Odkrivanje in karakterizacija mineralno-organskih nanodelcev v človeških ledvicah

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

Zunajmaternična kalcifikacija je povezana z različnimi človeškimi boleznimi, vključno z aterosklerozo, rakom,kroničnoledvicabolezen, indiabetesmellitus. Čeprav so mineralne nanodelce odkrili v poapnelih krvnih žilah, narava in vloga teh delcev v človeškem telesu ostajata nejasni. Tukaj prvič pokažemo, da človekledvicatkiva, pridobljena iz končne fazekroničnoledvicabolezenali bolniki z ledvičnim rakom vsebujejo okrogle, večlamelarne mineralne delce velikosti od 50 do 1500 nm, medtem ko pri zdravih kontrolnih osebah delcev ni opaziti. Mineralne delce najdemo predvsem v zunajceličnem matriksu, ki obdaja zavite tubule, zbiralne kanale in Henlejeve zanke ter v citoplazmi celic, ki razmejujejo tubule, in so sestavljeni iz polikristalnega kalcijevega fosfata, podobnega mineralu, ki ga najdemo v kosteh in zunajmaterničnih kalcifikacijah. Theledvicamineralni nanodelci vsebujejo več serumskih beljakovin, ki zavirajo ektopično kalcifikacijo v telesnih tekočinah, vključno z albuminom, fetuinom-A in apolipoproteinom A1. Ker mineralno-organske nanodelce ne najdemo samo v poapnelih usedlinah, temveč tudi na območjih brez mikroskopskih poapnenj, naša opažanja kažejo, da lahko nanodelci predstavljajo predhodnike poapnenja in ledvičnih kamnov pri ljudeh.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zunajmaternična kalcifikacija je povezana z aterosklerozo, rakom,kroničnoledvicabolezenin diabetes mellitus 1–3. Nedavne študije kažejo, da ateroskleroza inkroničnoledvicabolezenbolniki z znaki vaskularne kalcifikacije kažejo povečano tveganje obolevnosti in umrljivosti, kar kaže na to, da zunajmaternična kalcifikacija škoduje zdravju ljudi1,3. Neželeno kalcifikacijo opazimo tudi pri starajočih se posameznikih in večina ljudi, starejših od 60 let, kaže znake vaskularne kalcifikacije4. Zaradi teh razlogov sta dešifriranje dejavnikov, ki povzročajo zunajmaternično kalcifikacijo, in razvoj učinkovitega zdravljenja pomembna cilja.

Ektopično kalcifikacijo lahko opredelimo kot neravnovesje med zaviralci in induktorji kalcifikacije v telesu. Zaviralci kalcifikacije vključujejo serumske beljakovine, kot so albumin, fetuin-A, osteopontin in matrični protein GLA, kot tudi majhne spojine, kot je pirofosfat, medtem ko hiperfosfatemija in vnetje predstavljata glavne induktorje kalcifikacije 5–7. Nedavne študije kažejo, da induktorji kalcifikacije aktivirajo celični proces, podoben tvorbi kosti med vaskularno kalcifikacijo 7,8. V poapnelih mehkih tkivih so odkrili tudi matrične vezikule, podobne tistim, ki inducirajo mineralizacijo v razvijajočih se kosteh7–9. Te matrične vezikle verjetno sproščajo vaskularne gladke mišične celice, ki se diferencirajo v osteoblastom podobne celice, ki inducirajo kalcifikacijo7.

Mineralni nanodelci (NP) so bili odkriti v mehkih tkivih, ki kažejo znake ektopične kalcifikacije. Price et al. ugotovili, da serum podgan, zdravljenih bodisi z bisfosfonat etidronatom bodisi z vitaminom D, vsebuje mineralno-proteinske komplekse, ki vsebujejo zaviralce kalcifikacije fetuin-A in matrični protein GLA10,11. Podobno Jahnen-Dechent et al. opazili, da je mineralne komplekse, ki vsebujejo fetuin-A, imenovane kalciproteinski delci (CPP), mogoče odkriti v ascitični tekočini bolnikov s kalcificirajočim peritonitisom12. Nedavna študija Bertazza et al. je dokazal prisotnost mineralnih NP v aortnih zaklopkah in koronarnih arterijah tako pri bolnikih z aterosklerotično kot revmatično vročino13. Medtem ko so se študije o tvorbi mineralnih delcev običajno osredotočale na človeški srčno-žilni sistem, ostaja nejasno, ali se delci lahko nahajajo v drugih tkivih in ali imajo te entitete vlogo pri zdravju ali bolezni.

Prej smo opazili, da mineralno-organski NPS spontano nastajajo v človeških in živalskih telesnih tekočinah 14–28. Te mineralne NP so bile sprva opisane kot nanobakterije (NB) in so verjeli, da niso le najmanjše celice na zemlji29, ampak tudi možen prenosljiv povzročitelj številnih bolezni, vključno z Alzheimerjevo boleznijo, aterosklerozo, rakom,ledvicakamentvorba, policističnaledvicabolezenin prostatitis30–32. Vendar pa so naši rezultati pokazali, da je NB v resnici neživ mineralni NP, ki posnema običajne bakterije v smislu njihove morfologije, rasti, širjenja in subkulture 15, 18, 22. Možnost, da se v človeških tkivih nahajajo mineralni delci, podobni tako imenovanemu NB, in ali imajo ti delci vlogo pri bolezni, je treba še preučiti.

