Absorpcija citokinov med perfuzijo človeških ledvic zmanjša vnetni genski podpis, povezan z zapoznelim delovanjem presadka

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

John R. Ferdinand1,2|Sarah A. Hosgood2,3|Tom Moore2,3|Ashley Ferro1|Christopher J. Ward1|Tomas Castro-Dopico1|Michael L. Nicholson2,3|Menna R. Clatworthy1,2

1 Enota za molekularno imunost, Medicinski oddelek Univerze v Cambridgeu, Laboratorij za molekularno biologijo, Cambridge, Združeno kraljestvo

2 Nacionalni inštitut za zdravstvene raziskave Enota za raziskave krvi in ​​transplantacije pri darovanju organov, Cambridge, Združeno kraljestvo

3 Oddelek za kirurgijo Univerze v Cambridgeu, Cambridge, Združeno kraljestvo

Presaditev je optimalno zdravljenje za večino bolnikov s končnim stadijemledvicabolezenvendar je pomanjkanje organov velik izziv. Normotermična strojna perfuzija (NMP) je bila uporabljena za obnovo obrobnih organov; vendar mehanizmi, s katerimi lahko NMP koristi organom, niso dobro razumljeni. Z uporabo parov človeških ledvic, pridobljenih od istega darovalca, smo primerjali učinek NMP z učinkom hladilnice na globalnoledvicatranskriptom. Ugotovili smo, da je hlajenje privedlo do globalnega zmanjšanja izražanja genov, vključno z geni vnetne poti in tistimi, ki so potrebni za procese pridobivanja energije, kot je oksidativna fosforilacija (OXPHOS). Nasprotno pa je med NMP prišlo do izrazite regulacije genov OXPHOS, pa tudi številnih genov imunske in vnetne poti. Z uporabo biopsij iz ledvic, ki so bile podvržene NMP in so bile naknadno presajene, smo ugotovili, da se je v organih s podaljšano zapoznelo funkcijo presadka (DGF) pojavila višja ekspresija vnetnih genov. Zato smo za odstranitev protivnetnih citokinov uporabili hem-adsorber (HA). Ta oslabljena ekspresija vnetnega gena je povečala gene poti OXPHOS in imela potencialno klinično pomembne učinke pri zmanjšanju ekspresije genskega podpisa, povezanega z DGF. Naši podatki skupaj kažejo, da adsorpcija vnetnih mediatorjev iz perfuzata predstavlja potencialno intervencijo, ki lahko izboljša sposobnost preživetja organov.

KLJUČNE BESEDE:klinične raziskave/praksa, zapoznela funkcija presadka (DGF), darovalci in darovanje: umrli,ledvica(alografska) funkcija/disfunkcija,ledvicabolezen: imunski/vnetni, ledvice

Cistanche zelišče za izboljšanje delovanja ledvic

1. UVOD

Ledvicapresaditev predstavlja optimalno zdravljenje za večino bolnikov zkončna fazaledvicabolezen, s koristmi tako za kakovost kot za količino življenja.1 Pomanjkanje organov je velik izziv, zato je bilo uporabljenih več strategij za povečanje števila razpoložljivih ledvic, vključno z uporabo darovalcev umrlih zaradi krvnega obtoka (DCD) in darovalcev z razširjenimi merili (ECD). ), oba sta povezana z višjimi stopnjami zapoznele funkcije presadka (DGF) v primerjavi z darovalcem umrlega možganskega debla (DBD). 2,3 Pri DCD ledvicah izpostavljenost topli ishemiji med procesom prenehanja krvnega obtoka pomembno prispeva k DGF . DGF se pojavi zaradi ishemične poškodbe tubularnih celic ali smrti, kar lahko spodbudi prirojeno imunsko aktivacijo prek vnetne sestave NLRP3, kar povzroči nastanek interlevkina (IL)1 in IL18.4-6 Dejansko je bila prisotnost vnetnih citokinov v urinu dokazana. uporablja kot biomarkerakutnaledvicapoškodbain DGF.7-9

Normotermična strojna perfuzija (NMP) omogoča perfuzijo presajenih organov s toplimi, oksigeniranimi rdečimi krvnimi celicami v odsotnosti krožečih imunskih komponent, vključno s komplementom in nevtrofilci.10-14 Ta postopek je bil uporabljen za oceno obrobnih organov15 in za " obnovitev" organov za olajšanje presaditve ledvic, ki so bile prvotno zavrnjene po ponudbi prek nacionalne službe za dodeljevanje organov.16 Naše prejšnje izkušnje z uporabo NMP so zagotovile utemeljitev za randomizirano kontrolirano preskušanje za oceno njegove učinkovitosti pri preprečevanju DGF pri DCD ledvicah,17 vendar mehanizmi, s katerimi bi lahko NMP koristil presajenim ledvicam, niso popolnoma razumljeni. Poleg tega je vprašanje, ali je dodatna manipulacija zledvicamed NMP, na primer z odstranitvijo provnetnih citokinov in kemokinov iz perfuzata, lahko ponudi dodatne koristi pri optimizaciji organa pred presaditvijo, pri človeških ledvicah niso obravnavali, vendar je naša študija prašičjega NMP pokazala obetavne rezultate.18

Tukaj smo ubrali nepristranski pristop k reševanju teh dveh vprašanj z uporabo transkriptomske analize človekaledvicabiopsije, odvzete na začetku in koncu NMP za oceno globalnih sprememb v izražanju genov. Uporabili smo pare človeških ledvic enega darovalca, kar je omogočilo primerjavo učinka različnih posegov v organe z identičnim genetskim ozadjem in lahko ocenili vpliv teh sprememb na napoved izida presadka.

