Dereplication-Vodena izolacija novih Fenilpropanoid-Substituted Diglycosides Iz Cistanche Salsa in njihovo zaviralno dejavnost na NO Proizvodnja v makrofazi

Prosimo, kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več

Abstrakten:

Dereplikacijo omogoča hitro prepoznavanje znanih in neznanih spojin v rastlinskih izvlečki. V tej študiji smo izvedli tekoče kromatografijo-masno spektroskopijo (LC-MS) na osnovi dereplikacije z uporabo podatkov iz ESI+ QTOF-MS za analizofenilpropanoidi nadomestki glikozidi, glavnih aktivnih sestavin cistanche salsa (C. A. Mey.) Beck. Samo z uporabo TOF-MS bi se lahko podstrukture teh spojin nedvomno potrdile na podlagi značilnih vzorcev razdrobljenosti različnih proizvodov. Profiliranje C. salse, ki temelji na HPLC-MS, je omogočilo tudi odkrivanje novihfenilpropanoid-nadomestekglikozidov izto rastlino. Od njih je pet novih fenilpropanoidovdiglikozidov, imenovani cistansalsides A–E (5, 6, 12, 17 in 18),so bili izolirani. Njihove strukture so bile elucidirane s spektroskopnimi metodami, vključno z NMRand MS analizo. Vsi izolati so bili testirani na inhibicijo proti no proizvodnji inRAW 264,7 celic, ki jih je spodbudil LPS. Od preizkušenih spojin so spojine 5, 11, 13 in 18 pokazale zmerno inhibitorno aktivnost na inducibilni NO sintaze. Spojine 11, 13 in 18 so zavirale tudi fosforilacijo NF-κB v makrofagih. Nobena od spojin ni bilaCitotoksičnost.

Ključne besede:odstopanje; fenilpropanoidom nadomestek diglkozidov; Cistanche salsa; protivnetna

Kliknite tukaj, če želite vedeti več

Uvod

Cistanche salsa (C. A. Mey.) Beck, ki spada v družino Orobanchaceae, je parazitska rastlina, ki svojo prehrano pridobiva iz korenin haloksilonske ammodendrone (Chenopodiaceae) in drugih puščavskih rastlin [1]. Ta rastlina se uporablja v tradicionalni medicini za zdravljenje nevrastenijo, spolno disfunkcijo in pomanjkanje ledvic [2,3]. V prejšnjih fitokemičnih študijah so poročali, da je cela rastlina C. salsa vsebovala različne vrste spojin, vključno s fenilethanoidnimi glikozidi in iridoidnimi glikozidi [4–7]. Fenilethanoidni glikozidi, kot sta akteozid in ehinakozid, so glavne aktivne sestavine rastline [8]. Izvlečki C. salse so pokazali koristne lastnosti, vključno z imunomodulatornimi, antikancerogenimi in protivnetnimi dejavnostmi [9,10]. Dereplikacija je postopek, s katerim bi se vzorčne zmesi testirale za razlikovanje neznanih sestavin iz znanih spojin. Strategije dereplikacije temeljijo na analitičnih tehnikah in iskanju podatkovnih baz za identifikacijo sekundarnih metabolitov v začetku fitokemičnega raziskovalnega procesa [11]. Od analitičnih tehnik bi lahko ESI-QTOF-MS (elektrospraj ionizacija-štiripolni čas spektroskopije let-masa) zagotovil dragocene informacije o kemijskih strukturah sekundarnih presnovkov. Dokazano je bilo, da je frakcija, ki temelji na dereplikaciji na osnovi LC-MS, omogočila ekstrakcijo in očiščevanje ciljnih presnovkov iz surovih ekstraktov rastlin z visoko učinkovitostjo [12–15]. Ta študija je izvedla dereplikacijo, ki temelji na LC-MS, z uporabo podatkov esi+ TOF-MS za analizo diglkozidov, ki so jih nadomestili fenilpropanoidi, glavnih aktivnih sestavin C. salse. Podatki TOF-MS lahko kažejo na podstrukture teh spojin, ki temeljijo na značilnih vzorcih razdrobljenosti različnih ionov proizvodov. Na podlagi tega odstopanja so analizirali LC-MS profile frakcije etil acetata (EtOAc) in frakcije, topne v vodi. Delež EtOAc je bil predmet strategije za nadaljnje ločevanje, ki je povzročila izolacijo fifiv novih diglikozidov, ki so jih nadomestili fenilpropanoidi, in 13 znanih spojin (slika 1). Potrjeno je bilo, da so bile vnaprej predvidene strukture fenilpropanoidov nadomestljivih digikozidov pravilno ujemane z njihovimi realnimi strukturami. Poleg tega so raziskali protivnetne aktivnosti izolatov.