V tej študiji smo razvili nanomaterialni pristop za odkrivanje in analizo mineralno-organskih NP pri obolelem človekuledvicatkiva. Pokazali smo, da ledvična tkiva bolnikov s končno kronično ledvično boleznijo in ledvičnim rakom vsebujejo večlamelarne mineralne NP, podobne biomimetičnim mineralnim delcem, ki se spontano obarjajo v telesnih tekočinah in vitro. Naši rezultati razkrivajo kritične vpoglede v biokemično sestavo, mehanizem nastanka in biološko funkcijo teh mineralov-organskih delcev ter osvetljujejo mehanizme ektopične kalcifikacije in začetka bolezni v človeškem telesu.

Rezultati

Pregledali smo ledvična tkiva, kirurško odstranjena pri človeških bolnikih s končno kronično ledvično boleznijo (n=2) ali ledvičnim rakom (n=18; glejte tabelo 1; za vzorce ledvičnega raka smo se osredotočili na ne -rakavi del tkiva). Kot zdrave kontrole smo preučevali biopsije ledvic, pridobljene pri bolnikih s travmo ali hematomom, ki pa pred tem niso imeli nenormalnega delovanja ledvic (n=2; tabela 1).

Tkiva ledvic zdravih posameznikov so pokazala normalne histološke značilnosti in po barvanju po von Kossi niso opazili ektopične kalcifikacije (sl. 1A, B). Po drugi strani so tkiva ledvic, pridobljena od obolelih posameznikov in obarvana s hematoksilinom in eozinom (H&E), pokazala znake poškodbe tkiva (sl. 2A–C, označeno s puščicami), 80 odstotkov pregledanih obolelih tkiv pa je pokazalo mineralizirane usedline, kot je bilo razkrito z barvanjem von Kossa (sl. 1C–T, sl. 2E, F, kalcifikacija je vidna kot črn material, označen s črnimi puščicami; glejte tudi tabelo 1). Kalcificirane usedline so opazili v skorji in meduli, vključno z zunajceličnim prostorom, ki obdaja distalne zavite tubule, proksimalne zavite tubule, zbiralne kanale in Henlejeve zanke ter citoplazmo celic, ki razmejujejo tubule in kanale (sl. 1C–T in sl. 2E, F). V ledvičnem telescu niso odkrili kalcifikacije (slika 2D).

Da bi preučili naravo mineralnih oborin, smo pripravili ultra-tanke odseke ledvic za opazovanje s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM). V vzorcih, ki vsebujejo mikroskopske usedline mineralov, so mineralne delce ali zrnca odkrili v citoplazmi ledvičnih epitelijskih celic, v zunajceličnem matriksu pod bazalno membrano in v lumnu proksimalnih in distalnih zavitih tubulov (sl. 3A, B, delci so povečani na ploščah A1–A4 in B1–B4). Mineralne NP so opazili tudi v celicah, ki obdajajo zanke Henleja in zbiralne kanale (sl. 3C, D, povečano na ploščah C1, C2 in D1). Nekatere delce so našli znotraj znotrajceličnih veziklov v ledvičnih celicah (slika 3A, plošči A1 in A2). Pristop elektronske mikroskopije, uporabljen tukaj, nam je omogočil tudi vizualizacijo notranjosti mineralnih delcev; nekateri delci so vsebovali obroče z elektronsko gostoto, ki so se izmenjevali s svetlimi, elektronsko svetlečimi plastmi (slika 3A, plošči A3 in A4, slika 3C, plošča C1). Več krvnih žil, kot so vasa recta rents (ravne arterije ledvic), smo obdani z velikim številom mineralnih NP (slika 3D, plošča D1). Mineralne NP so bile tako najdene na različnih lokacijah v vseh človeških ledvičnih tkivih, ki kažejo znake ektopične kalcifikacije, medtem ko v pregledanih zdravih kontrolah niso našli delcev.

Zdi se, da so mineralni delci, najdeni v ledvičnih tkivih, zelo podobni mineralo-organskim NP, opisanim v naših prejšnjih študijah, ki se spontano tvorijo v telesnih tekočinah 15, 17 (in smo jih poimenovali bioni 24). Da bi preverili to možnost, smo pripravili mineralne organske NP (ali bione) z metodo obarjanja, kot smo prej opisali15. Ta metoda je sestavljena iz dodajanja obarjajočih ionov, kot sta kalcij in fosfat, v gojišče celične kulture (Dulbeccov spremenjeni Eagleov medij ali DMEM), ki vsebuje telesno tekočino, kot je človeški serum (HS), čemur sledi inkubacija v pogojih celične kulture (glejte Metode). Delci, proizvedeni na ta način (HS-NPS), so bili sferični ali elipsoidni in so pokazali gladko ali kristalno mineralno površino (sl. 4A–E), podobno prej opisanim delcem v telesnih tekočinah 22, 23 kot tudi v človeških ascitesih 12 in poapnele arterije13. Mineralni delci so bili zelo podobni mineralnim NP ali zrncem, ki so jih opazili v tkivih ledvic, glede na njihovo splošno morfologijo, večplastno strukturo in značilnosti površine (sl. 4F–J). Velikost delcev, pridobljenih iz HS, in ledvičnih granul je bila prav tako primerljiva in se je gibala od 50 do 1500 nm v premeru (sl. 4A–E, F–J). Kot je navedeno zgoraj, so bila nekatera ledvična zrnca obdana z lipidno membrano, ki je verjetno predstavljala intracelularne tovorne vezikle ali zunajcelične membranske vezikle (sl. 4H, I, membrane so označene s puščicami); takšne membranske strukture niso bile v vzorcih HS-NP, pripravljenih in vitro (sl. 4A–E). Ta opažanja kažejo, da so ledvična zrnca podobna mineralo-organskim NP, sestavljenim v serumu.

