Izbris Alox15 izboljša disfunkcijo ledvic in zavira fbrozo s povečanim PGD2 v ledvicah
Mar 12, 2022
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL OKUŽBO LEDVIC/LEDVIC
Uvod
Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) in njihovi metaboliti so povezani z vnetjem in njegovim razreševanjem v več organih [1]. Oksilipini, ki nastanejo z oksidacijo PUFA, so pomembni za biološko aktivnost PUFA kot lipidnih mediatorjev [1, 2]. Biosintezo oksilipinov posreduje več encimov, kot so lipoksigenaza (LOX), ciklooksigenaza (COX) in citokrom P450 (CYP) [3]. Ti encimi proizvajajo več presnovkov lipidov, kot so prostaglandini, levkotrieni in lipoksini, ki so vsi močno vključeni v uravnavanje vnetja [1, 4]. Na primer, ALOX15, glavni podtip LOX, ima dvojni vidik proinflamatornih in protivnetnih lastnosti prek svojih presnovkov [5]: ALOX15 je močno izražen v eozinofilcih, bronhoalveolarnih epitelnih celicah in alveolarnih makrofagih v nepatoloških pogojih [5, 6 ] in spodbuja resnost astme [7], poškodbe pljuč [8] in srčnega popuščanja [9], medtem ko preprečuje vnetje pri artritisu [10] in ishemičnih možganih [11]. Poleg tega lipidni mediatorji in njihovi encimi vplivajo na fibrozo organov in vnetje. Specifični lipidni mediatorji so vključeni v patogenezo fibroze pljuč [12], jeter [13] in srca [14]. Podobno je zgoraj omenjeni ALOX15 povezan tudi s patogenezo fibroze, kot je dermalna fibroza [15].
Ena pogostih kroničnih bolezni je kronična bolezni ledvic(CKD), ki prizadene približno 8–16 odstotkov splošne populacije v vseh stadijih skupaj [16]. Čeprav je patogeneza kronične ledvične bolezni kompleksna in se razlikuje glede na osnovno bolezen,ledvicatkivo na splošno postane disfunkcionalno, kar vodi v končno fazoodpoved ledvicposledica kroničnega vnetja in kasnejše fibroze [17]. Kot že omenjeno, so lipidni mediatorji, pridobljeni iz PUFA, močno povezani z vnetjem in njegovo posledično fibrozo. Na primer, lipoksini in resolvini zavirajo ledvično fibrozo [18, 19], vendar ti učinki še niso raziskani v modelu kronične ledvične bolezni z okvarjenimdelovanje ledvic.Poleg tega celoviti lipidomski profili pri KLBledvicatkiva še vedno niso prijavljeni. Tako je vloga presnovnih encimov lipidov in njihovih produktov v patogenezi kronične ledvične bolezni še vedno slabo razumljena.Namen te študije je bil pojasniti vpletenost encimov za presnovo maščobnih kislin in njihovih produktov vledvičnaokvara 5/6 nefrektomiziranih (Nx) miši modela CKD. Ta študija je pokazala, da sta se pri kronični ledvični bolezni povečali tako transkripcija kot raven izražanja beljakovin Alox15ledvice, in miši Alox15−/− so se izboljšaleledvicadisfunkcijo in fibrozo v modelu CKD. Še več, PGD2, ki je povečan presnovek lipidov v CKDledvicemiši Alox15−/−, je zaviral epitelno-mezenhimski prehod (EMT) v proksimalnih tubularnih gojenih celicah. Zato bi lahko bila inhibicija Alox15 in/ali dajanje PGD2 nova terapevtska tarča kronične ledvične bolezni in fibroze.
