Obsežno profiliranje sekretomskih formulacij iz fetalnih in perinatalnih izvornih celic amnijske tekočine

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Poleg tega je, kot je razvidno iz stolpičnih diagramov na slikah 5B in 6B, izrazita porazdelitev beljakovin glede na hipoksično predkondicioniranje izločajočih celic opazna. V tem primeru so za popolne informacije poročali tudi o beljakovinah, ki ne presegajo praga niza DAve in DCI. Rezultati sekretoma ploda so obogateni s 60 kDa proteinom toplotnega šoka (HSPD1, slika 5B, leva plošča) v njegovi hipoksični formulaciji, medtem ko perinatalni dvojnik močno izraža kontraktilni miozin gladkih mišičnih celic [52] svetlobni polipeptid 9 (MYL9, slika 5B, desna plošča). Zdi se, da je pomemben delež razlike med gestacijskimi fazami bolj odvisen od hipoksičnega predkondicioniranja pri hAFS. EV; f-have-EV, pridobljeni s pripravo hipoksičnih celic, so bili obogateni s faktorji, vključno s perlekanom (HSPG2), agrinom (AGRN), podenoto laminina -5 in -1(LAMA5 in LAMB1), trombospondinom{{17 }} (THBS1, slika 6B, leva plošča). Hipoksične p-hAFS-EV so vsebovale težko verigo feritina (FTH1), ogrodne beljakovine, kot so flotillin-1(FLOT1), fascin (FSCN1), aneksin A6 (ANXA6), zaviralec disociacije Rab GDP beta (GDI2), skupaj s Thy -1 membranski glikoprotein (THY1), nevropilin-1(NRP1) in matrični metaloprotein 14 (MMP14, slika 6B, desna plošča).

Za več informacij kliknite tukaj

Proteini so bili najdeni s frekvenco vsaj 2 v vsakem pregledanem stanju pri f-hAFS. EV in p-hAFS-EV so nadalje primerjali z zbirko podatkov Vesciclepedia [53]. Kot je bilo pričakovano, je bila večina identificiranih proteinov (96 odstotkov) predhodno opisanih v EV in eksosomih v referenčni bazi podatkov (slika S3A).koristi cistancheV zvezi s tem je bila analiza obogatitve genske ontologije (GO) izvedena s pomočjo FunRich [54]. Obilje izrazov GO v naboru podatkov je bilo primerjano z njihovo naravno količino v referenčni bazi podatkov, da bi našli statistično preveč zastopane skupine proteinov glede na njihovo vpletenost v biološke procese, molekularno funkcijo in celične komponente (za ta zadnji vidik podatki niso prikazano, vendar na voljo na zahtevo). Kar zadeva analizo molekularnih funkcij, povezanih z identificiranimi proteini, so frakcije hAFS-CM pokazale obogatitev v strukturni sestavini zunajceličnega matriksa in citoskeleta, vezavo na citoskeletne proteine ​​in aktivnost strukturne molekule (slika S2), medtem ko so bile hAFS-EV obogatene s strukturno sestavni del citoskeleta in ribosoma, vezava DNA in RNA ter vezavni faktorji GTPaze in šaperona (slika S3C).

Analiza obogatitve bioloških procesov za hAFS-CM in have-EV je pokazala, da večina proteinov, moduliranih v fetalnih in perinatalnih frakcijah sekretoma hAFS, pripada celični rasti/vzdrževanju in presnovi beljakovin (sliki 5C in 6C). Znotraj hAFS-EV smo opazili, da je bil izraz "strukturne sestavine zunajceličnega matriksa" povezan izključno s hipoksičnimi f-hAF-EV; izraza "vezava kalcijevih ionov" in "strukturna molekularna aktivnost" sta bila v glavnem obogatena v hipoksičnih vzorcih f-hAFS in p-hAFS (slika S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10,4I in DCI (zavest diferencialne ekspresije) Večja ali enaka I5I sta prestala filtre in veljala za diferencialno izraženo; glejte tabelo S3 za celoten seznam in podrobne parametre prijavljenih proteinov. (C) Analiza obogatitve bioloških procesov beljakovin, identificiranih s frekvenco vsaj 2 v f-hAFS-EV (leva plošča) in p-hAFS-EV (desna plošča) po hipoksičnem predkondicioniranju. Na podlagi orodja FunRich so pojmi genske ontologije prikazani v paličnih diagramih, ki poročajo o odstotku genov, obogatenih za vsako kategorijo (temno rumeni stolpci za f-hAFS-EVsnormo, rdeči stolpci za f-hAFS-EVShypo, svetlo zeleni stolpci za p-hAFS -EVsnormo in temno zelene črte za p-hAFS-EVShypo). Samo pojmi genske ontologije s popravkom Bonferroni*str<0.05 are="">

Cistanche lahko upočasni staranje

2.6 Profiliranje citokinov in kemokinov fetalnih proti perinatalnim has-CM in have-EV je razkrilo različne vzorce porazdelitve

Prej smo potrdili regenerativno sposobnost f-hAFS-CMhypo na poškodovanih srčno-žilnih celicah s parakrinimi učinki [34,35,49]. Tukaj smo primerjali vsebnost citokinov in kemokinov f-hAFS-CMHypo z ustreznim primerkom p-hAFS (slika 7A, slika S4A in tabela S4) in našli nekaj diskriminatornih dejavnikov.

ANGIOGENIN, induktor zunajcelične matrične metaloproteinaze (EMMPRIN), interlevkin 8 (IL-8) in monocitni kemoatraktivni protein-1 (MCP-1) so bili izključno obogateni z inf-hAFS-CMNypo in niso bili odkrit v p-hAFS-CMhypo. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2 (IGFBP2) in osteopontin (OPN) sta bila znatno povečana pri f-hAFS-CMhypo v primerjavi s p-hAFS-CMHypo za 3.5-in 3.8-krat (" str<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Medtem ko je fetalni v primerjavi s perinatalnim have-CM pokazal diferencialno izražanje v svojem profilu citokinov in kemokinov, so bili ustrezni fetalni in perinatalni primerki EV bolj homogeno porazdeljeni, čeprav z nižjimi profili izražanja (slika 7B, slika S4B in tabela S5). Kljub temu je bilo mogoče ceniti nekatere razlike: DiPeptidil-Peptidaza IV (DPPIV), Rastni/diferenciacijski faktor 15 (GDF-15) in IL-8 so bili izraženi samo s f-hAFS-EVSHypo, čeprav pri nizkih stopnje; ANGIOPOETIN2, CD40 LIGAND in protein, ki veže vitamin D (VDBP), so bili najdeni samo v p-hAFS-EVShypo, kljub temu, da so bili spet odkriti v majhnih količinah. Drugi citokini, kot so iz možganov nevrotrofični faktor (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, inzulinu podoben rastni faktor binding protein 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, stromalni faktor{ {23}} alfa (SDF-1a) so našli v obeh f-hAFS-EVShypo in p-hAFS-EVSHvpo, pri čemer sta bila PAI-1 in EMMPRIN bolj izražena (slika 7B)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 in SDF-lo so bili izključno obogateni v vseh hipoksičnih have-EV v primerjavi z ustreznim hAFS-CM, ne glede na gestacijsko stopnjo. Poleg tega, medtem ko EMMPRIN ni bil odkrit v p-hAFS-CMhypo, je bilo ugotovljeno, da je obogaten z ustrezno frakcijo EV; nasprotno pa je bil OPN večji pri f-have-CMhypo kot pri f-have-EVShypo, medtem ko je bil primerljiv med ustreznimi frakcijami sekretoma p-hAFS. FGF-19,MIF in PTX3 so bili podobno izraženi v fetalnem in perinatalnem has-CM ter v ustreznih hAFS-EV. PAI-1 je bil močno obogaten s frakcijami hipoksičnega sekretoma.