Z analizo izbrane površinske elektronske difrakcije smo opazili, da je mineralna faza HS-NP, pripravljenih in vitro, sestavljena iz polikristalnega nanomateriala (slika 4E, vložek; opazite šibke koncentrične obroče). Podobni rezultati so bili pridobljeni za ledvične granule (slika 4J, vstavek) ter za kosti in ektopične kalcifikacije, kot je opisano v prejšnjih študijah 33,35.

Kemično sestavo HS-NP in ledvičnih granul smo preučevali z energijsko disperzijsko rentgensko spektroskopijo (EDX). HS-NP so pokazali velike vrhove ogljika (C), kalcija (Ca), kisika (O) in fosforja (P) (slika 4K), kar je skladno s prisotnostjo minerala kalcijevega fosfata. Nizek vrh silicija (Si) je bil opažen tudi v HS-NP (slika 4K), ki verjetno predstavlja manjšo sestavino delcev. Ledvična zrnca so pokazala tudi vrhove ogljika, kalcija, kisika in fosforja, kar kaže na mineral kalcijev fosfat, skupaj z dodatnimi vrhovi silicija in železa (Fe) (slika 4L). Vrhovi urana (U) so bili pripisani uranil acetatu, ki je bil uporabljen kot kontrastni reagent med pripravo vzorca (prisotnost urana v nekaterih vzorcih mineralnih delcev, kot so zrnca ledvic, in njegovo odsotnost v kontrolnem tkivu na sliki 4M je mogoče pripisati visoki afiniteto urana za fosfat, kot je bilo že navedeno35). Kontrolni EDX spektri ledvičnega tkiva, ki obdaja delce, so pokazali vrhove ogljika in kisika (slika 4M), kar kaže, da sta kalcij in fosfor najdena predvsem v mineralnih delcih.

Razmerja kalcija in fosforja (Ca:P) v HS-NP in ledvičnih zrncih so se spreminjala od 0.65 do 1.18. Ta razmerja se razlikujejo od teoretične vrednosti 1,67, ugotovljene za stehiometrični hidroksiapatit, vendar so še vedno znotraj območja, opaženega prej za kristale kalcijevega fosfata in apatita, opažene pri različnih stopnjah kristalizacije15. Te ugotovitve skupaj potrjujejo, da so ledvične granule sestavljene iz NP kalcijevega fosfata.

Ugotovljeno je bilo, da različne beljakovine sistemsko zavirajo ektopično kalcifikacijo v telesu36,37. Poleg tega naj bi beljakovinska korona, ki jo najdemo na površini sintetičnih NP, določala biodistribucijo in učinke delcev na celice in vivo 38,39. Po drugi strani ostaja beljakovinska sestava mineralo-organskih NP, ki jih najdemo v tkivih človeških ledvic, nepopolno razumljena. Prej smo ugotovili, da albumin, fetuin-A in apolipoprotein-A1 (apo-A1) predstavljajo glavne proteine, ki medsebojno delujejo z mineralo-organskimi NP, ki nastanejo v telesnih tekočinah 17, 20. Tu smo uporabili označevanje imunskega zlata, da bi preučili prisotnost in ultrastrukturno lokacijo teh proteinov v ledvičnih granulah.

Uporabili smo poliklonska protitelesa proti humanemu serumskemu albuminu (HSA), humanemu serumskemu fetuinu-A (HSF), humanemu apo-1A in celemu HS, da bi preverili prisotnost serumskih beljakovin v HS-NP in ledvičnih zrncih. Specifičnost poliklonskih protiteles (pripravljenih, kot je opisano prej25) je bila preverjena z uporabo Western blottinga (slika 5). Vsako od poliklonskih protiteles je pozitivno reagiralo s HS-NP, pripravljenimi in vitro, kot tudi z mineralnimi zrnci, najdenimi v tkivih človeških ledvic (sl. 6A, B, plošče A1–A3 in B1–B3; črne pike). Protitelesa so reagirala predvsem s plastmi z elektronsko gostoto ali temnim jedrom HS-NP in ledvičnih granul (sl. 6A, B), kar kaže, da lahko ta temna področja vsebujejo višje ravni beljakovin v primerjavi z elektronsko svetlečimi območji. Negativne kontrole, izvedene brez primarnega protitelesa, niso povzročile nobene reakcije (sl. 6A, B, plošči A4 in B4, kontrola). Ugotovili smo, da ledvična zrnca predstavljajo mineralo-organske NP, podobne HS-NP, ne samo na podlagi njihove morfologije in mineralne sestave, ampak tudi na njihovi vezavi na glavne zaviralce kalcifikacije, prisotne v serumu.