Ključne besede:kronična ledvična bolezen; lipoksigenaza; ALOX15; Mediatorski lipidomiki; Polinenasičene maščobne kisline; ledvična
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DELOVANJE LEDVIC/LEDVIC
Materiali in metode
Živali in poskusiV tej študiji so bili uporabljeni 8-tedne stari mišji samci C57BL/6 J (CLEA Japonska), ki so bili aklimatizirani 1 teden, preden so bili izvedeni vsi poskusi. Poleg tega so bile miši Alox15-/- ustvarjene v ozadju C57BL/6 J (Laboratorij Jackson), model 5/6 Nx pa je bil vzpostavljen v skladu s prejšnjo študijo [20]. Zbrali smo vzorce krvi za ocenodelovanje ledvicinledvicavzorcev tkiva za imunobloting in verižno reakcijo s polimerazo po 8 tednih po 5/6 Nx in za histološko analizo po 40 tednih po 5/6 Nx. Vsi poskusi so bili v skladu s smernicami za raziskave na živalih TMDU in Odbor za nego in uporabo živali TMDU je odobril naš študijski protokol (številka odobritve: A2019-117C4).
Mediatorski lipidomiki na osnovi LC-MS/MSIzvedli smo analizo LC-MS/MS, kot je opisano prej [21, 22]. Podrobnosti postopka so opisane v Dodatnih metodah,Druge eksperimentalne metodeDruge eksperimentalne metode smo opisali v dopolnilnih metodah.
Rezultati
Raven mRNA Alox15 se je povečala v 5/6 Nx ledvicahKvantitativne spremembe oksilipinskih encimov pri kronični ledvični bolezniledvicaso raziskali z uporabo miši C57BL/6 za lažno operacijo ali 5/6 Nx, kot je opisano prej [20]. Za analizo izražanja glavnih oksilipinskih encimov, izraženih v ledvicah (Alox15, Alox5, Ptgs1 (COX1), Ptgs2 (COX2), Cyp4a12 in Cyp2c44) [23, 24], smo ekstrahiraliledvicavzorcev. Med encimi Alox15 v 5/6 Nxledviceje imela znatno povišano raven mRNA (P=0.0004) v primerjavi s tisto pri lažniledvice(Slika 1). Nasprotno pa se ravni mRNA drugih glavnih encimov v tem modelu CKD niso bistveno spremenile.
Raven beljakovin Alox15 je bila povečana v proksimalnih tubularnih celicah ledvicV 5/6 Nxledvice, so bile povečane tudi ravni beljakovin ALOX15 (P=0.0078), kot je bilo pričakovano zaradi povečanih transkripcijskih ravni (slika 2a). Da bi ugotovili, kateri tipi celic so imeli povečano raven beljakovin Alox15 v CKDledvica,preučili smo lokalizacijo mRNA Alox15 s hibridizacijo in situ. Hibridizacija in situ z mRNA je pokazala, da je bila visoka stopnja izražanja Alox15 lokalizirana naledvičnatubularne celice v modelu 5/6 Nx, vendar ne v glomerulih (slika 2b). Histološke značilnosti kažejo, da je bila mRNA Alox15 močno izražena v proksimalnih tubulih.
Alox15-/- miši so bile odporne na poškodbe ledvic in fibrozo v modelu 5/6 NxV 5/6 Nx CKDledvice, sta bili ravni transkripcije in izražanja beljakovin ALOX15 povišani. Zato smo raziskali, ali in kako ima ALOX15 vlogo pri kronični ledvični bolezni v smisluledvicadisfunkcijo in ledvično fibrozo. V ta namen smo Alox15-/- miši uporabili za model 5/6 Nx CKD. Zanimivo je, da so bile ravni Cre v serumu in dušika sečnine v krvi (BUN) nižje pri miših Alox15−/− 5/6 Nx
kot pri miših divjega tipa (WT) (slika 3a), kar kaže, da je izčrpavanje Alox15 pokazalo zaščitni učinek pri patogenezi kronične ledvične bolezni. V skladu s tem NGAL (apoškodbe ledvicmarker) je bila ekspresija beljakovin zatrta pri miših Alox15-/- v primerjavi s tisto pri miših WT (slika 3b). Poleg tega miška Alox15−/−ledviceje pokazala zmanjšano raven Col1a1, Fn in Acta2 (SMA) mRNA (slika 3c) in tudi zmanjšano izražanje fibronektina in proteina SMA (slika 3d). Še več, miška Alox15−/−ledviceso pokazale jasno potlačene intersticijske fibrotične spremembe, prikazane v Massonovem trikromnem obarvanju (slika 3e). Zato se izbris Alox15 izboljšaledvicadisfunkcijo in fibrozo v živalskem modelu kronične ledvične bolezni.
