Povezava regulatorjev piroptoze z zaviralci imunske kontrolne točke in ciljne občutljivosti na zdravila. Terapije z zaviralci imunske kontrolne točke (ICI) so bile uveljavljene kot močna možnost zdravljenja več vrst tumorjev, medtem ko le del bolnikov koristi od takšne terapije. Zato je bilo nadalje raziskano diferencialno izražanje ICI v različnih podtipih. Osem genov vročih imunskih kontrolnih točk (SIGLEC15, TIGIT, PD-L1, TIM3, PD-1, CTLA4, LAG3 in PD-L2) je bilo pozitivno povezanih s skupino 2 (sl. 3A, B). Zanimivo je, da so bili štirje regulatorji tesno povezani z večino ICI, medtem ko med GZMB in SIGLEC15 ni bilo pomembne povezave (slika 3C). Poleg tega sta ob upoštevanju vrednosti kliničnega zdravljenja pri občutljivosti na tarčna zdravila sunitinib in temsirolimus pokazala večjo občutljivost v skupini 1, medtem ko je bil aksitinib tesno povezan z skupino 2 (slika 3D-F). Ti rezultati so pokazali, da lahko ta razvrstitev zagotovi določeno referenčno vrednost za klinično zdravljenje različnih bolnikov s ccRCC.

Stratifikacijska analiza klinične uporabnosti grozda Za nadaljnje raziskovanje klinične vrednosti razmerja med to klasifikacijo in različnimi kliničnimi značilnostmi so bili bolniki s ccRCC razdeljeni v različne skupine glede na starost bolnika, spol, stopnjo in stopnjo bolezni. Omeniti velja, da je bila višja stopnja bolezni bolj povezana z bolniki v skupini 2, pa tudi patološka stopnja (tabela 1; slika 4B). Nadaljnja analiza razmerja med regulatorji piroptoze in kliničnimi značilnostmi je pokazala, da se je raven izražanja štirih regulatorjev povečala s povečanjem stopnje bolezni in patološke stopnje, medtem ko je bil samo AIM2 bolj izražen pri moških kot pri ženskah. Med izražanjem štirih regulatorjev in starostjo bolnika ni bilo pomembne razlike (slika 4A).

Eksperimentalno preverjanje izražanja štirih regulatorjev Na podlagi bioinformatske analize izražanja teh štirih regulatorjev smo analizirali nivoje izražanja mRNA in proteinov. V primerjavi z normalnimi celicami so bile ravni izražanja teh 4 genov v različnih stopnjah regulirane navzgor v dveh celičnih linijah ccRCC (slika 5A). Skladno s tem so vzorci izražanja beljakovin AIM2, NOD2 in GZMB iz baze podatkov HPA razkrili, da so bili regulatorji prekomerno izraženi tudi v tkivu ccRCC v primerjavi z normalnim tkivom (slika 5B).

Štirje vzorci izražanja regulatorja piroptoze pri več vrstah raka

Nadaljnja preiskava vzorca izražanja teh štirih regulatorjev piroptoze pri pan-raku je pokazala, da so bili štirje regulatorji piroptoze različno izraženi v več oblikah raka (slika 6A). AIM2 je bil različno izražen v več vrstah raka, vključno z rakom mehurja, dojk, požiralnika, ledvic in jeter , pljuča, želodec in endometrij, kot tudi CASP5, NOD2 in GZMB (slika 6A). Nadaljnja analiza je pokazala, da je bil AIM2 najbolj pozitivno povezan s HNSC, medtem ko je bil CASP5 negativno povezan s COAD (slika 6B). AIM2 in GZMB sta bila dva gena z najpomembnejšo pozitivno povezavo (korelacijski koeficient =0.59, slika 6C).