Slika 7. Profiliranje citokinov in kemokinov v formulacijah fetalnih in perinatalnih hAFS sekretomov. (A) Izražanje citokinov in kemokinov, odkritih v hipoksičnem fetalnem v primerjavi s perinatalnim have-CM (f-hAFS-CMHypo proti p-hAFS-CMHypo), je navedeno v gostoti slikovnih pik s poljubno enoto [AU]. Vrednosti so izražene kot povprečje ±sem neodvisnih poskusov in navedene v tabeli S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B) Vsebnost citokinov in kemokinov, zaznana v hipoksičnem plodu v primerjavi s perinatalnimi hAFS-EV (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) in izraženo z gostoto slikovnih pik v poljubnih enotah [AU].cistančni holesterolVrednosti so izražene kot povprečje ± sem n=3 neodvisnih poskusov in navedene v tabeli S5. CST3: Cistatin C; EMMPRIN: Induktor metaloproteinaze zunajceličnega matriksa; FCFF-19: Fibroblastni rastni faktor-19; IGFBP2: Inzulinu podoben rastni faktor (IGF) vezavni protein 2; IL-8: Interlevkin -8;IL-17a:Interlevkin-17a; MCP-1: monocitni kemoatraktivni protein-1;MIF:inhibitorni faktor migracije makrofagov; PTX3: pentraksin 3; PAI-1: zaviralec aktivatorja plazminogena-1; BDNF: možganski nevrotrofični faktor; DPPIV: dipeptidil peptidaza IV; GDF-15: Faktor diferenciacije rasti-15; IGFBP3: Inzulinu podoben rastni faktor (IGF) vezavni protein 3; SDF-1a: Faktor, pridobljen iz strome-1 alfa; VDBP: protein, ki veže vitamin D.

2.7. Fetalni in perinatalni imajo-EV so v svojem tovoru obogateni z informacijami o RNK

Ker so bile majhne nekodirajoče RNA obravnavane kot glavni regulatorji parakrinega vpliva EV na ciljne celice [4,55], smo analizo zaporedja RNA osredotočili predvsem na vsebnost mikroRNA (miRNA) v f-hAFS-EV in p-hAFS-EV. Profiliranje majhne RNA je pokazalo obogatitev miRNA v fetalnih in perinatalnih hAFS-EV (okoli 35-36 odstotkov) v primerjavi s skupno majhno količino RNA (slika 8A). Komponenta miRNA je bila res med dvema najbolj zastopanima vrstama RNA v obeh formulacijah EV, skupaj z rRNA(***p) p < 0.0001).="" naslednje="" mirna="" so="" bile="" najbolj="" obogatene="" v="" analiziranih="" vzorcih="" ev:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,naj-7a-5p,naj-7b-5p,naj-7f{="" {27}}p,naj-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" in="" mir-221-3p.="" opozoriti="" je="" treba,="" da="" so="" fetalne="" in="" perinatalne="" imajo-ev="" delile="" večino="" takih="" mirna="" (in="" sicer="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47="" }}f-5p,="" naj-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" in="" mir-221-3p,="" slika="" 7b).="" 15="" najbolj="" obogatenih="" vrst="" mirna="" je="" pokrivalo="" več="" kot="" 60="" odstotkov="" celotne="" vsebnosti="" mirna="" v="" vsakem="" vzorcu.="" po="" drugi="" strani="" pa="" je="" bilo="" v="" preostalih="" 30="" odstotkih="" vsebnosti="" vezikularne="" mirna="" najdenih="" približno="" 100="" mirna="" (slika="">

Za nadaljnjo karakterizacijo vsebnosti miRNA v hAFS-EV smo raziskali, ali lahko gestacijska stopnja hAFS ali predkondicioniranje hipoksičnih celic in vitro vpliva na obogatitev specifičnih miRNA. Najmočnejša modulacija je bila ugotovljena med gestacijskimi fazami, kjer so bile skoraj vse modulirane miRNA obogatene s f-hAFS-EV v primerjavi s perinatalnim dvojnikom (slika 9A in tabela 1). Hipoksično predkondicioniranje je imelo blažji učinek na tovor miRNA, medtem ko je bila v tej primerjavi modulacija v obe smeri, pri čemer je bilo nekaj miRNA obogatenih v hipoksičnih in drugih v normoksičnih kontrolnih pogojih (slika 9A).

Kot dopolnilno analizo smo se osredotočili na identifikacijo raziskanih miRNA z najmanjšo variabilnostjo med različnimi darovalci in predkondicioniranjem kulture za EV, ki izhajajo iz obeh raziskanih gestacijskih stopenj. miRNA, ki izhajajo iz te analize, so segale od visokih do nizkih ravni izražanja (slika 9B). Znotraj najstabilnejšega jedra miRNA tovora hAFS-EV je bilo identificiranih nekaj skupne miRNA med f-hAFS-EV in p-hAFS-EV (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p na visoki ravni; miR-221-3p,miR-221-5p in miR-22-3p na zatemnjeni ravni, tabela 2).

Slika 9. Analiza diferencialne obogatitve miRNA v fetalnih in perinatalnih hAFS-EV. (A) Vulkanske ploskve za diferencialno obogatitev tovora miRNA hAFS-EV glede na gestacijsko stopnjo (leva plošča) in in vitro hipoksično predkondicioniranje izločevalnih celic (desna plošča). Za podrobnosti miRNA glejte tabelo 1. (B) Raztreseni diagram korelacije med variabilnostjo (os X) in stopnjo obogatitve (os Y) stabilnih miRNA znotraj fetalnih hAFS-EV (leva plošča) in perinatalnih hAFS-EV (desna plošča) glede na visoko (rumene pike), zatemnjena (zelene pike) in nizka (temno vijolične pike) obogatitev. Za podrobnosti o miRNA glejte tabelo 2. RPM: branja na milijon.