Mediatorska lipidomika je razkrila spremenjen metabolizem PUFA v ledvicah Alox15−/− CKDKot je omenjeno v uvodnem delu tega dokumenta, so biološki učinki Alox15 povezani z lipidnimi mediatorji, ki jih ustvarja Alox15. Za pojasnitev profila presnovkov lipidov, ki jih proizvaja Alox15 v kronični ledvični bolezniledvica,smo pregledali in primerjali lažno in 5/6 Nxledvicavzorcev z mediatorsko lipidomiko na osnovi LC-MS/MS za določitev profilov lipidnega mediatorja med mišmi WT in mišmi Alox15-/- CKD (dodatna tabela 1). Tabela 1 prikazuje presnovke lipidov, ki so se znatno razlikovali med mišmi Alox15 plus / plus in Alox15−/− v pogojih 5/6 Nx. Poleg tega smo naredili zemljevide poti lipidnih mediatorjev z razvrstitvijo po njihovih substratih in njihovih presnovnih encimih (slika 4). Niz presnovkov PUFA, pridobljenih iz Alox15-, kot so 14-HDoHE, 17-HDoHE in 15-HEPA [5, 25–27], je bil znatno povečan v modelih CKD, ki so bili povezani tudi na povečano raven izražanja ALOX15 vledvice (P=0.0018, 0.0008,<0.0001, respectively),="" and="" their="" elevations="" under="" ckd="" conditions="" were="" completely="" suppressed="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 5).="" besides="" 14-hdohe,="" 17-hdohe,="" and="" 15-hepa,="" the="" levels="" of="" 18-hepa,="" 10-hdohe,="" 11-hdohe,="" 13-hdohe,="" 16-hdohe,="" and="" dgla="" were="" also="" significantly="" decreased="" in="" alox15−/−="" ckd="">ledvicev primerjavi s tistimi pri ledvicah s kronično ledvično boleznijo WT, medtem ko je bil le PGD2 pomembno povečan pri ledvicah s kronično ledvično boleznijo Alox15−/− (slika 6).
PGD2 je zaviral EMT v kultiviranih ledvičnih celicahUčinke presnovkov lipidov, ki so se znatno razlikovali med mišmi Alox15 plus / plus in Alox15−/− pod pogojem 5/6 Nx, so pregledali z dajanjem teh lipidov celicam NRK-52E, ki jih je aktiviral profibrotični citokin TGF - 1. Ocenili smo ekspresijo mRNA Cola1a in Acta2 (SMA) kot odziv na TGF- 1, da bi določili učinke teh lipidov v kulturi (slika 7a). Med temi je imel PGD2 močan antifibrotični učinek na celice NRK-52E kot odziv na TGF- 1. Supresivni učinek PGD2 na ekspresijo COL1A1 in SMA je bil odvisen od odmerka z EC50 7,12 μM oziroma 6,48 μM (slika 7b). Poleg tega smo izvedli iste poskuse v celicah HK-2, ki so ovekovečene epitelne celice proksimalnih tubulov normalnega odraslega človekaledvice,in našli podoben izid, to je inhibicijo COL1A1 in SMA na način, ki je odvisen od odmerka, kot odziv na zdravljenje s PGD2 (slika 7c). Zato so povečane ravni PGD2 pri Alox15−/− CKDledvicelahko prispeva k antifibrotičnim učinkom pri kronični ledvični bolezni.