Korist izvlečka Cistanche: preprečevanje akutnegaledvicapoškodba

2. REZULTATI

2.1. Parne ledvice so genetsko podobne in so uporaben model za ocenjevanje posegov

Raziskali smo transkripcijske spremembe, povezane z ohranjanjem organov in NMP, v dveh neodvisnih študijah, v vsaki s petimi pari ledvic, kar pomeni skupno 10 parov/20 človeških ledvic. Od tega sta bila dva od DBD in osem od DCD darovalcev (tabela S1, S2 in slika S1). V teh študijah smo vzeli kortikalne biopsije pred in po intervenciji (hladilnica ali NMP) in raziskali transkripcijsko pokrajino z uporabo sekvenciranja RNA (RNA-Seq). Uporaba parnih ledvic in parnih biopsij iz istihledvicanam je omogočil nadzor nad biološkimi variacijami in regresijo tega motečega dejavnika iz analize (slika S2A). To smo potrdililedvicapari začnejo s skupno transkripcijsko pokrajino (sl. S2B) in z uporabo različnih intervencij za vsakegaledvicav paru lahko proučujemo učinek posega neodvisno od biološke variacije.

SLIKA 1 Ledvice, izpostavljene hlajenju, kažejo omejene spremembe v izražanju genov v primerjavi s tistimi, ki so bile podvržene NMP. Pridobljen je bil par ledvic, ki je bil zavrnjen za uporabo pri presaditvi. enaledvicaje bil shranjen v statični hladilnici, drugi pa je bil podvržen normotermični strojni perfuziji (NMP). Biopsije so bile vzete iz zunanje skorje na začetku in po 2 urah. B, grafikon vulkana, ki kaže spremembo izražanja genov po 2 urah za navedeno skupino v primerjavi z začetkom. Rdeče pike označujejo različno izražene gene s prilagojeno P-vrednostjo<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

SLIKA 2 Korelacija transkriptoma po NMP z dolžino zapoznele funkcije presadka. Ekspresija gena je bila povezana z dolžino DGF v biopsijah, vzetih po NMP kot del randomiziranega kliničnega preskušanja. Narisane so bile stopnje izražanja 1000 genov z največjo korelacijo z izidom. B, GSEA je bila izvedena za korelacijo iz A proti naboru podatkov o značilnih znakih. Samo pomembne poti (vrednost FDR q<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. Posledica NMP je povečanje OXPHOS in genov vnetne poti v primerjavi s hladnim shranjevanjem

Da bi raziskali možne mehanizme, s katerimi lahko NMP vpliva na ledvice, smo jih najprej vzeli petledvicaparov (n {{0}} darovalcev DCD in n=1 umrlega darovalca s smrtjo možganskega debla [DBD], slika S1, tabela S1) in opravili časovno 0 (0 ur) kortikalno biopsijo . Na tej točki so bile ledvice randomizirane v statično hladilnico ali NMP, kot je opisano prej 10 (slika 1A). Po 2 urah je bila vzeta druga biopsija iz obeh ledvic in opravljen RNA-Seq. Pri primerjavi izražanja genov med 0- in 2--urnimi biopsijami smo ugotovili, da ledvice, ki so bile v statičnem hladilnem skladišču, niso imele statistično pomembne spremembe v izražanju katerega koli posameznega gena, ko so bile popravljene za večkratno testiranje (slika 1B , leva plošča). V nasprotju s tem je bilo v 2 urah NMP 956 genov reguliranih navzgor in 353 genov znižanih (slika 1B, desna plošča). Nato smo ocenili spremembe v izražanju skupin genov znotraj skupne poti, pri čemer smo primerjali desetine ali stotine genov namesto katerega koli posameznega gena, s čimer smo dodatno zmanjšali učinek bioloških medindividualnih variacij na analizo. To je razkrilo spremembe v funkcionalno pomembnih poteh, kjer izražanje vsakega posameznega gena znotraj te poti ni bilo spremenjeno v zadostni meri, da bi doseglo statistično pomembnost. Ta analiza obogatitve nabora genov (GSEA) je pokazala, da je imelo hladno shranjevanje znaten vpliv na številne presnovne poti (slika 1C, leva plošča). Zlasti je prišlo do izrazitega zmanjšanja genov, vključenih v oksidativno fosforilacijo (OXPHOS), ki je ključna pot, potrebna za generiranje ATP.19 V nasprotju s tem je bil OXPHOS med potmi, ki so bile med NMP znatno regulirane (slika 1C, desna plošča), s potencialnimi koristmi za preživetje celic in obnovo celične homeostaze. Poleg tega so bile med NMP sprožene številne poti, vključene v imunske ali vnetne procese, pri čemer je "signaliziranje TNF prek NFkB" pokazalo največje povečanje. V skladu s tem so bili TNF, pa tudi IL1B in kemokini CXCL8 (IL8) in CXCL2, ki rekrutirajo nevtrofilce, med najbolj reguliranimi geni v 2--urnih biopsijah NMP (slika 1D). Analiza nizov 50 najboljših upreguliranih genov je pokazala upregulacijo biokemično povezanih genov, ki so bili združeni v štiri glavna vozlišča; IL8 in kemokini, ki rekrutirajo nevtrofilce, geni, povezani z vnetjem, signalizacija NFkB in regulacija transkripcije (slika 1E). Opozoriti je treba, da sta bili ledvici DBD in DCD na začetku transkripcijsko podobni (slika S2C), genske poti, ki se spreminjajo med NMP, pa so bile podobne pri ledvicah DBD in DCD (slika S2D). Naša analiza skupaj dokazuje, da med NMP pride do povečanega izražanja genov, ki spodbujajo nastajanje energije, s potencialno koristnimi učinki za organ, vendar s hkratno indukcijo pro-vnetnih genov, ki so lahko škodljivi.