Nato je bila uporabljena imunofluorescenčna mikroskopija za potrditev prisotnosti mineralnih zrnc, ki vsebujejo HSA in HSF, v obolelih človeških ledvicah. S to tehniko so pokazala tkiva človeških ledvic

pozitivno obarvanje za oba proteina na različnih področjih, vključno z intersticijem, ki obdaja ledvične tubule, kot tudi citoplazmo celic, ki razmejujejo tubule (slika 7A, plošči A1 in A2). Na teh območjih so opazili tudi beljakovinske agregate, ki vsebujejo albumin in fetuin-A, čeprav v nižjih količinah v primerjavi z obarvanjem posameznih proteinov (slika 7A in plošča A3, združeno obarvanje v rumeni barvi). Predvsem smo opazili, da se obarvanje beljakovin, odkrito z imunofluorescenco, tesno prekriva z vzorcem ektopične kalcifikacije, opažene z barvanjem von Kossa (sl. 7A, B, kalcifikacija je vidna kot črn material, označen s puščicami v B). Ti rezultati dodatno podpirajo prisotnost mineralo-organskih delcev v pregledanih tkivih človeških ledvic.

Diskusija

Medtem ko je bil dosežen napredek v našem razumevanju interakcij med sintetičnimi NP in človeškimi celicami, vemo precej manj o učinkih mineralo-organskih NP, ki se spontano tvorijo v telesnih tekočinah. Naše prejšnje študije so pokazale, da se ti delci tvorijo v bioloških tekočinah, ko koncentracije kalcija in fosfata presežejo nasičenost15,16. Opazili smo tudi, da te delce internalizirajo imunske celice, vendar le veliki delci inducirajo vnetne imunske reakcije23. Vendar pa porazdelitev teh delcev v človeških tkivih in ali imajo v telesu kakršne koli fiziološke ali patološke vloge, doslej še niso raziskali.

V tej študiji smo prvič odkrili mineralo-organske NP v ledvicah človeških bolnikov, ki trpijo bodisi za končno ledvično boleznijo bodisi za rakom ledvic. Odkriti mineralo-organski NP-ji vsebujejo slabo kristaliziran kalcijev fosfat, podoben kostnemu mineralu, pa tudi albumin, fetuin-A in apo-A1, ki delujejo kot sistemski zaviralci kalcifikacije v telesnih tekočinah. Naši rezultati se ujemajo s prejšnjimi poročili, ki so opisovala prisotnost mineralno-proteinskih kompleksov v žilnih tkivih in telesnih tekočinah12,13,34,40. Ker so bili delci, ki smo jih opazili, najdeni na območjih brez mikroskopskih kalcifikacij, naša opažanja kažejo, da lahko delci predstavljajo predhodnike zunajmaternične kalcifikacije v človeških tkivih. Glede na možnost, da lahko mineralo-organske NP-ji postopoma rastejo v velikosti in se podvržejo pretvorbi delcev v film pod ugodnimi pogoji, kot je opisano v naših prejšnjih študijah 15, 18, tukaj predstavljena opažanja kažejo, da lahko mineralni prekurzorji povzročijo nastanek večjih mineralne usedline in vivo, kot so Randallova plošča in ledvični kamni.

Naša opažanja, da mineralne ektopične kalcifikacije in mineralo-organske NP najdemo v različnih anatomskih strukturah ledvic, so skladna s prejšnjimi ugotovitvami ektopičnih kalcifikacijah v tem organu41. Opazovanja Evana in drugih so pokazala, da se lahko mineralizacija v ledvicah bolnikov z nefrolitiazo začne in pojavi predvsem v intersticijskem tkivu Henlejevih zank40,42. Ti avtorji so opazili, da lahko mineralne usedline, ki se tvorijo na tem območju, štrlijo iz bazalne strani urotelija in povzročijo nastanek ledvičnih kamnov. Naša opažanja kažejo, da lahko poleg Henlejevih zank druga področja ledvic vsebujejo mineralne NP, ki se lahko sčasoma razvijejo v velike mineralne usedline v človeških ledvicah. Raziskujemo tudi možnost, da se mineralni NP, ki nastanejo v krvnem obtoku, lahko premestijo v ledvična tkiva in povzročijo ektopično kalcifikacijo in tvorbo kamnov v ledvicah.