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNE/LEDVIČNE BOLEČINE
15-PGDH, glavni encim za presnovo PGD2, je bil zmanjšan pri Alox15-/- ledvicah s kronično ledvično boleznijoZa pojasnitev mehanizma povečanja PGD2 vledvicemiši modela Alox15−/− CKD smo izmerili raven mRNA sintaze PGD2. PGD2 sintaza (PGDS) ima dve izoformi: lipokalin PGDS (L-PGDS) in hematopoetski PGDS (H-PGDS) [28]. Obe ravni L-PGDS in H-PGDS sta bili znatno povečani v pogojih 5/6 Nx v primerjavi s tistimi v lažnih pogojih vledvicemiši WT (sl. 8a, obe P<0.0001) indicating="" that="" increased="" pgd2="" in="" ckd="" is="" due="" to="" increased="" pgd2="" synthases.="" conversely,="" the="" increase="" in="" l-pgds="" and="" h-pgds="" under="" 5/6="" nx="" conditions="" was="" significantly="" inhibited="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 8a)="" indicating="" that="" the="" increase="" in="" pgd2="" in="" alox15−/−="" ckd="" model="" mice="" was="" not="" due="" to="" increased="" production="" by="" pgds.="" then,="" we="" examined="" mrna="" levels="" of="" cox-1="" and="" cox-2="" as="" more="" upstream="" synthases="" of="" the="" prostaglandin-producing="" pathway.="" we="" also="" measured="" mrna="" levels="" of="" 15-pgdh="" and="">1C18, za katere je znano, da so glavni encimi za presnovo PGD2- [29, 30]. Medtem ko so bile ravni mRNA COX-1, COX-2 in AKR1C18 nespremenjene, je bila raven mRNA 15-PGDH znatno znižana pri KLBledvicemiši Alox15−/− v primerjavi s tistimi miši WT (slika 8b, P=0.0325), kar potencialno vodi do povečanja PGD2 pri CKDledvicemiši Alox15−/−.
Diskusija
Ta študija je pokazala, da pri KLBledvicavzorcih so se zvišale tako transkripcijska kot beljakovinska raven Alox15 inledvicadisfunkcija in fibroza sta se izboljšali pri miših Alox15−/−. Poleg tega je mediatorska lipidomika na osnovi LC-MS/MS pokazala, da Alox15−/− miši s kronično ledvično boleznijoledviceimel znatno povečane ravni PGD 2 v primerjavi z mišmi WT. PGD2 je zaviral EMT celic NRK-52E in HK-2; zato lahko povečanje PGD2 prispeva k odpornosti miši Alox15−/− napoškodba ledvicin fibrozo. Razmerje medledvična bolezenin lipidni profili z uporabo lipidomike na človeškem serumu ali plazmi so bili obsežno raziskani [31–33], vendar ne naledvicatkivo. Podobno, čeprav je malo poročil o lipidomiki z uporabo živalskih modelov kronične ledvične bolezni [34–36], so vse te študije izvajale lipidomiko na vzorcih plazme živalskega modela kronične ledvične bolezni; vendar ni celovite lipidomike naledvicao tkivih iz modela CKD še niso poročali. Neposredna lipidomika na tkivu je prav tako učinkovita, kot tudi vzorci plazme, pri prepoznavanju funkcionalnih metabolitov. Poleg tega se presnovne spremembe v tkivih in vzorcih krvi med posameznimi organi precej razlikujejo [20]. V tej študiji smo temeljito analizirali profil lipidnih mediatorjev, pridobljenih iz PUFA, vledvicatkiva živalskega modela CKD.
Ta študija se je osredotočila na ALOX15, ki je eden glavnih encimov, ki presnavljajo PUFA. V tej študiji so bile ravni ekspresije beljakovin in mRNA ALOX15 jasno povečane pri KLBledvice. Obravnavali smo tipe celic, ki so odgovorne za izražanje ALOX15 pri CKDledvice,in s hibridizacijo in situ smo ugotovili povečano izražanje mRNA ALOX15 vledvičnatubularne celice v modelu 5/6 Nx.