Izvleček Cistanche tubulosa: izboljša delovanje ledvic

2.3. Geni vnetne poti v ledvicah NMP, povezani s podaljšano zapoznelo funkcijo presadka

Da bi povezali transkripcijske spremembe, do katerih pride med shranjevanjem v hladnem in NMP, s kliničnimi rezultati, smo izvedli RNA-Seq na biopsijah, vzetih iz 33 ledvic DCD, ki so bile podvržene NMP kot del randomiziranega kliničnega preskušanja, ki trenutno ocenjuje njegovo učinkovitost.17 Vzorci so bili na voljo na podmnožica ledvic, randomiziranih v krak NMP študije, ki je bila nato presajena (tabela S3, slika S1). DGF je pogostejši pri DCD ledvicah in je klasično opredeljen kot potreba po dializi v prvem tednu po presaditvi. Vendar pa v obdobju neposredno po presaditvi nekateri bolniki prejmejo eno samo epizodo dialize zaradi hiperkaliemije, kar ne odraža nujno prisotnosti pomembne akutne tubularne nekroze. Zato smo uporabili model, ki povezuje izražanje genov s časom med operacijo presaditve in zadnjo dializo (tj. trajanje DGF). To je pokazalo bolj izrazite transkripcijske spremembe pri presadkih, ki zahtevajo dializo po prvih 24 urah po presaditvi (slika 2A), kot tudi pomembno pozitivno korelacijo med izražanjem genov vnetnih poti, vključno s "signaliziranjem TNFA prek NFkB" in potmi "vnetnega odziva" ter dolžino DGF, z večjo obogatitvijo teh poti v ledvicah, ki so imele daljši čas po presaditvi DGF (slika 2B). Nasprotno pa je dolžina DGF negativno korelirala z obsegom izražanja genov poti "OXPHOS" (slika 2B). Ti podatki skupaj kažejo, da so po NMP ledvice, ki imajo nižjo ekspresijo genov vnetne poti in večjo ekspresijo genov poti "OXPHOS", manj dovzetne za podaljšano DGF po presaditvi. To bi podprlo sklep, da imajo lahko molekularne spremembe, do katerih pride med NMP, tako koristne (indukcija genov poti OXPHOS) kot škodljive (indukcija genov vnetnih poti) učinke.

2.4. Izločanje urina in ledvični pretok krvi med NMP kažeta različne povezave z OXPHOS in geni vnetne poti

Količina urina, proizvedenega med NMP, je eden od številnih parametrov, vključenih v ocene kirurške kakovosti, ki se uporabljajo za usmerjanje odločitev o uporabi organov,15 toda ali visoka količina urina med NMP resnično napoveduje dobro prognozo za ledvice in osnovne molekularne poti, aktivirane v ledvice z velikim izločanjem urina ni jasno. Pri skupno 10 ledvicah, ki so bile podvržene NMP (samo ledvice NMP, tabela S1 in S2, slika S1), smo opazili razpon izločanja urina od 0 do 340 ml v 2-urnem obdobju perfuzije (Slika 3A na levi plošči). Omeniti velja, da ko smo primerjali poti, ki se spreminjajo med NMP v petih ledvicah v dveh neodvisnih poskusih, smo ugotovili, da so bile inducirane podobne poti (slika S3A), kar potrjuje ponovljivost našega eksperimentalnega načrta in uporabnost primerjave poti namesto posameznih genov. V 2--urnih postperfuzijskih biopsijah je izražanje 11 genov pomembno koreliralo s količino urina, proizvedenega v tem obdobju. Ti so vključevali proteine ​​toplotnega šoka (HSP), HSPA1A, HSPA1B in HSPH1, ki so pozitivno korelirali s povečanim izločanjem urina (slika 3A desna plošča). Analiza obogatitve nabora genov je pokazala, da je izločanje urina pozitivno koreliralo tudi z geni poti "TNF signaliziranje prek NFkB" in negativno koreliralo z geni OXPHOS v postperfuzijskih biopsijah (slika 3B, S3C). Podobno je pri biopsijah pred perfuzijo OXPHOS negativno koreliral z izločanjem urina v teh ledvicah, medtem ko so poti, povezane z imunsko aktivacijo, vključno s "signaliziranjem TNF preko NFkB" in "zavrnitvijo alotransplantata", pozitivno korelirale z izločanjem urina, kar nakazuje, da ima NMP majhen učinek na te procese ali na drugih analiziranih poteh pri ledvicah z velikim izločanjem urina (slika 3B, S3C-D). Ker so v naših kliničnih vzorcih s podaljšanim DGF opazili indukcijo genov vnetne poti (slika 2B), ti podatki izpodbijajo dogmo, da se veliko izločanje urina pojavi v bolj sposobnih, "zdravih" ledvicah, in kažejo, da imajo te ledvice dejansko več vnetni potencial, so manj sposobni proizvajati energijo in da se ta med NMP bistveno ne spremeni.

Ledvični krvni pretok med perfuzijo je bil prav tako ocenjen kot parameter, ki lahko odraža kasnejšo funkcijo presadka.15 Pri 10 preučevanih ledvicah je ledvični pretok krvi po 2 urah perfuzije variiral od 14,1 do 168,8 ml/minuto (slika 3C leva plošča). V 2--urnih postperfuzijskih biopsijah je osem genov pomembno pozitivno koreliralo s povečanim ledvičnim pretokom krvi (slika 3C desna plošča), vključno s HSPA1L, vendar ni bilo neposrednega prekrivanja med tem seznamom genov in tistimi, ki so povezani z izločanjem urina (slika 3A ). Analiza obogatitve nabora genov je pokazala, da je visok ledvični krvni pretok pozitivno koreliral z geni OXPHOS v 0--urnih biopsijah, vendar je v nasprotju s tistimi z največjim izločanjem urina pomembno vplivala perfuzija, kar je povzročilo negativno korelacijo z "OXPHOS" genov poti za 2 uri (slika 3D, slika S4A-B). Ledvični pretok krvi je bil v negativni korelaciji s številnimi imunskimi in vnetnimi genskimi potmi v 0- in 2--urnih biopsijah (slika 3D, slika S4B), v nasprotju z izločanjem urina (slika 3B, slika S3C). Ti podatki skupaj nakazujejo, da ledvični pretok krvi in ​​izločanje urina morda nista enakovredna pokazatelja bolj sposobne ledvice, vendar pa lahko prvi bolj zvesto identificiraledvicamanj verjetno, da bo imel podaljšan DGF.