Več ledvičnih zrnc, odkritih v tej študiji, najdemo v intracelularnih ali zunajceličnih mehurčkih (slika 4H, I) in so podobni matričnim mehurčkom, za katere je dokazano, da inducirajo kalcifikacijo v kosteh in zobeh7,8. Nedavno smo opazili, da vezikli, izolirani iz človeškega in živalskega seruma, inducirajo tvorbo mineralnih NP in mikroskopskih oborin in vitro25. Schlieper et al.34 so tudi opazili, da so mineralni delci, najdeni v arterijah, povezani z membranskimi strukturami, in predlagali, da lahko matrični vezikli ali apoptotična telesa predstavljajo nukleatorje mineralnih delcev v teh tkivih. Podobno Khan et al. poročali, da so usedline kalcijevega fosfata, najdene v ledvicah bolnikov z idiopatskimi ledvičnimi kamni, povezane s kolagenskimi vlakni in matričnimi vezikli9. Ti rezultati kažejo, da lahko mineralo-organske NP, odkrite v ledvičnih tkivih, nastanejo prek mehanizma, ki vključuje membranske vezikle, kar je podobno položaju, kot ga vidimo pri aterosklerotičnih arterijah7,8. Po drugi strani pa je nedavna študija pokazala, da ektopična kalcifikacija, ki jo najdemo pri ženskih prsnih arterijah, ni bila povezana z markerji osteogenih ali apoptotičnih celic43, kar kaže, da je mehanizem kalcifikacije lahko specifičen za vpleten organ ali biološki kontekst. Poleg tega se lahko mineralo-organski NP, kot so tukaj opisani v tkivih človeških ledvic, tvorijo tudi zaradi nezmožnosti vzdrževanja fizioloških koncentracij ionov (npr. kalcija in fosfata) in zaviralcev kalcifikacije (npr. albumina, fetuina-A in apo -A1) v človeških telesnih tekočinah.

Naši rezultati kažejo, da lahko elektronsko gosta plast in jedro mineralno-organskih NP vsebujeta višje ravni beljakovin in organskih molekul v primerjavi z elektronsko svetlečimi območji delcev (sl. 6A, B). Zdi se, da so te plasti z elektronsko gostoto mineralizirane, kot je razvidno iz kristalne narave tega materiala pod TEM (glej sliko 4A–J). Drugi avtorji, vključno z Ryallom41 in Evanom et al.44, so predlagali, da lahko svetlobna plast za elektrone predstavlja minerale, medtem ko lahko plasti z elektronsko gostoto ustrezajo organskim molekulam. Te interpretacije so lahko vsaj deloma posledica načina, na katerega so bili vzorci obdelani in pregledani v vsaki študiji, pa tudi narave uporabljenih začetnih tkiv.

Poleg tega, da igrajo vlogo pri zunajmaternični kalcifikaciji, lahko mineralno-organski delci povzročijo vnetje v ledvičnih tkivih. Pred kratkim smo pokazali, da medtem ko mineralo-organski NP ne uspejo inducirati izločanja provnetnega interlevkina-1 s človeškimi makrofagi, lahko to storijo mineralni agregati, večji od 1 μm23. Izkazalo se je, da je sproščanje interlevkina -1 kot odziv na kristalne materiale odvisno od aktivacije znotrajceličnih molekularnih kompleksov, imenovanih inflamasomi 45–47. Poleg tega so mineralne delce odkrili v ledvicah, ki vsebujejo tumorje, povezava med rakom in vnetjem pa je zdaj dobro znana48. Možnost, da lahko agregirani mineralni delci aktivirajo vnetje in prispevajo k razvoju vnetja in raka v ledvicah ali drugih tkivih, je treba še raziskati.

Poleg zunajmaternične kalcifikacije lahko tukaj opisana mineralna zrnca sodelujejo pri drugih boleznih. Prej smo na primer predlagali, da se mineralni NP lahko vežejo na različne beljakovine v telesnih tekočinah in izčrpajo te organske molekule iz telesnih tekočin 20, 26. Po drugi strani pa lahko človeško telo prepreči nastanek in kopičenje mineralnih NP v normalnih okoliščinah s pomočjo prisotnosti inhibitorjev kalcifikacije in retikuloendotelnega sistema (tj. makrofagov). Mineralni NP se tako lahko kopičijo šele, ko je motena sistemska ali lokalna homeostaza kalcija in ko v človeškem telesu odpovejo zaščitni mehanizmi.

Predlagamo, da se tukaj razvit nanomaterialni pristop lahko uporabi za preučevanje tvorbe mineralo-organskih NP v živalskih in človeških tkivih. Na primer, protitelesa proti proteinom zaviralcem kalcifikacije, kot so albumin, fetuin-A in apo-A1, se lahko uporabijo v kombinaciji z mineralno analizo za odkrivanje in karakterizacijo tvorbe mineralo-organskih NP v tkivih živalskih modelov. Rezultati, dobljeni s tem pristopom, se lahko uporabijo za klinične meritve na človeških telesnih tekočinah, da bi identificirali biološke parametre, ki odražajo stanje tvorbe mineralnih delcev in zunajmaternične kalcifikacije v telesu. Pričakujemo, da bo to znanje lahko pripeljalo do razvoja novih terapevtskih strategij za preprečevanje in zdravljenje človeških bolezni in stanj, povezanih z zunajmaternično kalcifikacijo.