3. Razprava

Ostanki zavrženih vzorcev človeške amnijske tekočine so bili opredeljeni kot dragocen vir stromalnih celic z obetavnim potencialom v regenerativni medicini in tkivnem inženirstvu. Etični pomisleki, povezani z njihovo izolacijo, so minimalni, saj jih je mogoče pridobiti bodisi iz ostankov vzorcev rutinske prenatalne presejalne amniocenteze v drugem trimesečju nosečnosti (fetalni hAFS) bodisi iz amnijske tekočine, ki je bila zavržena kot klinični odpadek v načrtovanem carskem rezu v tretjem trimesečju. postopki (perinatalni hAFS). V zadnjih letih so bili hAFS predlagani kot potencialni terapevtiki za popravilo in regeneracijo človeških tkiv glede na spodbudne dokaze, pridobljene iz eksperimentalnih modelov bolezni. Zanimivo je, da so bili predlagani tudi za in utero terapijo fetalno-neonatalnih nevroloških bolezni; Predklinične študije so dejansko pokazale, da je hAFS, ki je bil uporabljen prenatalno prek intraamnijske dostave, zaščitil hrbtenjačo med gestacijo prek parakrine aktivnosti pri podganjem modelu mielomeningokele [56-58] in zmanjšal poškodbe izpostavljenega črevesja pri eksperimentalni gastroshizi pri glodavcih[59]. ]. S translacijskega vidika bi lahko presaditev hAFS in utero nadomestili z dajanjem najprimernejšega pripravka njihovega sekretoma (hAFS-CM o hAFS-EVs).cistanche deserticola neželeni učinkiTa strategija bi omogočila hitro in pravočasno posredovanje med nosečnostjo s premagovanjem omejitev kanonične celične terapije (tj. dolgotrajne celične ekspanzije in vitro), hkrati pa bi zagotovila že pripravljene farmacevtske formulacije, pripravljene za uporabo.

Nedavni razvoj manj invazivnih prenatalnih diagnostičnih tehnik lahko povzroči zmanjšanje postopkov amniocenteze v bližnji prihodnosti, kar zagovarja perinatalno hAFS kot bolj dostopno možnost. Kljub temu, ker so plodovi hAFS bolj razvojno nezreli, imajo lahko učinkovitejši parakrini potencial. Znotraj tega scenarija smo tukaj primerjali fetalni in perinatalni c-KITt hAFS in se osredotočili na profiliranje njihovih frakcij sekretoma. Poudarili smo pomembne razlike, ki jih je treba upoštevati pri možnem kliničnem prevodu njihove parakrine zmogljivosti.

V skladu s prejšnjimi neodvisnimi študijami smo pokazali, da gestacijska faza ni vplivala na heterogeno morfologijo hAFS in njihov profil mezenhimskega antigena [25, 26]. Nato smo ocenili parametre, za katere je verjetneje, da bodo vplivali na celično sekretorno in parakrino aktivnost, ki presega kanonični stromalni imunofenotip. Nedavno se je pokazalo, da je prisotnost CD146-pozitivne subpopulacije z visoko vsebnostjo CD107a v mezenhimskih matičnih celicah kostnega mozga v korelaciji z izjemno modulacijsko in terapevtsko parakrino aktivnostjo [47]. Tu smo razkrili, da sta tako fetalni kot perinatalni hAFS močno značilen po tem molekularnem podpisu, ki podpira njihovo sekretorno moč z ustreznimi translacijskimi posledicami. Poleg tega je bil za fetalne hAFS značilen neučinkovit aerobni metabolizem, medtem ko so zrelejši perinatalni pokazali višjo stopnjo porabe kisika in sintezo ATP. To lahko kaže na bolj nezrel presnovni profil hAFS v drugem trimesečju, ki spominja na stromalne celice popkovine nedonošenčkov, ki so pokazale enak trend [60].

Da bi sprožili parakrini potencial, so bili hAFS izpostavljeni 24-urnemu hipoksičnemu pripravku brez seruma, strategiji, ki smo jo predhodno uspešno razvili [34,35,37] za fetalne celice in ki smo jo tukaj prvič raziskali na njihovi perinatalni dvojnici. Predkondicioniranje fetalnega in perinatalnega hAFS pod hipoksijo je povzročilo pozitiven trend povečanja njihove koncentracije sekretoma in količine sproščenih EV, medtem ko gestacijska faza ni vplivala na izkoristek celičnega sekretoma niti na morfologijo in porazdelitev velikosti EV.

Predvsem je karakterizacija parakrinega tovora hAFS razkrila nekatere posebne razlike glede na različne pogoje, ki smo jih ocenili. Proteomsko profiliranje fetalnega hAFS sekretoma je razkrilo opazne porazdelitve faktorjev, ki temeljijo na gestacijski stopnji in celičnem hipoksičnem predkondicioniranju. To kaže, da lahko parakrini potencial hAFS pridobi izrazito identiteto med zorenjem od Ⅱ do Ⅲ trimesečja nosečnosti, ki se nato lahko modulira s stimulacijo izločevalnih celic in vitro. Analiza obogatitve bioloških procesov hAFS-CM in hAFS-EV je pokazala, da lahko večina moduliranih proteinov sodeluje pri rasti/vzdrževanju celic in presnovi beljakovin, kar podpira celične koristne parakrine učinke, o katerih so poročali daleč. Zlasti je bilo ugotovljeno, da je skupni sekretom hipoksičnega fetalnega hAFS obogaten s proteinom toplotnega šoka HSPD1 (HSP60), za katerega je bilo dokazano, da podpira celjenje ran v modelu poškodbe kože diabetične miši in spodbuja makrofagno pro-razrešitev nagnjenosti v fenotip M2 [61] . Podobno so bili hipoksični fetalni hAFS-EV obogateni z dejavniki, ki spodbujajo nevrogenezo (HSPG2 [62], samoobnavljanje celic ter razvoj možganov in srca in ožilja (LAMA5 [63] in LAMB1 [64] ter migracija (THBS1 [2]). Proteoglikan AGRN so našli tudi v EV po hipoksičnem začetku fetalnega hAFS.cistanche odmerek redditNaše ugotovitve so v skladu s prejšnjimi dokazi, da se AGRN poveča v proteomu mezenhimskih stromalnih celic pod vnetnimi in hipoksičnimi poučnimi dražljaji [65]. Pokazalo se je tudi, da je AGRN vpleten v signalizacijo imunske sinapse [66] in da se ujema z regeneracijo srca pri novorojenčkih miši [67], s čimer podpira izrazito nagnjenost razvojno mladega fetalnega hAFS k regenerativnim parakrinim učinkom. Poleg tega je bilo potrjeno, da se fetalni hAFS bolj odziva na hipoksično predkondicioniranje, kar je razvidno iz obogatitve napovednikov vaskularne regenerativne učinkovitosti, kot so ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 in MCP-1 citokin [68], v njihov kondicionirani medij. To podpira predhodne dokaze o parakrini moči fetalnega hAFS-CM pri spodbujanju endogene neoarteriogeneze v predkliničnih modelih miokardnega infarkta, ishemije zadnjih udov in ishemične fasciokutane režnje na glodavcih [34,69-71]Poleg tega fetalni hAFS Ugotovljeno je bilo, da je skupni sekretom znatno bolj obogaten z IGFBP2 in OPN v primerjavi s perinatalnim, kar kaže na bolj izrazit modulatorni profil za razrešitev in preprečevanje staranja [72-75]. Perinatalni have-CM, čeprav je bil manj povečan v parakrinih dejavnikih, je bil podobno dopolnjen z nevrotrofičnimi in imunomodulatornimi dejavniki, kot sta CST3[76,77] in MIF[78].