koristi in stranski učinki cistanche: protivnetno

2.5. Dodatek hem-adsorberja v perfuzijski tokokrog ne vpliva na parametre perfuzije, vendar znatno zmanjša izražanje vnetnih genov, vključno z NLRP3 in IL1B

Analize oledvicaperfuzata so pokazale znatno povečanje koncentracije protivnetnih citokinov in kemokinov med potekom hipotermije in NMP. 20, 21 Te bioaktivne molekule ponovno krožijo v ledvicah, s potencialom, da povzročijo nadaljnje vnetje. Glede na to, da je naša analiza presajenihledvicavzorcev, ki so pokazali, da je indukcija genov, odvisnih od TNF, v ledvicah NMP povezana z DGF (slika 2B), domnevali smo, da lahko odstranitev citokinov in kemokinov iz perfuzijskega kroga oslabi indukcijo vnetnega gena, s potencialnimi koristnimi učinki za ledvice. Takšen pristop je pokazal nekaj učinkovitosti pri bolnikih s sindromom sistemskega vnetnega odziva, 22, 23, in je bil povezan s povečanim ledvičnim pretokom krvi v prašičjih ledvicah, ki so bile podvržene NMP. 18 Da bi to preizkusili na človeških ledvicah, smo vzeli dodatnih pet ledvičnih parov in izvedli NMP 4 ure z biopsijami, odvzetimi ob 0, 2 in 4 urah (slika S1). V vsakem primeru je bil v perfuzijski krog ene ledvice znotraj vsakega para (NMP plus HA) dodan citosolni hem-adsorber (HA), ki odstrani molekule z molekulsko maso 10-50 kDa (slika 4A). Kot je bilo pričakovano, je dodatek HA povzročil nižje koncentracije različnih citokinov v perfuzatu (slika 4B), vendar ni vplival na ledvični pretok krvi, izločanje ali sestavo urina, porabo kisika in kislinsko-bazično homeostazo (slika 4C, Tabela S4, S5). Tako v 4 urah NMP HA ni vplival na perfuzijske parametre, ki se trenutno klinično uporabljajo za ustvarjanje rezultatov ocene kakovosti, vendar je imel znaten učinek na izražanje genov; Po NMP je bilo 1794 in 4026 genov reguliranih navzgor po 2 oziroma 4 urah, vključno s TNF in IL6 (slika 4D, E). vendar se je samo polovica tega števila (n=898 in n=2606) povečala, ko je bil prisoten HA (slika 4D, slika S5A in B). Število znižanih genov je bilo zmanjšano tudi z dodatkom HA (slika 4D). Po 4 urah NMP je bilo 46 genov znatno reguliranih navzgor in 181 znižanih z dodatkom HA (slika 4F). Ta oslabljen transkripcijski odziv je vključeval gene, povezane z aktivacijo inflammasoma NLRP3, kot so IL1B, NLRP3 in CASP1 (slika 4G, slika S4B) in nekatere kemokine, ki rekrutirajo nevtrofilce (slika S5C), ki so bili prej povezani s poškodbo ledvic na živalskih modelih. 24, 25 To dokazuje, da se topni mediatorji sproščajo izledvicaponovno krožijo in spodbujajo de novo izražanje vnetnih genov v organu, vendar je to mogoče ublažiti z njihovo odstranitvijo iz perfuzijskega kroga.

SLIKA 4 Dodatek hem-adsorberja k normotermičnemu strojnemu perfuzijskemu krogu ima znatne učinke na raven citokinov v perfuzatu in transkriptomu, ne pa tudi na fizikalne parametre, zabeležene na napravi. Par človeških ledvic je bil odvzet istemu darovalcu, eden od para je bil podvržen standardnemu protokolu normotermične strojne perfuzije (NMP) za 4 ure, drugiledvicapodvržen NMP z dodatkom hem-adsorberja v vezje. Vzorci za RNA-Seq so bili odvzeti pred perfuzijo (0 ur), po 2 urah in na koncu (4 ure). B, Koncentracija ključnih citokinov v perfuzatu po 4 urah NMP. Črta označuje pare ledvic. Meritve citokinov so bile normalizirane na skupno vsebnost beljakovin perfuzata. Navedena P-vrednost je iz testiranja parnega t-testa za zmanjšanje citokinov z dodatkom HA. C, Proizvodnja urina in ledvični pretok krvi (RBF) v času perfuzije. Zelena črta označuje samo NMP, oranžna pa z dodatkom hem-adsorberja. D, Vennov diagram, ki prikazuje število genov, izrazito različno izraženih pri primerjavi vzorcev 2-ur ali 4-ur z vzorci pred (0-ur). Rdeči diagrami so regulirani geni, modri pa nizko regulirani. Presečišče so geni, ki so deferencialno izraženi v obeh časovnih točkah v isto smer. E, log2 normalizirane vrednosti ekspresije za navedene gene po perfuziji iz tkivnega transkriptoma, prikazane so standardne vrstice napak. F, grafikon vulkana za parno primerjavo NMP samega z NMP plus HA po 4 urah. Rdeča barva označuje različno izražene gene s prilagojeno P-vrednostjo<0.05. g,="" as="" for="">

zdravljenje ledvičnih bolezni izvleček cistanche

2.6. HA, povezana z zmanjšanjem genskega podpisa, povezanega z zapoznelim delovanjem presadka

Analiza obogatitve genskega niza je pokazala znatno zmanjšanje poti "signaliziranja TNF prek NFkB" v ledvicah NMP in HA v primerjavi s samo NMP (slika 5A-B). Predvsem prisotnost HA ni samo zmanjšala izražanja vnetnega gena znotrajledvicaampak tudi povečan OXPHOS in presnovne poti maščobnih kislin, ki oba prispevata k ustvarjanju energije (slika 5A-B). Zato bi spremembe v poteh izražanja genov, do katerih pride z HA, podprle sklep, da so njegovi učinki klinično koristni, saj je zmanjšal "signaliziranje TNFA prek genov NFkB" in povečal genov "OXPHOS" poti, ki sta bili povezani s krajšo trajanje DGF (slika 2B).