Metode

Tkiva ledvic.Uporabo človeških tkiv in poskuse, izvedene v tej študiji, je odobril institucionalni revizijski odbor spominske bolnišnice Chang Gung; metode in poskusi so bili izvedeni v skladu z odobrenimi smernicami. Od pacientov je bilo pridobljeno pisno informirano soglasje. Kontrolna zdrava ledvična tkiva so bila pridobljena iz biopsij bolnikov s poškodbami in hematomi, ki niso imeli bolezni ledvic (n=2); ledvična tkiva so bila pridobljena tudi pri bolnikih z ledvičnim rakom (n=20) in pri bolnikih s končno odpovedjo ledvic (n=2), ki so jim bile ledvice odstranjene ali biopsirane med operacijo presaditve (tabela 1). Pri tkivih ledvičnega raka je bil v tej študiji seciran in analiziran nekancerozni del tkiva.

Histološka analiza.Tkiva ledvic so bila nameščena na parafinske bloke. Bloke smo razrezali in rezine tkiva segrevali na vroči plošči pri 70 stopinjah 30 minut, da smo odstranili parafin. Odseke smo trikrat za 15 minut potopili v svežo raztopino ksilena, da smo popolnoma odstranili preostali parafin. Odseke smo rehidrirali s 95-odstotnim, 80-odstotnim in 70-odstotnim etanolom vsakič 5 minut. Rehidrirane vzorce smo spirali z dvojno destilirano vodo (ddH2O) 5 minut. Celična jedra smo 8 minut barvali s hematoksilinom. Barvilo smo iz vzorcev odstranjevali s toplo vodo 10 minut. Vzorce ledvic smo splaknili v ddH2O in jih 10-krat potopili v 95-odstotni etanol. Vzorce, obdelane z etanolom, smo 1 minuto obarvali z eozinom Y. Vzorci so bili vsakič 10 minut dehidrirani s 95-odstotnim in 100-odstotnim etanolom, čemur je sledil korak dehidracije v ksilenu 10 minut. Končni dehidrirani vzorci ledvic so bili nameščeni na stekelcih s 50 odstotki glicerola in opazovani pod svetlobnim mikroskopom, opremljenim z digitalno kamero.

Deparafinizirani in rehidrirani vzorci so bili pripravljeni, kot je opisano za barvanje s H&E. Rehidrirane odseke smo obarvali s srebrovim nitratom (5 odstotkov), čemur je sledila izpostavljenost UV svetlobi za 20 minut. Raztopino smo 15 minut izpirali z ddH2O. Odseke smo 5 minut obarvali z natrijevim tiosulfatom (5 odstotkov), čemur je sledilo 15-minutno izpiranje z ddH2O. Odseke smo 5 minut obarvali z jedrsko hitrim rdečim (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI). Obarvane vzorce smo zaporedoma dehidrirali s 95-odstotnim in 100-odstotnim etanolom po 10 minut, pred dehidracijo v ksilenu za 10 minut. Vzorce ledvic smo namestili na steklena stekelca in pregledali, kot je opisano zgoraj.

Elektronska mikroskopija in EDX analiza.Vzorce ledvic smo razrezali na majhne koščke, debele manj kot 1 mm, z uporabo disekcijskega mikroskopa LGPS (Olympus, Tokio, Japonska). Tkiva smo fiksirali z 2,5-odstotnim glutaraldehidom in 1-odstotnim paraformaldehidom v 0.1 M kakodilatnem pufru pri 4 stopinjah čez noč. Fiksne vzorce smo trikrat sprali z 0.1 M kakodilatnim pufrom v 8-odstotni saharozi (pH 7,2) na ledu 10 minut. Oprana tkiva smo inkubirali v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4), ki je vsebovala 1 odstotek osmijevega tetroksida in 1,5 odstotka kalijevega ferocianida, 2 uri na ledu. Tkiva smo trikrat sprali z ddH2O na ledu 10 minut. Oprana tkiva smo 1 uro obarvali na ledu z 1 odstotkom uranil acetata v ddH2O, pred trikratnim pranjem z ddH2O na ledu. Tkiva ledvic so bila dehidrirana s 30, 50, 70, 80 in 90 odstotki etanola vsakič 10 minut, razen ko je etanol dosegel 70 odstotkov, v tem primeru pa so bili vzorci shranjeni pri 4 stopinjah čez noč. Tkiva smo 15 minut obarvali z 1-odstotno fosfovolframovo kislino v 95-odstotnem etanolu, pred 5-minutno dehidracijo s 95-odstotnim etanolom. Vzorce smo vsakič za 10 minut potopili v propilen oksid pri 40, 57, 67 in 100 odstotkih v etanolu, čemur je sledila ponovna potopitev v 100-odstotni propilen oksid za 5 minut. Ledvična tkiva so bila vsakokrat 1 uro infiltrirana s 50, 70 in 100 odstotki Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA). Eponate 812-vgrajene vzorce ledvic smo pripravili z dvakratno inkubacijo v 100-odstotni Eponate. Vdelane vzorce smo čez noč inkubirali v pečici pri 60 stopinjah, da smo omogočili polimerizacijo smole.