ALOX15 je vpleten v kronične bolezni, kot je ateroskleroza, in njegovo brisanje v modelih živalskih bolezni izboljša te bolezni [5]. Glede povezave ALOX15 zledvična bolezen, je proteinurija zmanjšana pri miših Alox15-/- pri glomerularni poškodbi z modelom diabetične nefropatije, ki jo povzroča streptozotocin [37]. Vendar pa ta mišji model diabetes mellitus ne kaže nobenega upadadelovanje ledvic; torej mehanizem, kako je ALOX15 povezan z okvarodelovanje ledvicv modelih CKD je ostalo nejasno. V tej študiji smo z uporabo mišjega modela 5/6 Nx ugotovili, da se je izbris ALOX15 izboljšalledvicadisfunkcija inledvičnafibroza v modelu CKD. Do danes sta samo IL-4 in IL-13 v monocitih znana kot regulatorna dejavnika, ki neposredno povečata izražanje ALOX15 [5]. Vendar pa ostaja nejasno, kaj poveča ALOX15ledvičnatubularne celice. Znano je, da so številni citokini in uremični toksini povečani v plazmi in ledvicah pri CKD [38, 39]. Med njimi so morda novi regulatorji ALOX15. Potrebne so nadaljnje študije za pojasnitev glavnih regulativnih dejavnikov ALOX15 pri KLB. V naših študijah za identifikacijo specifičnih vmesnih oksilipinov, ki povezujejo delecijo Alox15 z njegovim renoprotektivnim učinkom v modelu 5/6 Nx, smo ugotovili, da je lahko PGD2 vpleten v odpornost protipoškodbe ledvicki jih povzroča izbris ALOX15. Kot splošno razumevanje, za ustvarjanje PGD2, COX-1 in
CCOX-2 proizvaja PGG2 iz arahidonske kisline, ki se nato pretvori v PGH2. Ko se PGH2 presnavlja s PGD2 sintazo (PGDS), nastane PGD2 [28]. PGDS ima dve genetsko različni izoformi, in sicer PGDS lipokalinskega tipa (L-PGDS) in PGDS hematopoetskega tipa (H-PGDS) [28]. Čeprav je bil PGD2 povečan pri miših Alox15-/- CKDledvice, niti L-PGDS niti H-PGDS nista bila povečana pri miših Alox15−/− CKDledvice, kljub velikemu povečanju PGDS pri miših WT CKDledvice(slika 8a). Poleg tega smo tudi razkrili, da niti COX-1 niti COX-2 nista bila povečana v Alox15−/− mišjih ledvicah CKD (slika 8b). Ti rezultati kažejo, da povečanje PGD 2 v ledvicah miši Alox15−/− CKD ni bilo posledica povečanja sintaz, ampak zaradi povečane razpoložljivosti substrata ali zaviranja razgradnje, in dejansko smo razkrili zmanjšanje {{ 7}}PGDH, eden od glavnih encimov za presnovo PGD2 [29], v Alox15-/- mišjih ledvicah CKD (slika 8b). Potrebne so nadaljnje preiskave, da se razjasni razlog, zakaj izbris Alox15 povzroči zmanjšanje 15-PGDH.
Kot je navedeno zgoraj, bi lahko PGD2 sodeloval pri odpornosti napoškodba ledviczaradi izgube ALOX15. V tej študiji je PGD2 zaviral EMT s TGF- 1 v celicah NRK-52E in HK-2, ki predstavljata proksimalne tubularne celice. PGD2 se veže na dva različna receptorja, vezana na protein G, in sicer na DP1 in DP2, katerih funkcije so različne [28]. Vendar pa je bil v naših poskusih in vitro PGD2 učinkovit pri koncentracijah v razponu od 4 do 32 μM, ki so relativno visoke, glede na to, da sta vrednosti Ki za DP1 in DP2 1,7 nM oziroma 2,4 nM [28]. Ta rezultat kaže, da lahko PGD2 izvaja antifibrotične učinke ne preko G protein sklopljenih receptorjev, ampak preko drugih poti, kot je PPAR, preko katerega je znano, da 15-d-PGJ2, spodnji metabolit PGD2, izvaja svoje učinke [28]. V tej študiji, ki se osredotoča na presnovne encime lipidov in njihove presnovke, bi lahko bila inhibicija ALOX15 in/ali dajanje PGD2 obetavna terapevtska tarča za CKD. Na žalost ni bil razvit noben specifični zaviralec ALOX15, ki bi se lahko uporabljal v klinični praksi [40, 41]. Terapevtsko ciljanje na spodnje funkcionalne presnovke, kot je PGD2, namesto zaviranja encimov za presnovo maščobnih kislin, ki vplivajo na različne presnovke, bi lahko bila nova idealna terapija za KLB.
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO DIALIZO