Za nadaljnje raziskovanje razmerja med transkripcijskimi spremembami v NMP in kliničnimi izidi smo skušali kurirati genski podpis, ki je prisoten v ledvicah z DGF. Identificirali smo 100 najboljših pozitivno (GOR) in negativno (DOL) reguliranih genov (razvrščenih po spremembi logaritma), ki so bili v korelaciji z dolžino DGF v 33 vzorcih kliničnih preskušanj (slika 5C, podatki S1). Ugotovili smo znatno obogatitev genskega podpisa, povezanega s povečano dolžino DGF v vzorcih z večjim izločanjem urina (slika 5D), kar nakazuje, da visoko izločanje urina med NMP identificira ledvice, pri katerih obstaja tveganje za dolgotrajnejši DGF. Med podpisom DGF in geni, povezanimi z večjim ledvičnim pretokom krvi, ni bilo statistično značilne korelacije (slika 5E). Nato smo ocenili, ali in kako je dodajanje HA v vezje NMP vplivalo na izražanje genskih podpisov DGF "UP" in "DOWN". Zanimivo je, da je to pokazalo, da je bila ekspresija genskega podpisa, povezana s povečano dolžino DGF, znatno zmanjšana z dodatkom HA, in podpis, povezan z zmanjšano dolžino DGF, se je znatno povečal z dodatkom HA (slika 5F).

Na splošno transkripcijske spremembe, ki smo jih ugotovili, kažejo, da ima NMP potencialne koristi pred hladnim shranjevanjem v smislu njegovih učinkov na proizvodnjo energije v ledvicah. Vendar pa se med perfuzijo nekatere bioaktivne molekule sprostijo iz ledvice v perfuzijski tokokrog in ustvarijo ojačitveno zanko, ki poganja vnetje, ko ponovno vstopijo v ledvico. Odstranitev teh molekul prekine to zanko in je lahko uporabna za zmanjšanje vnetja in povečanje proizvodnje energije, kar dodatno poveča koristne učinke NMP in zmanjša dovzetnost za DGF (slika 6).

SLIKA 5 Dodatek adsorberja šunke zmanjša z DGF povezan genski podpis. Analiza GSEA učinka dodajanja HA v transkriptom po 4 urah NMP proti značilni poti genetskih setov. Narisane so samo pomembne poti. Rdeče pike označujejo pozitivno obogatitev, modre pa negativno, velikost pike je obratno sorazmerna z vrednostjo FDR q, položaj pa označuje normaliziran rezultat obogatitve (NES). B, Grafi obogatitve iz GSEA za ključne poti iz podatkovne baze Hallmark za primerjavo iz A. Črta označuje tekoči rezultat obogatitve, violinski graf pa označuje porazdelitev članskih genov genskega niza po razvrščenem seznamu genov, uporabljenem v vsaki analizi. C, Toplotni zemljevid prvih štirih največjih pozitivnih (GOR) in negativnih (DOL) korelacije z dolžino DGF in uporabljen kot del podpisa genske ekspresije za DGF. Celoten podpis DGF je podan v dodatnih podatkih. DF, DGF povezan genski podpis je bil uporabljen z GSEA za raziskovanje izražanja podpisa v korelaciji 2- ur izločanja urina s 2- ur transkriptoma (D), korelacija 2- ur RBF s transkriptomom 2-hr (E) in učinek dodatka HA na transkriptom po 4 urah (F). Parcele kot za A

SLIKA 6 Grafični povzetek. A, Med shranjevanjem na hladnem pride do globalnega zmanjšanja transkripcije. Med NMP je izražanje genov v številnih poteh regulirano navzgor, vključno z oksidativno fosforilacijo (OXPHOS) in geni vnetne poti, kot so TNF, IL8 in NFkB. B leva plošča, Med NMP se vnetni mediatorji (rumeni krogi) sproščajo izledvicav perfuzijsko raztopino. Ponovno krožijo in spodbujajo vnetno transkripcijo genov v ledvicah ter so povezani z zmanjšanjem genov za proizvodnjo energije, kar zmanjšuje ATP. Desna plošča, Prisotnost hem-adsorberja (HA) prekine to vnetno ojačitveno zanko

Cistanche zelišče za izboljšanje delovanja ledvic

3. RAZPRAVA

Naši podatki kažejo, da je hladno shranjevanje učinkovito pri omejevanju bistvenih sprememb v izražanju genov. To je v skladu z modeli glodalcev, kjer so ledvice, shranjene do 18 ur v hladilnici, pokazale malo sprememb v izražanju provnetnih citokinov, vključno z IL1, TNF in IL6.26 Naša uporaba nepristranskega, globalnega transkripcijskega profiliranja namesto merjenje majhnega števila kandidatnih genov nam je omogočilo analizo izražanja skupin genov, ki jih najdemo znotraj specifičnih poti. To je razkrilo znatno zmanjšanje izražanja genov OXPHOS in poti glikolize v hladno shranjenih ledvicah, kar bi lahko zmanjšalo sposobnost teh ledvic za ustvarjanje ATP, v skladu s prejšnjo študijo, ki je pokazala zmanjšan ATP v hladno shranjenih človeških ledvicah.27 Številne Pro-vnetnih poti je bilo prav tako zmanjšano med shranjevanjem v hladilnici, vključno z aktivacijo TNF prek NFkB in poti reaktivnih kisikovih vrst, ki so lahko potencialno koristne. Vendar pa se lahko zgodi, da hladno shranjevanje le začasno zadrži te poti in da bi po reperfuziji pri prejemniku prišlo do podobnih sprememb v ekspresiji vnetnega gena, kot so opažene pri NMP.