Med napredovanjem raka lahko tumorske celice postopoma izgubijo diferenciran fenotip in pridobijo lastnosti, podobne matičnim celicam [11]. Na splošno lahko RNAss in DNAss uporabimo za oceno izvornosti izvornih celic raka [12]. Zato je bila raziskana korelacija med regulatorji piroptoze in izvorom tumorja, merjeno z RNAss in DNAss. Štirje regulatorji so bili pomembno pozitivno ali negativno povezani z RNAss in DNAss pri večini pan-rakov (slika 6D). Predvsem v KIRC sta bila AIM2 in GZMB pozitivno oziroma negativno povezana z RNA, medtem ko je bil NOD2 negativno povezan z DNAss (dodatna datoteka 3: Slika S3).

Povezava štirih regulatorjev piroptoze s tumorskim imunskim mikrookoljem pri pan-raku

Na podlagi pomembnega regulativnega učinka genov za piroptozo na različne tipe imunskih celic so bili štirje regulatorji nadalje raziskani v mikrookolju pan-raka. Zanimivo je, da razen AIM2 je bil negativno povezan z DLBC in CASP5 negativno povezan s COAD in READ v rezultatu ESTIMATE in stromalnem rezultatu, so bili drugi pozitivno povezani z rakom v imunskem rezultatu, stromalnem rezultatu in rezultatu ESTI-MATE (slika 7A). ). Da bi raziskali ekspresijo štirih regulatorjev piroptoze v različnih imunskih podtipih pri pan-raku, so bili imunski infiltrati razdeljeni na šest vrst za analizo, ki ustrezajo od spodbujanja tumorja do tumor supresije, vključno s celjenjem ran, dominantnim IFN-y, vnetjem, limfociti osiromašen, imunološko miren in prevladujoč TGF. Zanimivo je, da so bili vsi štirje regulatorji piroptoze pomembno povezani z imunskimi podtipi, štirje regulatorji piroptoze pa so bili najbolj izraženi v dominantnem IFN-y, ki mu je sledil dominanten TGF (slika 7B). V KIRC pa je bila ekspresija štirih regulatorjev piroptoze največja v C2 kot pri analizi pan-raka. AIM2, ki je imel drugo najvišjo izraženost v imunskih podtipih, je bil povezan s Cl, medtem ko so bili NOD2, CASP5 in GZMB povezani s C6 (slika 2E).

Diskusija

Kirurška resekcija je prvo zdravljenje karcinoma ledvičnih celic v naši klinični praksi. Še vedno pa je težko odstraniti metastazo karcinoma ledvičnih celic. Metastatski karcinom ledvičnih celic je odporen na radioterapijo in sistemsko terapijo, vključno s hormonsko terapijo in kemoterapijo [13]. Klinično preskušanje nivolumaba, zaviralca imunske kontrolne točke proti PD-L1, za zdravljenje metastatskega ccRCC (CheckMate-025) je pokazalo, da ima nivolumab znatno boljše OS, razmerje ogroženosti, ORR in splošno stopnjo odziva [ 14]. Te študije kažejo, da ima uporaba imunoterapije pri zdravljenju ccRCC velike možnosti. Poglobljena analiza heterogenosti ccRCC TIME lahko pomaga zagotoviti natančno in individualizirano vodenje imunoterapije za izboljšanje učinka zdravljenja in kakovost bolnikove prognoze preživetja. Tu so bili bolniki s ccRCC ločeni v dva neodvisna molekularna podtipa z različnimi kliničnimi značilnostmi, izražanjem imunskega gena in TIME s soglasnim združevanjem za štiri glavne regulatorje piroptoze. Glede na to študijo je imela skupina 2 slabšo prognozo kot skupina 1, vendar je bila skupina 2 bolj občutljiva na imunoterapijo.