V primerjavi s celotnim hAFS-CM so ustrezni hipoksični fetalni in perinatalni primerki EV pokazali manjšo ekspresijo citokinov in kemokinov, z izjemo mediatorja vaskularnega preoblikovanja EMMPRIN [79], ki je bil večinoma obogaten v predelu veziklov. Predhodno poročani kardioaktivni in pro-regenerativni profil fetalnih hAFS-EV[34,37] je bil tukaj potrjen z dokazom o njihovem ekskluzivnem izražanju kardioprotektivnih IL-8 [80] in GDF-15, ključni parakrini dejavnik, ki sproži endogeno nevrogenezo hipokampusa pri odraslih [81,82], kot tudi preprečevanje kardiotoksičnosti, ki jo povzročajo antraciklini [78]. Tako fetalni kot perinatalni hAFS-EV so pokazali podoben izraz za regulator trgovine s matičnimi celicami SDF-1 [83-85]. Proteomska analiza je poročala o povečanem izražanju proteinov, povezanih z angiogenezo, kot sta NRP1 [86] in MP14[87] v hipoksičnih perinatalnih hAFS-EV; takšen stimulacijski profil lahko pojasni prejšnje rezultate o endotelnih regenerativnih lastnostih hAFS v 3-em trimesečju v predkliničnem mišjem modelu ishemične poškodbe skeletnih mišic [25], kljub dokazom, da je njihov hAFS-CM manj proangiogen kot ustrezni plodov. Nevralni rastni faktor BDNF je bil najden tako v fetalnem kot v perinatalnem EV tovoru, čeprav v majhnih količinah, kar kaže na domnevno nevrotrofično aktivnost za hAFS-EV pri preživetju nevronov in nevrorazvojnih procesih, kot so opazili tudi pri zunajceličnih veziklih, ki jih izločajo človeške kosti. kostnega mozga in popkovnične krvi-MSC[8889]. Izkazalo se je, da sta obe sekretomski formulaciji iz fetalnega in perinatalnega hAFS, podvrženega hipoksični stimulaciji, obogateni s PAI-1, spodbujevalcem endotelijske aktivacije [90], ki je bil prav tako vključen v polarizacijo makrofagov M2 v srcu in je obdarjen s kardioprotektivnim delovanjem. in antifibrotični potencial [91].

MikroRNA (miRNA) so bile na splošno obravnavane kot ključni regulatorji parakrine aktivnosti matičnih celic in mezenhimskih stromalnih celic EV [92,93]. Tu smo ugotovili, da 15 najbolj obogatenih vrst miRNA znotraj hAFS-EV pokriva več kot 60 odstotkov celotne vsebnosti miRNA v vsakem vzorcu. Poročali so, da te miRNA označujejo molekularni tovor mezenhimskih stromalnih celic-EV (naj-7a-5p [4,95]), ščitijo pred ishemijo miokarda z vplivanjem na vaskularno regeneracijo in zaviranjem fibroze (naj -7b-5p, naj-7f-5p, miR-21-5p in miR-155-5p [96,97]), promoviraj celjenje ran z uravnavanjem delovanja keratinocitov (miR-16-5p [98]) in preprečevanje smrti nevronov po ishemiji prednjih možganov (miR-29a-3p [99,100]). Po drugi strani pa je bilo v preostalih 30 odstotkih vsebnosti vezikularne miRNA najdenih približno 1000 miRNA. Takšna neuravnotežena porazdelitev je skladna s prejšnjimi študijami [4] in poudarja večinoma obogatene miRNA kot domnevno odgovorne za glavno biološko aktivnost hAFS-EV. Zanimivo je, da so fetalni in perinatalni hAFS-EV delili večino od 15 miRNA. Omeniti velja, da smo opazili tudi, da tako fetalni hAFS-EV kot perinatalni vsebujejo nabor zelo stabilnih miRNA na različnih stopnjah obogatitve. Takšni dokazi lahko kažejo na široko paleto kandidatov za "gospodinjstvo", ki se uporabljajo kot notranja referenčna kontrola v poskusih qPCR na hAFS-EV. Poleg tega dosledna podskupina takih stabilnih miRNA (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) se deli med dvema gestacijskima fazama in se prekriva s 15 večinoma obogatenimi, kar kaže na še bolj konstantno vedenje in zanesljiv molekularni podpis pred razrešitvijo ([96,{{45 }}]). Opozoriti je treba, da so nedavno poročali o nekaj kandidatih znotraj takega značilnega jedra kot referenčnih miRNA v nevroprotektivnih EV, pridobljenih iz mezenhimskih stromalnih celic, pridobljenih iz amnijske tekočine v drugem trimesečju (miR-29a-3p in miR{{ 49}}str [95]). Kljub temu smo tudi opazili, da lahko gestacijska starost modulira tovor miRNA bolj kot hipoksično predkondicioniranje. Razvojno bolj juvenilni EV, pridobljeni iz fetalnih hAFS v tretjem trimesečju, so bili obogateni z miRNA, za katere je bilo prej dokazano, da podpirajo sposobnost preživetja embrionalnih matičnih celic (miR-302-3p [101]), celično proliferacijo in osteogeno diferenciacijo stromalnih celic kostnega mozga (miR -217 [102]), hkrati pa skriva tudi tumor supresorski potencial (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).

Na podlagi naših rezultatov tukaj potrjujemo, da lahko fetalni in perinatalni hAFS predstavljata privlačne parakrine vire, ki jih je treba izkoristiti za regenerativno medicino. Medtem ko sta bila njihov fenotip in sekretorna aktivnost podobna, smo izpostavili nekatere posebne vidike v njihovih formulacijah sekretoma kot uporabne vpoglede za njihov prihodnji terapevtski prevod.