Rezultati in razprava

Fenilpropanoidi, ki jih nadomeščajo diglkozidi, izolirani iz C. salse, imajo običajno strukture, ki temeljijo na disaharidnih glikozidih, Sastoje se od glukoze i rhamnose sa Rha (1→3) Glc linkažom i enim cinamoil substituentom, na primer kuparna kislina (Cou), kofeinska kislina (Caf) i feruloinska kislina (Fer), na C-4 ali C-6 položaju glukoze. Aglikon je običajno pritrjen na C-1 položaj glukoze. Pogosto so poročali o strukturah fenilpropanoidnih digikozidov z acetilno skupino na C-2 glukoze [6,12,16].  Za izvedbo odstopanja so vzorce razdrobljenosti MS teh spojin analizirali s pozitivnim načinom ESI-QTOF-MS. V spektrih MS so vsi diglkozidi, ki so jih nadomestili fenilpropanoidi, proizvajali ione adduct vrhove pri [M + NH4]+, [M + K]+ in [M + Na]+, ki so zagotavljali molekulsko težo in formulo. Vzorec fragmentnih ionov lahko najdemo z zaporedno izgubo ostankov aglikona in glikozidov ([M + H − Aglycone]+, [M + H − Aglycone − Rha]+ in [M + H − Aglycone – slika 1. Strukture spojin 1–18. 2. Rezultati in razprava Fenilpropanoidi, ki jih nadomeščajo diglikozidi, izolirani iz C. salse, imajo običajno strukture, ki temeljijo na disaharidnih glikozidih, Sastoje se od glukoze i rhamnose sa Rha (1→3) Glc linkažom i enim cinamoil substituentom, na primer kuparna kislina (Cou), kofeinska kislina (Caf) i feruloinska kislina (Fer), na C-4 ali C-6 položaju glukoze. Aglikon je običajno pritrjen na C-1 položaj glukoze. Pogosto so poročali o strukturah fenilpropanoidnih digikozidov z acetilno skupino na C-2 glukoze [6,12,16]. Za izvedbo odstopanja so vzorce razdrobljenosti MS teh spojin analizirali s pozitivnim načinom ESI-QTOF-MS. V spektrih MS so vsi diglkozidi, ki so jih nadomestili fenilpropanoidi, proizvedli adduct ion vrhove na [M + NH4]+ , [M + K]+ in [M + Na]+ , ki so zagotavljali molekulsko težo in formulo. Vzorec fragmentnih ionov je mogoče najti z zaporedno izgubo ostankov aglikona in glikozida ([M + H − Aglycone]+ , [M + H − Aglycone − Rha ]+ i [M + H − Aglycone – Rha − Glc (ali Acetyl-Glc)]+ ), ki su bili koristni za predvideti tip cinnamoil substituenta i segara. Delci ionov v m/z 163 skupine kofeina, m/z 147 iz skupine coumaroyl ali m/z 177 feruloil skupine dajejo značilen signal cinamoilnega nadomestka v fenilpropanoidnih diglikazidih [4,15] (slika 2). Analiza ionov fragmentov bi zagotovila koristne informacije za identifikacijo struktur fenilpropanoidnih nadomestkov diglkozidov. Vendar pa njihovih izomerjev ni bilo mogoče ovlečiti samo s spektrometrijo MS. Za natančno identifikacijo njihovih popolnih struktur je potrebna NMR spektra.

Vsi izolati so bili testirani na inhibitorne učinke na proizvodnjo NO, ki jo povzroči LPS, v celicah RAW 264,7. Deksametazon je bil uporabljen kot pozitiven nadzor in njegov IC50 je bil 7,0 μM. Od preizkušenih spojin, spojin 5 (IC50 42,7 ± 6,6 μM), 11 (IC50 37,3 ± 2,2 μM), 13 (IC 50 40,0 ± 4,0 μM) i 18 (IC50 27,9 ± 0,8 μM) pokazali zmerne inhibitorne aktivnosti na inducibilnu NO sintazu, A ostale spojine bile neaktivne u >(IC50). Za preverjanje, ali so te spojine imele citotoksičnost, je bila izmerjena sposobnost preživetja celic pri uporabi MTT. Zaradi tega nobena od njih ni prikazala pomembne citotoksičnosti (dodatna slika S6-1). Te štiri spojine so bile izbrane za oceno njihove zaviralne aktivnosti proti NF-κB poti v celicah, stimuliranih z LPS, 264,7 RAW. Stimulacija celic RAW 264,7 z LPS je po 0,5 h inkubacije spodbudila fosforilacijo IκBα in NF-κB (p65). Fosforilacija NF-κB (p65) se je znatno zmanjšala s prednahodom s spoji 11, 13 in 18, kot je prikazano z analizo zahodnega blota (slika 5). Zato lahko spojine 11, 13 in 18 vplivajo na protivnetne učinke prek zaviranja NF-κB v makrofagih.