Oprane pelete HS-NP, pridobljene kot zgoraj, smo fiksirali z glutaraldehidom (2,5 odstotka) in paraformaldehidom (1 odstotek) v ddH2O 4 ure pri 4 stopinjah. Fiksne pelete smo sprali z ddH2O trikrat po 10 minut, vsakič. Pelete smo dehidrirali z zaporednimi inkubacijami v 30, 50, 70, 80, 90, 95 in 100-odstotnem etanolu, vsakič 10 minut, razen ko je etanol dosegel 70 odstotkov, v katerem so bili peleti shranjeni pri 4 stopinjah čez noč. Druge raztopine etanola so bile v stiku s peleti le 10 minut. Dehidrirane pelete smo infiltrirali z LR belim medijem za vgradnjo (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) z uporabo različnih razmerij etanola in medija LR (3:1, 1:1 in 1:3) 30 minut vsakega. Pelete smo čez noč pred polimerizacijo infiltrirali s svežim medijem LR (100 odstotkov). Pelete, infiltrirane z medijem LR, smo inkubirali v pečici pri 60 stopinjah 2 dni, da smo omogočili polimerizacijo smole. Bloki ledvic in HS-NP so bili razrezani na rezine z debelino 70–100 nm z uporabo mikrotoma Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, Nemčija). Tkivne sekcije so bile obarvane s 4 odstotki uranil acetata pred vizualizacijo pod transmisijskim elektronskim mikroskopom JEM 1230 (JEOL, Tokio, Japonska), ki deluje pri 100 kV. Vzorci elektronske difrakcije so bili pridobljeni z uporabo istega sistema. Kot podpora so bile uporabljene rešetke iz niklja.

Za analizo EDX so bili tanki odseki ledvičnih tkiv obarvani z uranil acetatom in sprani z ddH2O kot zgoraj, čemur je sledilo sušenje v elektronski eksikatorski omari. Vzorce smo opazovali pod transmisijskim elektronskim mikroskopom visoke ločljivosti JEM 2100 (JEOL), ki deluje pri 120 kV. Spektri EDX so bili pridobljeni v treh izvodih z uporabo sistema INCA Energy EDS (Oxford Instruments, Abingdon, UK). Tanke dele HS-NP so opazili brez obarvanja.

Priprava mineralo-organskih NP.Vse začetne raztopine so bile pred uporabo naravnane na pH 7,4 in sterilizirane s filtracijo skozi 0.2μm membrane. HS je bil pridobljen od zdravih človeških prostovoljcev z uporabo običajne tehnike venepunkcije. Uporabo človeških bioloških tekočin v tej študiji je odobril institucionalni revizijski odbor Spominske bolnišnice Linko Chang Gung, od prostovoljcev pa je bilo pridobljeno pisno soglasje. HS-NP smo pripravili z dodajanjem po 3 mM CaCl2 in Na2HPO4 v DMEM (Gibco, Carlsbad, CA), ki je vseboval 10 odstotkov HS, čemur je sledila en teden inkubacije v pogojih celične kulture (37 stopinj, 5 odstotkov CO2, vlažen zrak). Delce smo peletirali s centrifugiranjem pri 16,000 × g 15 minut pri 4 stopinjah in jih dvakrat sprali s pufrom HEPES (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) z uporabo istega postopka centrifugiranja.

SDS-PAGE in Western blotting.SDS-PAGE in Western blot analiza sta bili izvedeni v bistvu kot prej15. Na kratko, 0.2 ug (sl. 5A, D) ali 1,2 ug (sl. 5B, C) beljakovin HS, 47 ug (sl. 5A, B, D) ali 59 0 ug proteinov HS-NP (sl. 5C), 0.1ug HSA (sl. 5A–D) in 0.6ug (sl. 5A, C, D) ali {{23} }.15 µg HSF (slika 5B) smo raztopili v 5× "polnilnem pufru" (0.313 M Tris-HCl pH 6,8, 10 odstotkov SDS, 0,05 odstotkov bromofenol modrega, 50 odstotkov glicerola, 12,5 odstotkov - merkaptoetanol) do končne koncentracije 1×, pred segrevanjem pri 95 stopinjah 5 minut in ločevanjem pod denaturacijskimi in redukcijskimi pogoji na 10-odstotni SDS-PAGE z uporabo mini-gel sistema (Hoefer, Holliston, MA). Kontrola NP (uporabljena v pasu 1 na sliki 5A–D) je bila sestavljena iz mineralnih NP, pripravljenih z dodajanjem 3 mM CaCl2 in Na2HPO4 vsakega v DMEM (končna prostornina 1 ml), čemur je sledila inkubacija en dan v pogojih celične kulture; delci so bili peletirani s centrifugiranjem pri 16,000 × g 15 minut, dvakrat sprani s pufrom HEPES in resuspendirani v 50 ul pufra HEPES. Alikvot 20 ul resuspendiranih delcev je bil obdelan za SDS-PAGE kot zgoraj. Membrane PVDF so bile 1 uro blokirane v 5 odstotkih (m/v) razmaščenem mleku pri sobni temperaturi. Primarna protitelesa, proizvedena v podjetju, kot je opisano prej25, so bila uporabljena v razredčitvi 1:1,000 (-apo-A1 in -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) ali 1:6,000 (-HSA). Uporabljeno je bilo sekundarno protitelo proti kunčjemu hrenu, konjugirano s peroksidazo, na podlagi navodil proizvajalca (Millipore, Billerica, MA). Pise so bile odkrite z izboljšano kemiluminiscenco (Amersham Biosciences, Amersham, Združeno kraljestvo) in avtoradiografskimi filmi.