4. Materiali in metode

4.1. Izolacija izvornih celic človeške amnijske tekočine in kultura in vitro

Matične celice človeške amnijske tekočine (hAFS) so bile izolirane iz ostankov vzorcev amnijske tekočine (AF), zbranih z rutinskim prenatalnim presejanjem z amniocentezo v 3 trimesečju (fetalna hAFS, f-hAFS) ali kot klinični odpadki med načrtovanim porodom s carskim rezom v 3 trimesečju (perinatalni hAFS,p-hAFS) v enoti za prenatalno diagnostiko in perinatalno medicino v bolnišnici IRCCS San Martino, v enoti za fetalno in perinatalno medicinsko in kirurško enoto ter laboratoriju za humano genetiko v bolnišnici IRCCS Istituto Gaslini (Genova, Italija). Informirano pisno soglasje je bilo pridobljeno od vseh darovalcev v skladu z dovoljenjem lokalnega etičnega odbora (protokol PR428REG2015) in v skladu s smernicami Helsinške deklaracije. Vzorci fetalnega AF v drugem trimesečju so bili pridobljeni od darovalk s povprečno starostjo približno 37,42±0,32 let (n=15 v razponu od 36- do 41 let); vzorci perinatalnih AF v 3 trimesečju so bili pridobljeni iz darovalk s povprečno starostjo 34,25±1,31 let (n=10 v razponu od 26- do 42 let). Fetalni in perinatalni hAFS so bili pridobljeni iz vzorcev, validiranih za normalni kariotip in izoliranih z imunomagnetnim razvrščanjem za ekspresijo c-KIT (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Italija) iz adherentnih mezenhimskih stromalnih celic AF[16].koristi izvlečka cistanchec-KIT* hAFS so gojili v minimalnem esencialnem mediju (MEM)-alfa s 15 odstotki FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), 18 odstotki Chang B in 2 odstotki Chang C medija (Irvine Scientific , Santa Ana, CA, ZDA) z 1 odstotkom L-glutamina in 1 odstotkom penicilina/streptomicina (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), v inkubatorju pri 37 stopinjah s 5 odstotki CO2 in 20 odstotki Oz atmosfere ter kultivirani do 5 prehodov in vitro, preden se uporabijo za izolacijo njihovega sekretoma.

4.2.Biokemijska ocena metabolizma hAFS

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) celice so bile uporabljene za vsak poskus. Za ovrednotenje bazalnega dihanja smo hAFS permeabilizirali z 0.03 mg/mL digitonina za 10 minut in suspendirali v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS). Za stimulacijo poti smo dodali 10 mM piruvata in 5 mM malata ali 20 mM sukcinata - poti, ki jih sestavljajo kompleksi I, II in IV oziroma kompleksi Ⅱ oziroma IV [60].

Za ovrednotenje relativnih prispevkov k dihanju glutamina, dolgoverižne oksidacije maščobnih kislin in glukoze smo po permeabilizaciji digitonina celice suspendirali v rastnem mediju in 4 uM BPTES, 4 uM Etomoksirja in 4 uM UK5{{22} }99 smo dodali za zaviranje glutaminaze, karnitin palmitoil-transferaze 1A (CPT1A) ali mitohondrijskega piruvatnega nosilca (MPC). Aktivnost Fi-F.ATP sintaze (ATP sintaze) je bila odkrita z merjenjem proizvodnje ATP z visoko občutljivo metodo luciferin/luciferaza. Testi so bili izvedeni pri 37 stopinjah 2 minuti, podatki pa so bili zbrani vsake 30 s. V prvem nizu poskusov so bile celice 10 stopinj inkubirane 10 min v mediju, ki je vseboval 50 mM KCl, 1mMEGTA, 2mMEDTA, 5mMKH2PO4, 2mMMgC12, 0,6 mMouabain, 1 mM P1P5-Di (adenozin-5')penta-fosfat, 0,040 mg/ml ampicilina in 10 mM Tris-HCl pH7,4. Nato je bila sinteza ATP inducirana z dodatkom dihalnih substratov (10 mM piruvata plus 5 mM malata ali 20 mM sukcinata) in 0,1 mM ADP. Reakcija je bila izmerjena s kompletom za bioluminiscenčni test luciferin/luciferaza ATP CLSII (Roche, Basel, Švica) v Luminometru (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milano, Italija) standardnih raztopinah ATP (Roche, Basel, Švica) v razponu {{ 42}}/M so bili uporabljeni za kalibracijo. V drugem nizu poskusov je bila sinteza ATP ovrednotena v prisotnosti 4 uM BPTES, 4 uM etomoksirja ali 4 uM UK5099. V tem primeru je bilo 10 celic inkubiranih 10 minut v rastnem mediju v odsotnosti ali prisotnosti zaviralec metabolizma, sintezo ATP pa smo inducirali z 0,1 mM ADP. Učinkovitost OxPhos (oksidativne fosforilacije) (razmerje P/O) smo izračunali kot razmerje med koncentracijo proizvedenega ATP in količino porabljenega kisika v prisotnosti dihalnega substrata in ADP. Ko je poraba kisika v celoti namenjena proizvodnji energije, mora biti razmerje P/O približno 2,5 oziroma 1,5 po dodatku piruvata in malata oziroma sukcinata. [48] Za ovrednotenje prispevka anaerobne glikolize k presnovi hAFS so bile ocenjene koncentracije glukoze in laktata. v rastnem mediju. Poraba glukoze je bila ocenjena s sklopitvenim sistemom heksokinaze (HK) in glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (G6PD) po redukciji NADP pri 340 nm. Testni medij je vseboval 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12, 2 IU heksokinaze in 2 IU glukoza-6-fosfat dehidrogenaze. Sproščanje laktata je bilo testirano po zmanjšanju NAD plus pri 340 nm. Testni medij je vseboval 100 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM NAD plus in 1 IU/mL laktat dehidrogenaze. Vzorci so bili analizirani pred in po dodatku 4 ug prečiščene laktat dehidrogenaze. V obeh primerih so bili podatki normalizirani na število celic in izraženi kot mM glukoze/10 stopinjskih celic oziroma mM sproščenega laktata/10 stopinjskih celic [107].