Materiali in metode

Optične rotacije so merili z digitalnim polarimetrom Jasco P-2000 (Jasco, Tokio, Japonska). UV spektri so bili posneti na Chirascan plus Circular Dichroism spektrometer (Chirascan, APL, UK). IR spektri so bili posneti z uporabo Jasco FT/IR-4200 spektrometra. Ionizacija elektrospraj ionizacije z visoko ločljivostjo quadrupole-time-of-flight masna spektrometrija (HR-ESI-qTOF-MS) je bila izvedena na Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS, opremljenem z Agilent 1260 Infinity serijo(Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA, USA),a kolona je bila Jasco SFCpak Crest C18T-5 kolona (i.d.150 ×4,6 mm,5 um). MassHunter Workstation Software je bila uporabljena za pridobivanje podatkov.

1D (H in 13C) in 2D("H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR spektri stekli sa Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japan), Bruker AVANCE-400,Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 i Bruker AVANCE 800 HDspectrometers u paru sa cryoprobe (Bruker, Ettlingen, Germany). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA, USA) je bil uporabljen kot NMR topilo in referenčne vrhove(6H 2,50 in δc 39,5). Kolona kromatografija (CC) je bila izvedena z uporabo Sephadex LH-20(25-100 um; Farmacia, Uppsala, Švedska) ali Kieselgel 60 silikagel(40-63 um,230-400 mrez, art. 9385; Merck, Darmstadt, Nemčija). Tankoslojna kromatografija (TLC) je bila izvedena na predhodno obloženih ploščah Kieselgel 60 silikagel F254 (člen 5715; Merck). Točke na TLC so zaznane z uporabo UVlampa pri 254 nm in 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Francija). Srednjetlačna tekoča kromatografija (MPLC)je bila izvedena na rediSep 120g silika bliskavice (lsco, Lincoln, NE, ZDA)in Kiesegel 60 silika gel (40-63 um,230-400 očesa, art.9385; Merck)z uporabo combiflash spremljevalca (Isco). Visokotlačni tekoči kromatografski sistem (HPLC) je bil Gilson HPLC, opremljen s črpalko Gilson 321 in UV. VIS 151 detektor (Gilson, Middleton, WI, ZDA), z uporabo polpreprevednih ods stolpcev(Luna 5 um C18 (2) 100 Å, i.d. 250×10 mm, 5 μm, Phenomenex Inc, Torrance, CA, ZDA; Hypersil GOLDrM aQ 175A,i.d.250×10mm,5 um, Thermo ScientificTM, Hennigsdorf,Germany;Inno C18column 120 A,i.d.250× 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Koreja). Analitični sistem RP-HPLC je bil sistem zavezništva Waters 2695 z detektorjem Fotodiode Array (PDA) 996 (Waters Corp, Milford, MA, USA),a kolona je bila HypersilTM BDS C18column (130 A,i.d.150×4,6 mm, 5 μm, Thermo ScientificTM). Formic kislina je bila kupljena pri Daejung Chemicals & Metals Co, Ltd.(Seul, Koreja). HpLC razredna topila so bila kupljena pri Fisher Scientific Korea Ltd.(Seul, Koreja). HSOA, Na,CO in topila prvega razreda za ekstrakcijo, frakcijo in izoliranje so kupili pri Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seul, Koreja). L- in D-cistein metil ester klorid in o-tolisotiociokanat sta bila kupljena v tokio kemijski industriji (Tokio, Japonska).

Sklepi

V tej študiji smo poleg izolacije in identifikacije 13 znanih spojin, z uporabo strategije deeplicije, izolirajo in izolirajo strukture petih novih diglikozidov, ki jih nadomešča fenilpropanoid, imenovanih cistansalside A-E(5,6, 12, 17 in 18). Ugotovljeno je bilo, da so znane spojine lipedozid A-I(1)[21], 2'-acetilakteozid (2)[22], izocistanozid C(3)[15], osmanthuside B (4)[21], epimeridinozid A(7)[15], cistanozid D(8)[23], Salsaside B(9) [6l, tubulozid E (10)[16]cistanozid M(11)[15],izomartinozid(1 3) [24], salsaside C(14)[6], jionoside C(15)[25] in salsaside F (16)[6]. Njihove strukture so bile vzpostavljene z analizo obsežnih spektroskopskih podatkov in v primerjavi z prijavljenimi podatki v literaturi. Potrjeno je bilo, da so bile vnaprej predvidene strukture fenilpropanoidov nadomestljivih digikozidov pravilno ujemane z njihovimi realnimi strukturami.

Pri zaviralnem pregledu NO so spojine 5 (IC50 42,7±6,6 μM), 11(IC50 37,3±2,2 čμM),13 (IC50 40,0 ±4,0 μM) i 18(ICs0 27,9±0,8uM pokazale zmerne inhibitivne aktivnosti. Od teh spojin je bilo odkrito, da spojine 11,13 in 18 zavirajo fosforilacijo NF-kB v makrofagih in bi tako lahko izvajale protivnetno dejavnost, ki jo bo treba dokazovati v nadaljnjih poskusih.

Izvleček iz: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ("Licenca"). Ne glede na ProQuest pogoje uporabe te vsebine lahko uporabljate v skladu s pogoji licence.