NMP je imel nasprotni učinek kot hladno shranjevanje na gene OXPHOS in poti glikolize, s čimer je povečal njihovo izražanje, s potencialom povečanja celične zmogljivosti za ustvarjanje ATP in obnovitev homeostaze. Opozoriti je treba, da se je tudi pokazalo, da hipotermična oksigenirana perfuzija človeških ledvic zvišuje ravni ATP v primerjavi s hladnim shranjevanjem 27, zato je lahko ponovna vzpostavitev oksigenacije glavna spodbuda za te procese in ne normotermija. Kljub temu bodo te spremembe verjetno koristne za organ glede na naše opažanje negativne korelacije med povečano ekspresijo genov poti OXPHOS in podaljšanim DGF.

Nedavni članek Hameeda et al28 je prav tako izvedel transkriptomsko analizo NMP v treh ledvicah, ki so bile podvržene NMP. Žal avtorji svojih podatkov niso javno objavili, zato poglobljena primerjava z našim naborom podatkov ni mogoča. Vendar pa je njihov rokopis pokazal indukcijo genov, povezanih z imunskim odzivom, med NMP, vključno z IL1B, CXCL2 in TNF, kar je v skladu z našimi ugotovitvami.

V naši analizi ledvic, ki so bile podvržene NMP v okviru kliničnega preskušanja, smo podpise genske ekspresije povezali z dolžino DGF in ne z incidenco DGF (opredeljeno kot potreba po dializi v prvem tednu po presaditvi). Predvsem so bile ledvice s trajanjem DGF 1 dan ali manj transkripcijsko zelo podobne tistim brez DGF, kar verjetno odraža potrebo po dializi zaradi hiperkaliemije, povezane s perioperativnim posegom, in ne zaradi dobrovernega DGF. Ugotovili smo, da je bil daljši DGF povezan z večjo ekspresijo signalizacije TNFA prek genov poti NFkB in nižjo ekspresijo genov, povezanih z OXPHOS. Ti podatki kažejo, da lahko ledvice s povečanim OXPHOS in zmanjšanim imunskim signaliziranjem predstavljajo boljši potencial kot ledvice darovalcev, vendar ta zaključek zahteva potrditev v večji prospektivni študiji.

Ocenili smo tudi molekularne procese, ki so povezani z izločanjem urina in ledvično krvjo med NMP. Ti parametri so bili prej uporabljeni skupaj s številnimi drugimi ukrepi za ustvarjanje ocene kakovosti perfundiranih ledvic. Šteje se, da visoke vrednosti izločanja urina in ledvičnega krvnega pretoka odražajo bolj sposoben presadek.15 Naši podatki razkrivajo, da se poti, ki so v korelaciji z visokim izločanjem urina in visokim ledvičnim pretokom krvi, razlikujejo, in dejansko ti parametri kažejo polno nasprotno povezavo z vnetnimi potmi . Visoka količina urina je bila povezana z večjo ekspresijo genov imunske poti, medtem ko je bil visok ledvični pretok krvi negativno povezan s temi potmi. Ugotovili smo tudi, da je bil genski podpis DGF, ki smo ga ustvarili, obogaten v ledvicah z visoko količino urina med NMP, kar kaže, da lahko ta parameter identificira ledvice, pri katerih obstaja tveganje za daljši DGF, v nasprotju s trenutno dogmo. Ena od možnih razlag je, da zelo veliko izločanje urina odraža ledvice z več tubularnimi poškodbami, ki nimajo zmožnosti koncentriranja urina. Tako lahko pride do "učinka Zlatolaske" v zvezi z izločanjem urina, kjer imajo ledvice z nizkim/majhnim izločanjem urina znatne nepravilnosti pri nastajanju filtrata, tiste z zelo velikim izločanjem urina pa imajo precejšnje tubularne poškodbe, ki onemogočajo koncentracijo urina. To hipotezo bi bilo treba preizkusiti na večjem številu ledvic, ki so bile naknadno presajene.

Med 4 urami NMP je prišlo do indukcije vnetnih genov v ledvicah. Vendar je treba omeniti, da trenutna klinična praksa vključuje samo 1 uro NMP in da ta učinek morda ni očiten v krajšem času perfuzije. Vendar ima lahko daljša perfuzija koristi v smislu ponovne vzpostavitve oksigenacije in proizvodnje energije, v našem poskusu pa bi lahko negativne učinke indukcije imunskega gena bistveno izničili z uvedbo citosola HA v perfuzijski krog. Ti podatki kažejo, da vnetni mediatorji, ki jih ustvarijo ledvice med potekom NMP, vstopijo v perfuzijski krog in so sposobni poslabšati sterilno vnetje ter da njihova odstranitev izboljša indukcijo genov vnetne poti, opaženih med NMP. Pomembno je, da smo pokazali, da dodatek HA vpliva na izražanje genov, ki so klinično povezani s slabšimi rezultati. Naš genski podpis DGF je bil pridobljen iz vzorcev, ki so bili podvrženi NMP kot del kliničnega preskušanja, ki je ocenilo njegovo učinkovitost, kar nam je omogočilo, da trdno povežemo spremembe, ki smo jih opazili v naših študijah seznanjenih ledvic, s kliničnimi končnimi točkami pri ledvicah, ki so bile podvržene presaditvi. Vendar pa bo njegova uporaba v okviru kliničnega preskušanja potrebna za dokončno dokazovanje uporabnosti njegove uporabe za ledvice pred presaditvijo. HA je nespecifična in lahko odstrani molekule, ki so koristne, poleg tistih, ki so organu škodljive. Ugotovili smo, da se je neto učinek HA na ledvični transkriptom izkazal za koristnega, vendar je morda izboljšava za specifično odstranitev dokazanih, škodljivih mediatorjev še bolj učinkovita.