4.3. Karakterizacija hAFS s pretočno citometrijo

Sto tisoč (105) fetalnih in p-hAFS celic je bilo ločenih in inkubiranih z mišjim anti-človeškim CD107a-Alexa Fluor 647-in anti-človeškim CD146-FITC- konjugirana protitelesa (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija). Apoptozo celic so ocenili s kompletom za odkrivanje apoptoze FITC Annexin V (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Italija) po navodilih proizvajalca. Dogodki so bili pridobljeni na sortirniku in analizatorju BD Bioscience FACS Aria II, opremljenem s programsko opremo FACS Diva (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milano, Italija). Podatki so bili analizirani s programsko opremo FlowJo V9.0 (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milano). , Italija). 4.4.Obarvanje zaradi staranja

Fenotip staranja hAFS, gojenih do pasaže 5 v standardnih pogojih in vitro, je bil ovrednoten s kompletom za barvanje z galaktozidazo Senescence (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ZDA): f-hand p-hAFS so bili fiksirani z 1x raztopino fiksativa pri 70 odstotkih konfluenco in obarvan na SA- -gal pri 37 stopinjah čez noč, v skladu z navodili proizvajalca. Dogodki staranja so bili pridobljeni na mikroskopu Leica DMil (opremljenem s programsko opremo Leica Acquire V3.4.4, Leica Microsystems, Milano, Italija) in ovrednoteni kot odstotek SA- -gal-pozitivnih celic glede na celotno število celic na polje.

4.5. Ločevanje in koncentracija frakcij sekretoma hAFS

f-hAFS in p-hAFS smo gojili 24 ur v mediju brez seruma (SF) pri 1-odstotni O2 hipoksiji v primerjavi z 20-odstotno O2 normoksijo (kontrola), pri čemer je bila slednja uporabljena kot izhodiščna referenca. Ta strategija predkondicioniranja je bila uporabljena za povečanje sproščanja bioaktivnih parakrinih faktorjev, kot smo že poročali [34,35,37,49]. hAFS smo gojili 24 ur v mediju brez seruma (SF) (Dulbeccojev modificirani Eagleov medij z visoko vsebnostjo glukoze, DMEM, z 1 odstotkom L-glutamina in 1 odstotkom penicilina/streptomicina, vse od Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), pod normoksičnim (20 odstotkov O2 in 5 odstotkov CO2 pri 37 stopinjah) ali hipoksičnih (1 odstotek O2 in 5 odstotkov CO2 pri 37 stopinjah v CO2 inkubatorjih CellXpert C170i in Galaxy 48R iz Eppendorfa, Milano, Italija).

f-hAFS-CM in p-hAFS-CM smo zbrali in centrifugirali pri 4 stopinjah pri 300x g 10 minut in 2000× g 20 minut, da smo odstranili celične ostanke; hAFS-CM smo koncentrirali z uporabo ultrafiltracijskih membran s 3kDa selektivnim presekom (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Nemčija) pri 4 stopinjah pri 3000× g 90 minut in nato nadalje koncentrirali pri 4°C. stopinje pri 3000× g 30 min. hAFS-EV smo ločili in koncentrirali s serijskim ultracentrifugiranjem iz hAFS-CM. Na kratko, hAFS-CM smo zbrali in centrifugirali pri 4 stopinjah pri 300 × g 10 minut in 2000 × g 20 minut, da smo odstranili celične ostanke. Supernatant smo nato obdelali pri 10.000 × g 40 minut. Pelet smo zavrgli, supernatant pa nadalje obdelali z ultracentrifugiranjem v Optima L-90K (Beckmann Coulter, Milano, Italija) pri 10.000 × g 120 minut z uporabo Beckman Coulterjevih centrifugalnih rotorjev SW55Ti z vrtljivo vedro. Peleto, ki je vsebovala heterogene hAFS-EV, smo sprali v PBS s končnim centrifugiranjem pri 100.000 × g 120 minut in nato resuspendirali v PBS, filtriranem s filtrirno membrano z porami 0,22 um. Koncentracije beljakovin v hAFS-CM in na površini hAFS-EV so bile izmerjene s testom BiCinchoninic Acid (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija). Vzorci so bili pridobljeni na bralniku mikroplošč Gen5 pri 570 nm, da se oceni izkoristek hAFS-CM in hAFS-EV glede na ug raztopine/10 stopinj, ki proizvajajo celice.

4.6. Karakterizacija hAFS-EV s transmisijsko elektronsko mikroskopijo in analizo sledenja nanodelcev

Analiza transmisijske elektronske mikroskopije (TEM) je bila izvedena na mikroskopu Hitachi TEM (serija HT7800, Hitachi High Technologies, Monza, Italija). Digitalne slike so bile posnete s kamero Mega view 3 in programsko opremo Radius (EMSIS, Muenster, Nemčija). f-hAFS in p-hAFS smo fiksirali v 3,7-odstotni raztopini paraformaldehida (PA), razredčeni 1:1 s popolnim medijem hAFS, sprali v 0.1 M pufru za kakodilat in nato takoj inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi v 0,1 M kakodilatni pufer, ki vsebuje 2,5 odstotka glutaraldehida (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, ZDA). Celične pelete smo naknadno fiksirali v osmijevem tetroksidu za 1 uro in v 1-odstotni raztopini uranil acetata za 1 uro. Vzorci so bili dehidrirani 24 ur pri 42 stopinjah in 48 ur pri 60 stopinjah skozi serijo razvrščenega etanola in vdelani v epoksi smolo (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Nemčija). Ultratanke rezine (50 nm) so izrezali z mikrotomom Leica Ultracut (Leica Microsystems, Milano, Italija) in jih obarvali s 5-odstotnim uranil acetatom v 50-odstotni raztopini etanola. f-hAFS-EV in p-hAFS-EV smo resuspendirali v 20 uL raztopine PBS in fiksirali z dodajanjem enakega volumna 2-odstotnega paraformaldehida v 0,1 M raztopini fosfatnega pufra (pH 7,4). EV so nato 10 minut adsorbirali na bakrene mreže, prevlečene s formvar-ogljikom, tako da so mreže lebdele na 5 μL kapljicah na parafilmu. Nato so bile mreže z oprijetimi EV izprane v PBS in negativno obarvane z 2-odstotno raztopino uranil acetata 5 minut pri sobni temperaturi. Obarvane mreže so bile vdelane v 2,5-odstotno metilcelulozo za boljše ohranjanje in pred preiskavo posušene na zraku. Morfometrična analiza hAFS-EV je bila izmerjena na 10 naključno posnetih mikrofotografijah pri povečavi 40.000× g. Velikost je bila izračunana s funkcijo poljubne črte, vdelano v pogovorno okno meritev programske opreme Radius (EMSIS, Muenster Nemčija). Za vizualizacijo porazdelitve velikosti hAFS-EV so bili rezultati narisani kot diagram razpršenih pik in kot frekvenčna porazdelitev, v kateri je vsaka velikost predstavljena kot točka skupaj s črtami za srednjo vrednost in razpon.