Med intrinzičnimi mehanizmi smrti celic je piroptoza deležna vse večje pozornosti. Piroptoza je na novo priznana vrsta programirane vnetne celične smrti, ki se aktivira po poteh, ki jih posredujejo klasični kaspazni-1 inflamasomi ali neklasične kaspaze-4, kaspaze-5 in kaspaze{{4} } [15]. Pred kratkim so novi dokazi poročali o pomembni vlogi piroptoze pri tumorigenezi človeških malignomov [16,17]. Piroptoza zavira rast tumorja pri raku debelega črevesa in danke, raku jeter in kožnem raku, vendar ima dvosmeren učinek na raka dojke [18-20]. Pri ccRCC ostaja neznano, kako geni, povezani s piroptozo, medsebojno delujejo in ali so povezani s časom preživetja bolnikov. Izražanje večine regulatornih genov za piroptozo je pozitivno povezano in ima pomembno prognostično vlogo pri ccRCC. Te ugotovitve kažejo, da imajo lahko regulatorji piroptoze ključno vlogo pri uravnavanju tumorigeneze in razvoja ccRCC. V tej študiji so identificirali štiri regulatorje piroptoze, ki so močno izraženi pri raku ledvic in povzročajo slabo prognozo. AIM2 je citosolni prirojeni imunski receptor, ki prepozna dvoverižno DNA (dsDNA), ki se sprosti med celično motnjo in patogenim napadom. Aktiviran AIM2 aktivira klasično pot piroptoze prek kaspaze-1 [21]. AIM2 ima lahko edinstveno vlogo pri različnih vrstah raka [22-25] in ta študija je pokazala, da ima AIM2 vlogo pri spodbujanju raka pri ccRCC. Kaspaza-5(CASP5), podobna kaspazi-4 in kaspazi-1l, je izvršni protein od kaspaze-1-neodvisne piroptoze [26]. GZMB uporabljajo citotoksični limfociti kot molekularno orožje za obrambo pred z virusom okuženimi in maligno transformiranimi gostiteljskimi celicami[27]. Nizka izraženost GZMB je povezana z zgodnjimi metastazami pri kolorektalnem raku, kar kaže na infiltracijo krvnih žil in živcev [28]. Zanimivo je, da je naša analiza pokazala, da je GZMB pozitivno koreliran gen pri raku ledvic. NOD2 je receptor za prepoznavanje vzorcev, ki lahko uravnava gostiteljev prirojeni imunski odziv in preprečuje vnetje, steatozo in debelost [29]. Zunajcelični histon H3, induciran z LPS, lahko povzroči piroptozo med sepso prek poti NOD2 in VSIG4/NLRP3 [30]. Še vedno ni znano, kako ti geni medsebojno delujejo med celično piroptozo v ccRCC.

V naši klinični praksi so zaviralci tirozin kinaze receptorja vaskularnega endotelnega rastnega faktorja (VEGFR-TKI) postali standard zdravljenja mRCC [31]. Sunitinib, zaviralec širokega spektra receptorskih tirozin kinaz, se pogosto uporablja kot standard zdravljenja prve izbire zdravljenja napredovalega ccRCC [32]. Vendar niso vsi bolniki z RCC občutljivi na zdravljenje s sunitinibom in večina bolnikov bo po nekaj mesecih zdravljenja razvila odpornost na sunitinib. Zato je ključ do izbire sunitiniba za zdravljenje izbira bolnikov, ki so občutljivi na sunitinib. Ta študija je pokazala, da je grozd 1 bolj občutljiv na sunitinib, medtem ko je grozd 2 bolj občutljiv na aksitinib.