Pari ledvic, ki smo jih uporabili, so bili od istega posameznika in so bili torej genetsko identični ter so bili skozi življenje darovalca v podobnem okolju. Potrdili smo, da je bil njihov časovni transkriptom 0 izjemno podoben (slika S2 A, B). Vendar te biopsije vzorčijo majhen del ledvice in pari ledvic so lahko asimetrično prizadeti zaradi patologije, na primer ciste ali bolezni majhnih žil. Dodatno opozorilo je, da so bile vse ledvice, uporabljene v tukaj predstavljenih intervencijskih poskusih, zavrnjene za presaditev in nekatere predstavljajo presajene organe na spodnjem koncu kakovostnega spektra. Kljub temu smo pri primerjavi genskih poti v skupinah s petimi ledvicami opazili zelo ponovljive rezultate. Prav tako smo lahko dokazali, da so imele ledvice iz DCD in DBD podoben odziv na perfuzijo. S kombinacijo tega z našim kuriranim podpisom DGF po NMP smo lahko predvideli potencialne klinične koristi. Ta eksperimentalni pristop bi lahko uporabili kot predklinično orodje za pregled prihodnjih posegov glede potencialne terapevtske učinkovitosti, da bi omogočili racionalno izbiro možnih posegov za klinična preskušanja.

Če povzamemo, naša študija zagotavlja prvi globalni transkripcijski profil človeških ledvic, ki so podvržene NMP, razrešuje različne molekularne poti, ki se aktivirajo v NMP v primerjavi s hladnim shranjevanjem, in prikazuje, da lahko škodljivi učinki bioaktivnih molekul, proizvedenih ali sproščenih iz ledvic med NMP, obrniti z dodatkom HA. Poleg tega je ta intervencija zmanjšala izražanje genov, povezanih s podaljšanim DGF, kar je močno mehanistično utemeljitev za uporabo takšne intervencije v prihodnjem kliničnem preskušanju. Naši podatki imajo tudi posledice za perfuzijske strategije zunaj ledvic, vključno s presaditvijo jeter in pljuč, kar kaže, da je treba raziskati odstranitev bioaktivnih molekul iz perfuzatov v teh kontekstih, kjer se NMP vse pogosteje uporablja. Končno naša študija poudarja uporabnost globalnega transkripcijskega profiliranja v paruledviceza ocenjevanje novih posegov na prekrvljene organe; transkripcijske spremembe so pred spremembami v številčnosti beljakovin (tradicionalno uporabljene kot biomarkerjiledvicapoškodbe) in na desettisoče genskih zapisov je mogoče zlahka izmeriti. Tako ima merjenje RNK potencial, da zagotovi zgodnje, občutljivo odčitavanje celične funkcije človeških organov, pridobljenih za presaditev, ki se lahko uporabijo za prihodnje študije.

ZAHVALA

Avtorji se zahvaljujejo vsem darovalcem organov in njihovim družinam. Laboratorij Clatworthy je hvaležen za osnovne zmogljivosti, ki jih zagotavlja Laboratorij za molekularno biologijo MRC. To delo je bilo opravljeno z uporabo virov, ki jih je zagotovila storitev Cambridge Service for Data-Driven Discovery (CSD3), ki jo upravlja raziskovalna računalniška služba Univerze v Cambridgeu, ki sta jo zagotovila Dell EMC in Intel s financiranjem Tier-2 iz Inženirske in fizikalne raziskave Svet (kapitalska podpora EP/P020259/1) in financiranje DiRAC iz Sveta za znanost in tehnologijo (www. Dirac. ac. Združeno kraljestvo).

RAZKRITJE

Avtorji nimajo navzkrižja interesov, ki bi ga morali razkriti, kot je opisano v American Journal of Transplantation.

AVTORSKI PRISPEVKI

JRF, SH, MLN in MRC so oblikovali študijo in interpretirali podatke. JRF, SH, TM, CJW, AF in TCD so izvedli poskuse. JRF, SH in MRC so ustvarili slike in tabele. MRC je napisal glavni rokopis. JRF in SH sta ustvarila metode in legende figur, JRF, SH in MLN pa so uredili rokopis.