Označevanje imunoglata.Pripravljeni so bili vzorci za TEM opazovanje. Bloki HS-NP so bili razdeljeni na rezine, debele manj kot 7 0 nm. Vzorčne odseke na mrežah smo 25 minut blokirali z 1 odstotkom ribje želatine (Sigma) v 0.1 M pufru HEPES (pH 8,0). Mreže so bile inkubirane z naslednjimi primarnimi protitelesi: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Negativna kontrola ni vsebovala primarnega protitelesa (1 odstotek ribje želatine v pufru HEPES). Inkubirane odseke smo 15 minut izpirali s pufrom HEPES. Izprane odseke smo 20 minut blokirali z 1-odstotno ribjo želatino v pufru HEPES. Vzorci so bili 1 uro obdelani s sekundarnim 5-nm-zlatim konjugatom kozjih anti-kunčjih IgG. Vzorce smo 10 minut izpirali s pufrom HEPES, pred izpiranjem z ddH2O 10 minut. Opazovanja TEM so bila izvedena kot zgoraj.

Fluorescenčna mikroskopija.Histološka stekelca ledvičnega tkiva, pripravljena kot zgoraj, so bila blokirana z 1 odstotkom govejega serumskega albumina 1 uro pri sobni temperaturi. Predmetna stekelca smo inkubirali s primarnimi poliklonskimi protitelesi v razredčitvi 1:4, 000. Po korakih pranja so bili vzorci inkubirani s sekundarnimi protitelesi kozji anti-zajec-FITC (492/520 nm) in kozji anti-kunec-TRITC (550/570 nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) pri 1:100 za 1h Komplekse smo spirali s PBST 15 minut. Fluorescentno barvilo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) je bilo uporabljeno pri 10 ug/ml 15 minut. Vzorce, obarvane z DAPI, smo dehidrirali s 95 in 100 odstotnim etanolom po 10 minut, čemur je sledila dehidracija v ksilenu še 10 minut. Vzorci dehidriranih ledvic so bili nameščeni z Vectashield fluorescence H-1000 pritrdilnim medijem (Vector Laboratories, Burlingame, CA) in opazovani pod konfokalnim mikroskopom (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Nemčija), opremljenim s kamero Spot Flex.

Cistanche tubulosa preprečuje bolezni ledvic, kliknite tukaj za vzorec

Reference

1. Giachelli, CM Ektopična kalcifikacija: zbiranje trdih dejstev o mineralizaciji mehkih tkiv. Am J Pathol 154, 671–675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Žilna kalcifikacija: mehanizmi in klinične posledice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161–1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Kalcifikacija pri aterosklerozi. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Vzorci in dejavniki tveganja za sistemsko kalcificirano aterosklerozo. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331–336 (2004).

5. Ketteler, M. et al. Pomanjkljivosti beljakovin, ki uravnavajo kalcij, pri bolnikih na dializi: nov koncept kardiovaskularne kalcifikacije pri uremiji. Kidney Int Suppl 84, S84–87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Usmerjanje vaskularne kalcifikacije: mehčanje trde tarče. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Regulacija kalcija v matričnih mehurčkih, pridobljenih iz vaskularnih gladkih mišičnih celic. Trendi Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM et al. Kalcifikacija pri aterosklerozi: biologija kosti in kronično vnetje na križišču arterij. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Povezava Randallovih plakov s kolagenskimi vlakni in membranskimi vezikli. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Biokemijska karakterizacija serumskega fetuin-mineral kompleksa. J Biol Chem 278, 22153–22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Serumske ravni kompleksa fetuin-mineral so v korelaciji s kalcifikacijo arterije pri podganah. J Biol Chem 279, 1594–1600 (2004).

12. Heiss, A. et al. Hierarhična vloga fetuina-A in kislih serumskih proteinov pri tvorbi in stabilizaciji delcev kalcijevega fosfata. J Biol Chem 283, 14815–14825 (2008).

13. Bertazzo, S. et al. Nanoanalitična elektronska mikroskopija razkriva temeljne vpoglede v kalcifikacijo človeškega srčno-žilnega tkiva. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Domnevne nanobakterije v človeški krvi kot nanodelci kalcijevega karbonata. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD et al. Domnevne nanobakterije predstavljajo fiziološke ostanke in stranske produkte kulture normalne homeostaze kalcija. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD et al. Karakterizacija granulacij kalcija in apatita v serumu kot pleomorfnih mineralo-proteinskih kompleksov in kot predhodnikov domnevnih nanobakterij. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albumin-mineralni kompleksi, podobni serumskim kalcijevim zrncem in domnevnim nanobakterijam: prikaz koncepta dvojne inhibicije in sejanja. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Vzpon in padec nanobakterij. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Kritično vrednotenje seruma, obsevanega z gama, ki se uporablja kot podajalnik v kulturi, in predstavitev domnevnih nanobakterij in kalcificirajočih nanodelcev. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. et al. Obsežna proteomska analiza mineralnih nanodelcev, pridobljenih iz človeških telesnih tekočin in analiziranih s tekočinsko kromatografijo in tandemsko masno spektrometrijo. Analna biokemija 418, 111–125 (2011).