Razumevanje izražanja regulatorjev piroptoze v ccRCC pred zdravljenjem lahko pomaga oblikovati bolj optimizirane ciljne možnosti zdravljenja, ki bodo koristile bolnikom. Nekatere študije so pokazale, da je učinkovit protivnetni učinek piroptoze povezan z regulacijo tumorskega imunskega mikrookolja [33]. Vendar je potencialna vloga piroptoze v imunskem mikrookolju ccRCC še vedno nedosegljiva. Na podlagi ekspresijskih značilnosti regulatorjev piroptoze je ta študija pokazala, da imajo bolniki v različnih skupinah različne korelacije z različnimi imunskimi infiltracijami. V skupini 1 so opazili višje infiltrirane ravni celic B, ki še niso bile celice T, celic CD4 v mirovanju, celic NK v mirovanju, monocitov, makrofagov M0 in makrofagov M2. Po drugi strani pa je bila skupina 2 bolj povezana s CD8 plus T celice, Tregs in T folikularne celice pomočnice. Tregi lahko izločajo različne imunosupresivne citokine, kar vodi do imunskega pobega tumorskih celic. Študije so pokazale, da Tregs učinkovito zavirajo proliferacijo efektorskih celic T in visoka raven infiltracije celic CD8＋ T je neugoden prognostični dejavnik za ccRCC [34,35]. Slaba napoved grozda 2 in zaključki teh dveh sklepov so medsebojno skladni. Grozd 2 je v pozitivni korelaciji z osmimi vročimi ICI (SIGLEC15, TIGIT, PD-L1, T IM3, PD-1, CTLA4, L AG3 in PD-L2). Na podlagi teh ugotovitev so lahko slabi rezultati preživetja grozda 2 posledica zmanjšane ravni protitumorske imunosti, grozd 2 pa je morda bolj koristen pri imunoterapiji. Rezultati GSEA kažejo, da je grozd 2 povezan z različnimi imunskimi regulativnimi signalnimi potmi. Pomembno je, da je signalna pot JAK-STAT povezana s karcinogenezo in imunsko infiltracijo ccRCC. Tako smo špekulirali, da lahko piroptoza uravnava sestavo tumorskega imunskega mikrookolja. Naša študija je pokazala, da je lahko ccRCC z visoko izraženostjo teh 4 genov bolj občutljiv na imunoterapijo.

Raven izražanja štirih regulatorjev se je povečevala z naraščajočo stopnjo bolezni in patološko stopnjo in ni bilo pomembne razlike med izražanjem štirih regulatorjev in starostjo bolnika, kar je bilo skladno s slabšo prognozo grozda 2.

Glede na to, da je piroptoza močno vključena v različne biološke procese, smo raziskali, ali imajo ti štirje regulatorji piroptoze v skupini 2 tudi pomembno vlogo pri drugih vrstah raka. Nato je bila opravljena analiza pan-raka in rezultati so pokazali, da so ti štirje regulatorji piroptoze tesno povezani s stromalnim rezultatom, imunskim rezultatom in rezultatom ESTIMATE pri več vrstah raka. Ti rezultati so pokazali, da so ti štirje regulatorji piroptoze potencialne tarče za različne imunoterapije raka in niso omejeni na ccRCC.

V prihodnosti bo potrebna nadaljnja zanesljiva analiza preverjanja v večji kohorti. Poleg tega so potrebni dodatni poskusi in vitro in in vivo za razjasnitev regulativnega mehanizma med regulatorji piroptoze in tumorskim imunskim mikrookoljem.

Sklepi

Če povzamemo, je ta študija sistematično analizirala ekspresijski profil regulatorjev piroptoze v ccRCC in njegovo korelacijo z imunskimi kontrolnimi točkami ter vlogo v tumorskem imunskem mikrookolju. Izražanje regulatorjev piroptoze je pomembno povezano z imunskimi kontrolnimi točkami, kot sta PD-L1 in CTLA4. Z doslednim združevanjem regulatorjev piroptoze sta bila vzpostavljena tudi dva neodvisna podtipa. Med obema podtipoma so opazili heterogenost tumorja in razlike v izražanju imunske kontrolne točke in imunskem mikrookolju tumorja, kar bo pripomoglo k stratifikaciji tveganja in natančnemu zdravljenju bolnikov s ccRCC. Enostopenjska analiza pan-raka je pokazala, da so ti regulatorji piroptoze tesno povezani s stromalnim rezultatom, imunskim rezultatom in rezultatom ESTIMATE pri številnih vrstah raka. Pomembno je, da bodo prihodnja klinična preskušanja in osnovne raziskave pomagale določiti cilje za izboljšanje učinkovitosti imunoterapije raka.