Koristi Cistanche: izboljša delovanje ledvic

Reference:
1. Methven S, Steenkamp R, Fraser S. UK Renal Registry 19th Annual Report: Poglavje 5 Preživetje in vzroki smrti pri odraslih bolnikih v Združenem kraljestvu na nadomestni ledvični terapiji v 2015: nacionalne in centrske analize. Nefron. 2017; 137 (1): 117–150.
2. Summers DM, Johnson RJ, Allen J, et al. Analiza dejavnikov, ki vplivajo na izid po presaditvi ledvic, darovanih po srčni smrti v Združenem kraljestvu: kohortna študija. Lanceta. 2010; 376 (9749): 1303–1311.
3. Summers DM, Johnson RJ, Hudson A, Collett D, Watson CJ, Bradley JA. Vpliv starosti darovalca in časa shranjevanja v hladilnici na izid pri prejemnikih ledvic, darovanih po smrti krvnega obtoka v Združenem kraljestvu: kohortna študija. Lanceta. 2013;381(9868):727–734.
4. Friedewald JJ, Rabb H. Vnetne celice pri ishemični akutni odpovedi ledvic.LedvicaInt. 2004;66(2):486–491.
5. Kono H, Rock KL. Kako odmirajoče celice opozorijo imunski sistem na nevarnost. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):279–289.
6. Berry M, Clatworthy MR. Imunoterapija za akutnoledvicapoškodba. Imunoterapija. 2012;4(3):1–12.
7. Parikh CR, Coca SG, Thiessen-Philbrook H, et al. Pooperativni biomarkerji napovedujejo akutnoledvicapoškodbe in slabi rezultati po operaciji srca pri odraslih. J Am Soc Nephrol. 2011; 22 (9): 1748–1757.
8. Hall IE, Yarlagadda SG, Coca SG, et al. IL-18 in NGAL v urinu napovedujeta dializo in okrevanje presadka po njejledvicapresaditev. J Am Soc Nephrol. 2010; 21 (1): 189–197.
9. Malyszko J, Lukaszyk E, Glowinska I, Durlik M. Biomarkerji zakasnjenega delovanja presadka kot oblike akutnegaledvicapoškodba vledvicapresaditev. Sci Rep. 2015; 5: 11684.
10. Hosgood SA, Nicholson ML. Prva presaditev ledvice pri človeku po normotermični perfuziji ex vivo. Presaditev. 2011;92(7):735–738.
11. Yong C, Hosgood SA, Nicholson ML. Normotermična perfuzija ex vivo pri presaditvi ledvic: preteklost, sedanjost in prihodnost. Presaditev organa Curr Opin. 2016; 21 (3): 301–307.
12. Fisher A, Andreasson A, Chrysos A, et al. Opazovalna študija perfuzije pljuč Donor Ex Vivo pri presaditvi pljuč v Združenem kraljestvu: DEVELOP-UK. Health Technol Assess. 2016; 20 (85): 1–276.
13. Slama A, Schillab L, Barta M, et al. Standardno pridobivanje pljuč darovalca z normotermično perfuzijo pljuč ex vivo: prospektivno randomizirano klinično preskušanje. J Presaditev srca in pljuč. 2017; 36 (7): 744–753.
14. Nasralla D, Coussios CC, Mergental H, et al. Naključno preskušanje normotermnega ohranjanja pri presaditvi jeter. Narava. 2018; 557 (7703): 50–56.
15. Barlow AD, Hamed MO, Mallon DH, et al. Uporaba normotermične perfuzije Ex vivo za oceno kakovosti zavrženih pankreasov človeških darovalcev. Am J Transplant. 2015; 15 (9): 2475–2482.

16. Hosgood SA, Saeb-Party K, Hamed MO, Nicholson ML. Uspešna presaditev človeških ledvic, za katere velja, da jih ni mogoče presaditi, vendar so bile oživljene z normotermično strojno perfuzijo Ex vivo. Am J Transplant. 2016; 16 (11): 3282–3285.
17. Hosgood SA, Saeb-Party K, Wilson C, Callaghan C, Collett D, Nicholson ML. Protokol randomiziranega nadzorovanega, odprtega preskušanja ex vivo normotermične perfuzije v primerjavi s statičnim hladnim shranjevanjem pri darovanju po presaditvi ledvice s smrtjo krvnega obtoka. BMJ Open. 2017;7(1):e012237.
18. Hosgood SA, Moore T, Kleverlaan T, Adams T, Nicholson ML. Hemoadsorpcija zmanjša vnetni odziv in izboljša pretok krvi med perfuzijo ledvic ex vivo v poskusnem modelu. J Transl Med. 2017; 15 (1): 216.
19. Krebs HA. Zgodovina cikla trikarboksilne kisline. Perspect Biol Med. 1970; 14 (1): 154–170.
20. Hoogland ER, de Vries EE, Christiaans MH, Winkens B, Snoeijs MG, van Heurn LW. Vrednost koncentracije biomarkerja strojne perfuzije v DCDledvicapresaditve. Presaditev. 2013;95(4):603–610.
21. van Balkom BWM, Gremmels H, Ooms LSS, et al. Beljakovine v konzervacijski tekočini kot napovedovalci zapoznelega delovanja presadka v ledvicah darovalcev po cirkulatorni smrti. Clin J Am Soc Nephrol. 2017; 12 (5): 817–824.
22. Kogelmann K, Jurczak D, Scheller M, Druner M. Hemoadsorbcija s CytoSorb pri septičnih bolnikih: serija primerov. Crit Care. 2017; 21 (1): 74.
23. David S, Thamm K, Schmidt BMW, Falk CS, Kielstein JT. Vpliv zunajtelesne odstranitve citokinov na delovanje vaskularne pregrade pri bolniku s septičnim šokom. J Intenzivna nega. 2017; 5:12.
24. Li L, Huang L, Vergis AL, et al. IL-17, ki ga proizvajajo nevtrofilci, uravnava z IFN-gama posredovano migracijo nevtrofilcev pri mišihledvicaishemično-reperfuzijska poškodba. J Clin Invest. 2010;120(1):331–342.
25. Hayama T, Matsuyama M, Funao K, et al. Ugoden učinek zaviralca nevtrofilne elastaze na ledvično toplo ishemijo-reperfuzijsko poškodbo pri podganah. Transplant Proc. 2006;38(7):2201–2202.
26. Saat TC, Susa D, Roest HP, et al. Primerjava profilov ekspresije vnetnih, citoprotektivnih in poškodbenih genov v ledvicah darovalcev možganske smrti in srčne smrti. Presaditev. 2014;98(1):15–21.
27. Ravaioli M, Baldassare M, Vasari F, et al. Strategije za ponovno vzpostavitev ravni adenozin trifosfata (ATP) po več kot 20 urah hladne ishemije v človeških robovihLedvicapresadki. Ann Transplant. 2018; 23: 34–44.
28. Hameed AM, Lu DB, Patrick E, et al. Kratka normotermična strojna perfuzija pomlajuje zavržene človeške ledvice. Transplant Direct. 2019;5(11):e502.