f-hAFS-EV in p-hAFS-EV so analizirali tudi z analizo sledenja nanodelcev (NTA), da bi ocenili delce, ki jih sprostijo celice 10 stopinj. hAFS-EV so bili razredčeni 1:100 v raztopini PBS in pridobljeni na NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, Združeno kraljestvo), ki je posnel vsaj 3 različne okvirje po 60 s. Tri različne pridobitve vsakega vzorca so bile analizirane z uporabo možnosti Batch Process v programski opremi. 4.7. LC-MS/MS analiza hAFS-CM in hAFS-EV 4.7.1. Prebava v raztopini

Proteomska analiza je bila izvedena na 3 bioloških ponovitvah hAFS-CM in hAFS. EV iz f-hAFS in p-hAFS po normoksičnem ali hipoksičnem predkondicioniranju (n=24 različnih pogojev). Vzorce hAFS-CM in hAFS-EVs smo suspendirali v 0.1M NHCO3 pH 7,9 in obdelali z RapigestIM SF reagent (Waters Co, Milford, MA, ZDA) pri končni koncentraciji 0.25 odstotkov (w/v). Nastale suspenzije smo med mešanjem inkubirali pri 100 stopinji 2{{40}} min. Razgradnjo smo izvedli na vsakem vzorcu z dodajanjem modificiranega tripsina stopnje zaporedja (Promega Inc, Madison, WI, ZDA) pri razmerju encim/substrat 1:50 (m/m) čez noč pri 37 stopinjah v 0,1 M NH4HCO3 pH 7,9 pufra z 10 odstotki CHSCN. Zjutraj smo dodali dodatni alikvot tripsina (1:100 m/m) in razgradnjo nadaljevali 4 ure. Poleg tega je dodatek 0,5-odstotne trifluoroocetne kisline (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, ZDA) ustavil encimsko reakcijo in kasnejša inkubacija pri 37 stopinjah 45 minut je zaključila kislinsko hidrolizo RapiGest [108]. Razgradne produkte, ki se ne mešajo z vodo, smo odstranili s centrifugiranjem pri 13.000 rpm 10 minut. Nazadnje so bile triptične prebavljene mešanice razsoljene z vrtilnimi kolonami PierceTM C-18 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija) v skladu s protokolom proizvajalca in ponovno suspendirane v 0,1-odstotni mravljični kislini (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, ZDA) v vodi (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, ZDA) v koncentraciji 0,1 ug/μL.

4.7.2.Tekočinska kromatografija

Mešanice, prebavljene s tripsinom, so bile analizirane s pomočjo platforme, sestavljene iz nano-tekočinskega kromatografskega sistema, Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D System (Eksigent, del AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, ZDA), konfiguriranega v načinu trap-elue, skupaj z masnim spektrometrom visoke ločljivosti. Na kratko, vzorci (0.8 ug vbrizganih) so bili najprej naloženi na peptidno past (200 um × 500 um ChromXP C18- CL, 3 um, 120 A) in sprano s črpalko za polnjenje, ki deluje v izokratskem načinu, z 0,1-odstotno mravljinčno kislino v vodi 10 minut pri pretoku 3 μL/min. Samodejni preklop ventila z desetimi vrati je nato eluiral ujeto zmes na koloni z nano reverzno fazo (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL, 3 um, 120 A) skozi 150-minutni gradient eluenta B (eluent A, 0,1 % mravljinčna kislina v vodi; eluent B, 0,1 % mravljinčna kislina v acetonitrilu) pri pretoku 300 nL/min. V globino je bil gradient: od 5-10 odstotkov bina 3 minute, 10-40 odstotkov bina 130 minut, 40-95 odstotkov bina 10 minut in držanja pri 95 odstotkih B 7 minut. 4.7.3. Masna spektrometrija

Analize MS/MS so bile izvedene na masnem spektrometru LTQ-OrbitrapXL (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), opremljenem z virom ionov v nanospreju. Razpršilna kapilarna napetost je bila nastavljena na 1,7 kV in kapilarna temperatura za prenos ionov je bila vzdrževana pri 22 0 stopinj. Celotni spektri MS so bili posneti v razponu 400-1600 m/z v načinu pozitivnih ionov z ločljivostjo 60000 (polna širina na polovici maksimuma) in hitrostjo skeniranja 2 spektra/s. Temu koraku je sledilo pet dogodkov MS/MS z nizko ločljivostjo, ki so bili zaporedno ustvarjeni na način, odvisen od podatkov, na prvih petih ionih, izbranih iz celotnega spektra MS (pri 35-odstotni energiji trka), z uporabo dinamične izključitve 0,5 minute za MS/MS analiza. Funkcije skeniranja masnega spektrometra in gradiente topil tekočinske kromatografije visoke ločljivosti so nadzorovali podatkovni sistem Xcalibur različice 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija).

4.7.4. Proteomska obdelava podatkov in podatkovno rudarjenje

Vse ustvarjene podatke smo iskali z iskalnikom Sequest HT, ki ga vsebuje programska oprema Thermo Scientific Proteome Discoverer, različica 2.1. Eksperimentalni spektri MS/MS so bili povezani s sekvencami triptičnih peptidov v primerjavi s teoretičnimi masnimi spektri, pridobljenimi z razgradnjo in silico baze podatkov o proteomih Uniprot Homo Sapiens (74600 vnosov), prenesenih 2. januarja 020 (www.uniprot.org, dostopno 10 2. marca021). Za identifikacijo peptidnih zaporedij in sorodnih proteinov so bili uporabljeni naslednji kriteriji: tripsin kot encim, tri zgrešene cepitve na peptid, masna toleranca ±50 ppm za prekurzorske ione in ±0,8 Da za ione fragmentov. Perkolatorsko vozlišče je bilo uporabljeno s strategijo tarče-vabe, da se zagotovi končna stopnja lažnega odkritja (FDR) na ravni ujemanja peptidnega spektra (PSM) 0,01 (strogo) na podlagi q-vrednosti, ob upoštevanju največjega deltaCN 0,05 [109]. Upoštevani so bili le peptidi z najmanjšo dolžino peptida šestih aminokislin in rangom 1. Uporabljena so bila načela razvrščanja beljakovin v skupine in stroge varčnosti. Podatki MS so bili deponirani v konzorcij ProteomeXchange prek PRIDE [10]partnerskega repozitorija (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, dostopan 10. marca 2021). 48 proteinov, pridobljenih z algoritmom SEQUEST, je bilo poravnanih, normaliziranih , in v primerjavi brez etiket. Za ta namen je bil uporabljen interni algoritem, in sicer večdimenzionalni algoritemski proteinski zemljevid (MAProMa), ki uporablja povprečna ujemanja spektra peptidov (aPSM) [111,112], ki ustrezajo povprečju vseh spektrov, identificiranih za protein in posledično , na njegovo relativno številčnost, v vsakem analiziranem stanju. Poglobljeno, da bi izbrali različno izražene proteine, smo podskupine (za fetalne proti perinatalnim hAFS-CM in hAFS-EV, ob upoštevanju tudi stimulacije predkondicioniranja hipoksičnih celic) primerjali po parih z uporabo praga 0,4 in 5 na dveh MAProMa indeksa DAve (Differential Average) oziroma DCI (Differential Confidence Index). DAve, ki ocenjuje spremembe v izražanju beljakovin, je bil definiran kot (XY)/(X＋Y)/0,5, medtem ko je bil DCI, ki ocenjuje zaupanje diferencialne ekspresije, definiran kot (X plus Y)×(XY)/2. X in Y izrazi predstavljajo PSM danega proteina v dveh primerjanih vzorcih. Poleg tega so bili povprečni seznami beljakovin, pridobljeni iz vsakega pregledanega stanja, izpostavljeni linearni diskriminantni analizi (LDA) in proteini z največjim razmerjem F (večji ali enaki 4,5) in najmanjšo p-vrednostjo (manjši ali enaki 0,001) so bili ohranjeni in obdelani s hierarhičnim združevanjem v skupine z uporabo Wardove metode in metrike evklidske razdalje z uporabo programske opreme JMP 15.2. Natančneje, razmerje F je predstavljalo povprečni kvadrat modela, deljen s povprečnim kvadratom napake, medtem ko je p-vrednost nakazovala verjetnost pridobitve vrednosti F, ki je višja od izračunane, če v resnici ni razlike med povprečji populacijske skupine. 4.8. Citokinsko in kemokinsko profiliranje hAFS-CM in have-EV

Citokinsko in kemokinsko profiliranje hAFS-CM in have-EV, pridobljeno s f-hAFS in p-hAFS po hipoksičnem predkondicioniranju, je bilo ocenjeno s kompletom Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array (R&D System, Minneapolis, MN, ZDA) v skladu z navodila proizvajalca. Uporabljenih je bilo 20 ug vzorcev hAFS-CM in hAFS-EVs. Slike membran so bile pridobljene s Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, Združeno kraljestvo). Specifična vsebnost citokinov/kemokinov je bila ovrednotena s kvantifikacijo pozitivne intenzitete slikovnih pik (s poljubno enoto) za vsak zaznaven citokin z uporabo programske opreme ImageJ (na voljo na https: //imagej.nih.gov/ij/, dostopno 10. marca 2021 [13]). 4.9. Ekstrakcija RNA iz hAFS-EVs in Next

Zaporedje generacij

RNA je bila izolirana iz f-hAFS-EV in p-have-EV z miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Milano, Italija) v skladu z navodili proizvajalca. Celovitost RNA in porazdelitev velikosti sta bili ovrednoteni z uporabo Agilent Small RNA Kit z majhnim nekodirajočim RNA čipom, da bi ocenili vsebnost majhnih RNA v razponu od 6 do 150 nukleotidov (nt). Komplet Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija) je bil uporabljen za kvantificiranje vsebnosti mikroRNA (miRNA) po navodilih proizvajalca. Knjižnice za sekvenciranje miRNA so bile pripravljene in pomnožene z uporabo kompleta QIAseq miRNA Library (Qiagen, Milano, Italija) z uporabo 18,5 ng izoliranih miRNA kot vnosa in po navodilih proizvajalca. Knjižnice so bile združene po preverjanju kakovosti in kvantificiranju s TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, CA, ZDA) z uporabo Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Združene knjižnice so bile ocenjene za kontrolo kakovosti s qPCR v realnem času v skladu z vodnikom "Sequencing Library qPCR Quantification" (Illumina Inc, San Diego, CA, ZDA) in sekvencirane s platformo Illumina NextSeq z uporabo High Output Hit v2.5 (75 ciklov) ( Illumina Inc, San Diego, CA, ZDA). Osnovno klicanje je bilo izvedeno s privzetim potekom dela Illumina NextSeq500.

4.10.Bioinformatska analiza podatkov o sekvenciranju miRNA

Datoteke Fastq so bile najprej obdelane z odrezovanjem 3' adapterja in nizkokakovostnih podstavkov s Cutadapt [114]. Po obrezovanju so bile identificirane vstavljene sekvence in sekvence UMI. Branja brez zaporedja adapterja, branja z manj kot 16 bp vstavljenimi sekvencami in branja z manj kot 10 bp UMI sekvencami so bila zavržena. Za označevanje vstavljenih sekvenc so bili odčitki poravnani s sestavom človeškega genoma GRCh38 z uporabo Bowtie [15] Za vsak vzorec so bili prešteti vsi odčitki, dodeljeni določeni miRNA, in povezani UMI-ji so bili združeni za štetje edinstvenih molekul. Sekundarna analiza je bila izvedena s skripti R po meri, ki so na voljo na razumno zahtevo. Analiza diferencialne obogatitve je bila izvedena z uporabo paketov Limma [116] in EdgeR Bioconductor [117].

4.11. Statistične analize

Rezultati so predstavljeni kot povprečje ±sem vsaj treh (n{{0}}) neodvisnih poskusov. Primerjave so bile narejene z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil posthoc Tukeyjev test večkratnih primerjav ali Studentov t-test. Analize so bile izvedene z uporabo Graph-Pad Prism različice 8.0.2 (programska oprema GraphPad, https://www.graphpad.com, dostopno 10. marca 2021) s statistično značilnostjo, nastavljeno na* p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

Za zaključek je bilo ugotovljeno, da sta fetalna in perinatalna hAFS fenotipsko enakovredna s primerljivo sekretorno močjo in obogatitvijo EV v velikosti in porazdelitvi; vendar bi bilo mogoče ceniti nekatere razlike v njihovem profilu sekretoma. Natančneje, razvojno nezrel profil fetalnega hAFS je mogoče povzeti z njihovimi formulacijami sekretoma, obdarjenimi z izrazitejšim pro-vaskulogenim, pro-regenerativnim in pomlajevalnim sekretomom. Vendar perinatalni hAFS še vedno ohranja pomemben parakrini profil prek izražanja dejavnikov, povezanih z migracijo endotelijskih celic, imunomodulatornim, protivnetnim in nevrotrofičnim potencialom, podobnim fetalnemu hAFS. Te ugotovitve lahko zagotovijo uporabne vpoglede v podporo prihodnji parakrini terapiji bolezni, povezanih s poškodbami in vnetnimi/ishemičnimi boleznimi. Zato je treba izbiro fetalnega ali perinatalnega hAFS kot najbolj idealnega vira celic oceniti ob upoštevanju specifičnega kliničnega scenarija.

Ta članek je izvleček iz Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms