Odkrivanje povišane ravni tetrahidrobiopterina v serumskih vzorcih bolnikov z ME/CFS z ortostatsko intoleranco: Pilotna študija

Povzetek:Mialgični encefalomielitis ali sindrom kronične utrujenosti (ME/CFS) je multisistemska kronična bolezen, za katero so značilni huda mišična utrujenost, bolečina, omotica in možganska megla. Mnogi bolniki z ME/CFS doživljajo ortostatsko intoleranco (OI), za katero so značilne pogoste omotica, omotičnost in občutek omedlevice, medtem ko ohranjajo pokončno držo. Kljub intenzivnim raziskavam je molekularni mehanizem tega izčrpavajočega stanja še vedno neznan. OI se pogosto kaže s srčno-žilnimi spremembami, kot so zmanjšan možganski krvni pretok, znižan krvni tlak in zmanjšan srčni utrip. Biološka uporabnost tetrahidrobiopterina (BH4), bistvenega kofaktorja endotelnega encima sintaze dušikovega oksida (eNOS), je tesno povezana z zdravjem srca in ožilja ter krvnim obtokom. Za raziskovanje vloge BH4 pri ME/CFS so bili vzorci seruma bolnikov s CFS (n=32), bolnikov s CFS samo z OI (n=10; CFS + OI) in bolnikov s CFS tako z OI kot polinevropatijo majhnih vlaken (n=12; CFS + OI + SFN) so bili podvrženi testu BH4 ELISA. Zanimivo je, da so naši rezultati razkrili, da je izražanje BH4 znatno visoko pri bolnikih s CFS, CFS + OI in CFS + OI + SFN v primerjavi s kontrolami, ki se ujemajo po starosti/spolu. Končno je test proizvodnje ROS v gojenih mikroglijskih celicah, ki mu je sledila Pearsonova korelacijska statistika, pokazal, da je lahko povišan BH4 v serumskih vzorcih bolnikov s CFS + OI povezan z odzivom na oksidativni stres. Te ugotovitve kažejo, da bi lahko bila regulacija metabolizma BH4 obetavna tarča za razumevanje molekularnega mehanizma CFS in CFS z OI.

Cistanche lahko deluje kot sredstvo proti utrujenosti in povečuje vzdržljivost, eksperimentalne študije pa so pokazale, da lahko decoction Cistanche tubulosa učinkovito ščiti jetrne hepatocite in endotelne celice, poškodovane pri plavalnih miših, ki nosijo težo, poveča izražanje NOS3 in spodbuja jetrni glikogen sintezo in tako deluje proti utrujenosti. Izvleček Cistanche tubulosa, bogat s feniletanoidnimi glikozidi, bi lahko bistveno zmanjšal serumsko raven kreatin kinaze, laktat dehidrogenaze in laktata ter zvišal raven hemoglobina (HB) in glukoze pri miših ICR, kar bi lahko imelo vlogo proti utrujenosti z zmanjšanjem poškodb mišic in zakasnitev obogatitve mlečne kisline za shranjevanje energije pri miših. Tablete Compound Cistanche Tubulosa so znatno podaljšale čas plavanja z utežmi, povečale rezervo glikogena v jetrih in znižale raven sečnine v serumu po vadbi pri miših, kar kaže na učinek proti utrujenosti. Odvarek Cistanchis lahko izboljša vzdržljivost in pospeši odpravo utrujenosti pri vadbenih miših, prav tako pa lahko zmanjša zvišanje serumske kreatin kinaze po obremenitveni vadbi in ohranja normalno ultrastrukturo skeletnih mišic miši po vadbi, kar kaže, da ima učinke za povečanje telesne moči in proti utrujenosti. Cistanchis je tudi znatno podaljšal čas preživetja miši, zastrupljenih z nitriti, in povečal toleranco proti hipoksiji in utrujenosti.

Kliknite Preutrujenost

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】

Ključne besede:ME/CFS; tetrahidrobiopterin; ortostatska intoleranca; polinevropatija majhnih vlaken; endotelijski NOS; reaktivne kisikove spojine

1. Uvod

Mialgični encefalomielitis/sindrom kronične utrujenosti (ME/CFS) je kronična multisistemska bolezen, za katero so značilni izčrpavajoča mišična utrujenost, bolečina, omotica in možganska megla [1,2]. Podskupina bolnikov z ME/CFS ima hudo ortostatsko hipotenzijo [3], za katero je značilen znaten padec krvnega tlaka, ki povzroča omotico in omedlevico, medtem ko stojijo v pokončnem stanju [4]. To stanje se pogosto imenuje ortostatska intoleranca (OI). Podskupina bolnikov z OI izpolnjuje tudi diagnostična merila za polinevropatijo majhnih vlaken [5, 6], ki se diagnosticira z obarvanjem s kongo rdečim za amiloidozo v vzorcih biopsije kože [7]. Kljub intenzivnim raziskavam molekularni mehanizem OI ni znan.

BH4 je pomemben kofaktor presnove aminokislin [8]. Aminokisline, kot so fenilalanin, tirozin in triptofan, se z delovanjem encimov hidroksilaze pretvorijo v pomembne celične intermediate. BH4 služi kot bistveni kofaktor vseh teh encimov hidroksilaze [9–11]. Zato je biološka uporabnost BH4 kritična za sintezo nevrotransmiterjev, kot sta dopamin in serotonin [10]. Poleg teh encimov hidroksilaze BH4 uravnava tudi delovanje encimov sintaze dušikovega oksida in nadzoruje proizvodnjo dušikovega oksida (NO) v endoteliju [12]. Endotelijska proizvodnja NO poveča vazodilatacijski odziv, zniža krvni tlak in pomaga pri sprostitvi mišic [13,14]. Po drugi strani pa se BH4 v prisotnosti oksidativnega stresa loči od proizvodnje NO, ki jo povzroča eNOS [15], in neposredno poveča mitohondrijski stresni odziv v srčnem tkivu [16] in skeletnih mišicah [17]. Zato je regulacija metabolizma BH4 ključnega pomena za delovanje srca in ožilja ter zdravje krvnega obtoka. Ker poročajo, da imajo bolniki z OI srčno-žilne nepravilnosti, nas zanima, ali imajo bolniki z OI spremenjen metabolizem BH4. Do sedaj ni bilo študije, ki bi raziskala vlogo metabolizma BH4 pri CFS. Poleg tega naša študija raziskuje tudi, ali so bolniki s CFS z OI spremenili biosintezo BH4.

V študijo so bili vključeni vzorci seruma 66 preiskovancev z n=32 CFS in n=34 kontrolami. Dvojno slepi kvantitativni test ELISA je bil izveden za primerjavo ravni BH4 med zdravimi kontrolnimi osebami in bolniki s CFS. Zanimivo je, da smo opazili, da je prišlo do močne regulacije BH4 pri bolnikih s CFS v primerjavi z zdravimi kontrolami. Med primerjavo ravni BH4 med bolniki s CFS z OI (n=10) in kontrolami, ki se ujemajo po starosti/spolu (n=10), smo opazili tudi, da so imeli bolniki s CFS z OI bistveno višjo raven BH4 v serumu. Skupaj naš trenutni rokopis poudarja, da bi zvišanje serumskega BH4 pri bolnikih s CFS lahko igralo ključno vlogo pri patogenezi OI.

2. Rezultati

Subjekti, vključeni v študijo: Za kvantifikacijo ravni BH4 v serumskih vzorcih je bilo v študijo vključenih skupaj 66 ljudi. Tabela 1 povzema starost, spol, etnično pripadnost in obstoječa stanja teh oseb. Štirje subjekti iz kontrolne skupine so imeli zaplete, povezane z rakom, in so bili zato izključeni iz končne analize. Najnižja, mediana in najvišja starost kontrolne skupine so 18, 64,5 in 82 let. Za skupino CFS so te vrednosti 26, 59 in 76 let. Graf frekvenčne porazdelitve starosti v obeh skupinah je pokazal podobno asimetrijo in kasnejši test Bland-Altmanove analize je pokazal, da je bilo povprečje razlik blizu nič, kar nakazuje, da ni pristranskosti glede starosti. Kontrolno skupino je sestavljalo 44 % moških in 56 % žensk, medtem ko je skupino CFS sestavljalo 41 % moških in 59 % žensk. Vsi bolniki so bili belci in so živeli v geografski regiji severne Nevade in Kalifornije.

Populacija bolnikov z ME/CFS je bila vključena na podlagi kanadskih meril iz leta 2003 in Fakude za ME/CFS. Izpolnjevali so tudi diagnostična merila za SCID (novo ime ME/CFS, ki ga je določil Inštitut za medicino). Kontrole so bile prilagojene starosti/spolu osebam CFS, ki so bile prav tako povabljene skupaj z bolniki na kliniko za interno medicino dr. Petersona.

Podmnožice CFS + OI in CFS + OI_SFN so bile določene z zapisi o diagnostičnem testiranju (pregled zdravstvenega kartona – dokončan) in klinično korelacijo. Na primer, ljudje z OI so v ordinacijo prejeli modificiran pozitivni test NASA (ki prikazuje OI) in vsi so prejeli IV terapijo za povečanje volumna (fiziološko raztopino). Bolniki s SFN so imeli vzorce biopsije. Za vključene subjekte CFS + OI + SFN je bilo zabeleženo poročilo Mass General Hospital, v katerem je bilo obarvanje s kongo rdečim za štetje gostote nevritov opravljeno v lateralnem mišičnem tkivu gležnja.

Raven BH4 je visoka v serumskih vzorcih bolnikov z ME/CFS: Skupno je bilo v študijo (tabela 1) vključenih 32 preiskovancev s CFS in 34 kontrolnih preiskovancev za merjenje ravni BH4 v serumu s kompetitivnim testom ELISA. Standardna krivulja BH4 ELISA je bila eksponentna krivulja z negativnim naklonom, ki je bila izpeljana iz šestih naraščajočih koncentracij standardov BH4 (5, 10, 25, 50, 10{{52 }} in 150 ng/mL). Naklon in presečišče standardne krivulje sta bila uporabljena za merjenje absolutnih ravni BH4 iz vrednosti OD. Serijska razredčitev vzorcev seruma, ki ji je sledil test BH4 ELISA, je pokazala, da je razredčitev seruma 1:2 zagotovila najbolj kontrastne rezultate v primerjavi s slepim vzorcem ali ozadjem. Zato so bili vsi vzorci seruma izpostavljeni razredčitvi 1:2. Zanimivo je, da je dvojno slepa analiza ELISA, ki ji je sledil neparametrični Mann–Whitneyjev U test [* p < 0,05 (=0,033); U=304.5] je pokazalo, da so bile ravni BH4 znatno višje pri n=32 bolnikih s CFS v primerjavi z n=28 kontrolnimi osebami (slika 1A). Štirje preiskovanci (n=4) v kontrolni skupini so bili izključeni zaradi že obstoječega raka. Ker so bili subjekti vključeni naključno, ne glede na njihovo starost in spol, smo nato želeli analizirati korelacijo ravni BH4 s starostjo in spolom subjektov. Skladno s tem je neparametrična Spearmanova korelacijska analiza (slika 1B) pokazala, da ni korelacije med ravnjo BH4 in starostjo oseb (Spearman r=−0,1657; p=0.1835). Nato smo primerjali raven BH4 med moškimi in ženskami (slika 1C). Za oceno pomembnosti med moškim in ženskim (efektor št. 1 je spol) kot tudi med kontrolo in CFS (efektor št. 2 je zdravstveno stanje) je bila izvedena dvosmerna analiza ANOVA. Skladno s tem moški in ženske niso pokazali pomembne razlike v ravneh BH4 (p > 0,05; =0.3496). Vendar pa je obstajala pomembna razlika v BH4 med kontrolno skupino in osebami s CFS (p <0,05; =0.0375) ne glede na razliko v spolu.

Ker je trenutna kohorta strogo omejena na isto geografsko območje, etnično pripadnost in iz prakse enega samega zdravnika, bi bila primerjalna analiza BH4 v parih med primeri in kontrolami, ki ustrezajo starosti in spolu, bolj prepričljiva. Skupno je bilo primerjanih 15 parov (slika 1D). Neparametrični Wilcoxonov test ujemajočih se parov s predznakom je pokazal, da so imeli bolniki s CFS znatno višji BH4 (** p<0.01; =0.0015) than age- and gender-matched controls. Collectively, our results suggest that the BH4 level is significantly higher in CFS patients compared to healthy control subjects, irrespective of age and gender differences.

CFS patients with OI have upregulated levels of BH4 in serum: Next, we wanted to analyze BH4 levels between control (n = 10) and CFS patients with OI (n = 10). An unpaired t-test revealed that CFS + OI patients had significantly higher BH4 [t1,18 = 2.499; * p < 0.05 (=0.0223)] levels compared to control subjects (Figure 2A). Table 2 displays that all controls were carefully matched with CFS + OI subjects in terms of age and gender. Moreover, a Kolmogorov–Smirnov normality distribution analysis followed by a Q-Q (quantile-quantile) plot (Figure 2B) indicated that all data points were normally distributed [p >alfa ({{0}}.05)]. Ker so bili vsi CFS in kontrolni vzorci usklajeni s starostjo in spolom, je bila izvedena primerjalna analiza po parih. Naknadni parni t-test (t1,9=3.834; ** p < 0.01=0.004) je pokazal, da so imeli serumski vzorci CFS + OI bistveno višji BH4 v primerjavi s kontrolnimi vzorci seruma (slika 2C). ). Kumulativni statistični test v stolpcu (slika 2D) je nadalje razkril, da je imelo 7 od 10 bolnikov s CFS + OI bistveno višje ravni BH4 od mediane (=99,63 ng/mL). Po drugi strani pa sta le 2 od 10 kontrolnih subjektov imela višjo BH4 od mediane vrednosti. Skupaj ti podatki kažejo, da so imeli bolniki s CFS + OI znatno višji BH4 v primerjavi s kontrolnimi osebami.

Podskupina bolnikov s CFS (n=12) ima OI in SFN. Primerjava ravni BH4 (slika 3A) med zdravo kontrolo in preiskovanci s CFS + OI + SFN je pokazala, da so imeli bolniki s CFS + OI + SFN bistveno višjo raven BH4 [t1,22=2.371; * str<0.05 (=0.0269)]. Table 3 shows that the cohort of 24 serum samples (n = 12 Control + n = 12 CFS + OI + SFN) was carefully selected based on age and gender. Subsequently, a Q-Q plot demonstrated all data points from both groups were normally distributed (Figure 3B). Since all subjects were matched in terms of age and gender, a paired analysis of control and CFS + OI + SFN subjects was performed. Accordingly, a significant difference in BH4  expression (* p < 0.05) was observed between these two groups (Figure 3C). A cumulative statistical analysis (Figure 3D) further indicated that n = 6 CFS + OI + SFN patients and n = 3 controls have higher BH4 levels than the median (=81.83 ng/mL) suggesting that the BH4  level is strongly elevated in serum samples of CFS + OI + SFN subjects.

Med primerjavo ravni BH4 med samimi CFS in bolniki s CFS + OI smo opazili, da so imeli vzorci seruma bolnikov s CFS + OI (n=14) višje ravni BH4 (slika 4A) v primerjavi s tistimi pri kontrolnih osebah (n {{ 6}}). Analiza grafa QQ kaže, da je porazdelitev podatkov normalna v obeh skupinah (slika 4B), kar nakazuje, da se lahko za primerjavo povprečij uporabi parametrični test. V skladu s tem je neparni t-test za analizo pomembnosti povprečja med skupinami pokazal močno razliko [t1,22=2.592; * p < 0.05 (=0.0166)]. Statistični podatki v stolpcih izbrane kohorte (n=22) so pokazali, da je imelo 9 od 14 bolnikov s CFS + OI višje ravni BH4 v serumu v primerjavi z mediano 119,7 ng/mL (slika 4C). Naši rezultati skupaj kažejo, da imajo bolniki s CFS z OI povišane ravni BH4 v serumu. Skupaj naš trenutni rokopis identificira BH4 kot potencialni biomarker, ki se prenaša s krvjo, za bolnike s CFS + OI in CFS + OI + SFN.

Povišane ravni BH4 so lahko povezane s povečanim oksidativnim stresom: Da bi razumeli funkcionalni pomen povišanega BH4 v serumu, smo raziskali sposobnost indukcije ROS serumskih vzorcev bolnikov s CFS z OI (n=10). Mikroglialne celice, infundirane z DCFDA, smo 90 minut obdelali z 1:2 razredčenimi vzorci seruma iz 10 CFS + OI in 10 kontrol, ki se ujemajo s starostjo/spolom, čemur je sledilo merjenje proizvodnje ROS z uporabo bralnika fluorescenčnih plošč (Primer: Em { {12}} nm/535 nm), kot je opisano v razdelku o materialih in metodah. Kot smo že poročali [18], je analiza histograma pokazala, da so bile zmožnosti proizvajanja ROS vzorcev seruma CFS + OI znatno višje kot kontrolni vzorci seruma (slika 5A) [t1,18=2.541; p < 0,05 (=0.0205)]. Ker so bile vse podatkovne točke v obeh skupinah normalno porazdeljene (slika 5B), smo izvedli parametrični test za preučevanje pomembnosti povprečja med skupinami. Zanimivo je, da je Pearsonova korelacijska statistična analiza v tej kohorti pokazala, da obstaja zmerno pozitivna korelacija med ravnmi BH4 in proizvodnjo ROS, kar kaže, da so lahko povišane ravni BH4 v serumskih vzorcih CFS + OI povezane s povečanim oksidativnim odzivom (slika 5C).

Skupaj naš trenutni rokopis poudarja, da so bolniki s CFS povezani s povišanimi ravnmi BH4 v serumu in da je bila regulacija pomembneje opažena pri bolnikih s CFS z OI. Poleg tega je lahko povišan BH4 povezan z odzivom na oksidativni stres, kar poudarja potencialno vlogo metabolizma BH4 v patogenezi CFS in CFS z OI (slika 5D).

3. Razprava

Biosinteza tetrahidrobiopterina (BH4) je strogo reguliran presnovni proces v zdravju, njegovo nenormalno izražanje pa je povezano z vrsto bolezni. Njegovo pomanjkanje vodi v presnovni primanjkljaj presnove aminokislin [19,20], poslabšanje regulacije dopamina [21] in poslabšanje krvnega pretoka [22,23] ter je povezano s hipertenzijo, sladkorno boleznijo, aterosklerozo, staranjem in druge presnovne motnje. Po drugi strani pa regulirana biosinteza BH4 poslabša proizvodnjo mitohondrijske energije [24], povzroči oksidativni stres [25] in poveča okvaro avtofagije [26]. Povišan BH4 je povezan tudi z znižanjem krvnega tlaka [27] z indukcijo vazodilatacijskega odziva prek aktivacije endotelnega NOS [28]. Zato lahko povečana biosinteza BH4 neposredno spodbuja znižanje krvnega tlaka ali hipotenzije. Študija kaže, da pomanjkanje BH4 zmanjša hipotenzijo, ki jo povzroča LPS pri miših [23]. Do sedaj vloga presnove BH4 ni bila raziskana pri bolnikih s CFS, zlasti pri bolnikih s CFS z OI. Zato je bil naš cilj oceniti izražanje BH4 v serumu pri tej populaciji bolnikov. Presenetljivo je naša analiza ELISA pokazala, da so imeli vzorci seruma bolnikov s CFS znatno višje ravni BH4 v primerjavi s kontrolnimi subjekti, ki so se ujemali po starosti in spolu. Skladno s tem je Spearmanova korelacijska statistika pokazala, da ni pomembne korelacije povečane regulacije BH4 niti glede starosti niti spola, kar je izničilo možnosti s starostjo ali spolom povezane okvare biosinteze BH4 pri teh bolnikih.

Nato smo opazili, da so vzorci seruma bolnikov s CFS + OI pokazali močno povišanje BH4 v primerjavi s serumskimi vzorci kontrol, ki se ujemajo po starosti in spolu. Naši kumulativni statistični podatki v stolpcu so razkrili, da je imelo 7 od 10 bolnikov s CFS + OI izjemno visoke ravni BH4, kar nakazuje, da je zvišanje BH4 v serumu lahko povezano s patogenezo OI. Rezultat je bil dodatno potrjen, ko je podskupina bolnikov s CFS + OI s polinevropatijo majhnih vlaken (SFN) prav tako pokazala visoko izraženost BH4 v njihovih serumskih vzorcih v primerjavi s kontrolami, ki se ujemajo po starosti in spolu. Zanimivo je, da je primerjava serumskih ravni BH4 samo med CFS in bolniki s CFS z OI pokazala, da so bile ravni BH4 pri bolnikih z OI znatno povišane.

Kako povišan BH4 prispeva k patogenezi ME/CFS? Obstaja več poti, po katerih lahko povišan BH4 neposredno prispeva k patogenezi ME/CFS (slika 5D). Prvič, povečana regulacija BH4 naj bi povzročila mitohondrijsko okvaro energetske presnove z inhibicijo kompleksa I in IV transportne verige elektronov, kar povzroči zmanjšanje potenciala mitohondrijske membrane, sproščanje citokroma C in apoptozo [24]. Poroča se tudi, da izpostavljenost BH4 povzroča oksidativni stres [29]. Čeprav fiziološko BH4 podpira proizvodnjo endotelnega NO z aktivacijo eNOS, ga oksidacija BH4 s superoksidom loči od eNOS, kar povzroči oksidativni stres srčnemu tkivu in vpliva na zdravje srca in ožilja (slika 5C). V podporo so naši rezultati pokazali, da so imele povišane ravni BH4 v serumskih vzorcih CFS + OI pozitivno korelacijo s sposobnostmi induciranja ROS. Poleg tega BH4 aktivira tudi tarče kinaze rapamicin kompleksa1 (mTORC1) pri sesalcih, da zmanjša avtofagijo. Prej smo poročali, da bi lahko bila aktivacija mTORC1 in kasnejša okvara avtofagije povezana s patogenezo ME / CFS. Poročali so, da mTORC1-odvisna okvara avtofagije [18] in mitohondrijsko pomanjkanje energetske presnove [30] prispevata k patogenezi ME/CFS. Zato bi lahko zvišanje ravni BH4 v serumskih vzorcih bolnikov z ME/CFS povzročilo oksidativni stres in povečalo ločevanje eNOS, čemur bi sledili kardiovaskularni stres, hipotenzija, mitohondrijska toksičnost in motnje avtofagije pri bolnikih s CFS.

4. Materiali in metode

Pridobivanje vzorcev: Odvzem vzorcev, deidentifikacija in načrt shranjevanja so bili obravnavani prej [18]. Na kratko, vzorci krvi in ​​podatki iz vprašalnika so bili zbrani pod nadzorom dr. Daniela Petersona (Sierra Internal Medicine, Incline Village, NV, ZDA) (Western IRB) #20201812. Vzorce krvi smo centrifugirali, vzorce seruma pa alikvotirali in nato takoj zamrznili pri –80 ◦C. Vsak vzorec je dobil edinstveno identifikacijsko številko in zabeležen v zvezku in Microsoft Excelu z datumom in podpisom po protokolu, ki ga je odobril IRB. Vzorci so bili nato čez noč na suhem ledu dostavljeni v našo raziskovalno ustanovo v Wisconsinu. Po prejemu so bili vzorci takoj obdelani in testirani. Vprašalnik in deidentificirani klinični podatki so shranjeni v varni zbirki podatkov Redcap Server z omejenim dostopom, ki jo upravlja raziskovalno osebje in klinični sodelavec pri Sierra Internal Medicine. Zapisi bolnikov so bili vodeni v skladu s smernicami politike zasebnosti, ki jih je določila Sierra Internal Medicine. Podskupine bolnikov z ME/CFS v skupinah OI in OI + SFN so bile določene s slepim pregledom kart, postlaboratorijska analiza pa je bila potrjena s kliničnim PI. Štirje bolniki z rakom so bili slepo vključeni v to analizo in so služili kot na bolezen pozitivna kontrola.

Diagnostična merila za OI so vključevala ustrezne ugotovitve (rezultate tabele srčnega nagiba) iz pregleda kliničnega kartona. Poleg tega je klinični sodelavec v času odvzema krvi opravil pregledno analizo NASA. Diagnoza SFN je bila postavljena s pregledom kliničnega kartona in histološkim pregledom biopsije kožnega udarca, odvzetega iz pretibialne regije. Biopsije kože so bile neodvisno ocenjene v splošni bolnišnici Massachusetts za morfometrično kvantifikacijo epidermalnih živčnih končičev za preučevanje gostote nevritov na površini kože.

BH4 Competitive ELISA: Raven BH4 je bila izmerjena in kvantificirana v serumskih vzorcih bolnikov z ME-CFS in zdravih kontrolnih oseb, ki ustrezajo starosti, po navodilih proizvajalca (Human BH4 competitive ELISA kit; Prodajalec: MyBioSource, Inc, San Diego, CA 92195, ZDA; Cat # MBS733839). Komplet je bil validiran v našem laboratoriju (multimodalni čitalnik plošč Perkin Elmer Victor X3, Perkin Elmer, Waltham, MA, ZDA) in je imel standardno krivuljo (R2=0.98) in občutljivost tako nizko kot 1 ng/mL koncentracija glede na pozitivno kontrolo. Na kratko, vzorce seruma smo razredčili s testnim razredčilom (ali 1 × PBS) in nato pipetirali na mikroploščo, ki je bila predhodno prevlečena s poliklonskim protitelesom proti BH4. Po 30 minutah inkubacije z vzorcem smo na ploščo dodali BH4-HRP konjugat in inkubirali dodatno 1 uro pri 37 ◦C. Vzorce ostankov seruma smo oddekantirali in sprali na plošči z 1 × pralnim pufrom (alternativno z 1 × PBS-T) trikrat po pet minut z uporabo večkanalne pipete. Po izpiranju je vsaka vdolbinica reagirala s substratom TMB 10 minut v temi. Do razvoja barve pride po 10 minutah inkubacije substrata v pogojih stresanja. Konjugat BH4-HRP bi tekmoval s serumskim BH4 za vezavo na obloženo primarno protitelo. Torej, več kot je BH4 v serumu v vzorcu, manjša bi bila vezava BH4-HRP in s tem nastala manjša barva. Skupaj 66 vzorcev seruma (34 kontrolnih + 32 bolnikov z ME-CFS) je bilo pridobljenih (podrobnosti v razdelku »Pridobivanje vzorcev«) z ustreznimi institucionalnimi regulativnimi smernicami in analiziranih pod pogoji GLP. Porazdelitev vzorcev je bila naključna, test pa dvojno slep, kot je opisano v razdelku "utemeljitev velikosti vzorca".

Utemeljitev velikosti vzorca in statistična analiza: Velikost vzorca je bila utemeljena z naslednjo enačbo. Velikost vzorca {{0}} n=z2p(1−p)/ε2=1.282∗0.95∗(1−0. 95)/0.052=32. Z je rezultat z, ki je 1,28 za moč 0.8. p je delež populacije; za 95-odstotni interval zaupanja bo p {{20}},95. ε je meja napake, ki je 0,05. Da bi torej dosegli pomembnost v razliki povprečja med skupinami pri p < 0,05, je bilo vključenih skupno n=32 vzorcev na skupino. Za primerjavo med kontrolnimi bolniki in bolniki s CFS + OI je bilo vključenih n=10 vzorcev na skupino. Podobna velikost vzorca je bila vključena med primerjavo kontrolnih in kontrolnih +OI + SFN skupin. Izračun velikosti vzorca je bil izveden na podlagi ε=0.05 in p=0.99. Neparametrični Mann–Whitneyjev U test je bil sprejet za testiranje pomembnosti povprečja med obema skupinama, kadar koli sta obe skupini prikazali enake in normalne porazdelitve podatkov; sicer je bil izveden parametrični neparni t-test. Za seznanjeno analizo med skupinami je bil izveden parametrični seznanjeni t-test, če so bile podatkovne točke iz obeh skupin normalno porazdeljene; sicer pa je bil opravljen Wilcoxonov rank test za oceno pomembnosti med skupinami. Dvosmerna ANOVA z post hoc Bonferronijem ali Tukeyjem je bila uporabljena za testiranje pomembnosti povprečja v več kot dveh skupinah, pri čemer sta upoštevala spol (moški ali ženska) in zdravje (zdravi ali CFS) kot efektorja. Vse statistične analize so bile izvedene v programski opremi GraphPad Prism različice 9.5.1 (733) (Boston, MA 02110, ZDA).

ROS test:HMC3 človeške embrionalne mikroglialne celice smo gojili in pasirali s popolnim medijem DMEM. Na kratko, celice HMC3 smo nasadili na ploščo s 96 jamicami za fluorometrično študijo ROS. Celice smo gojili do 75–80 % konfluence in inkubirali s sondo DCFDA (Cat# ab113851; Abcam, Cambridge, UK) 45 minut pri 37 ◦C v temi. Standardni medij je bil za 90 minut nadomeščen s 100 µL (razredčenje 1:2=50 µL seruma + 50 µL medija) medija, dopolnjenega s serumom, da se doseže optimalna vrednost fluorescence. Ob koncu inkubacijskega obdobja je bil medij aspiriran in nato izmerjen pri vzbujajoči emisiji z uporabo kompletov filtrov 485 nm in 535 nm v bralniku plošč PerkinElmer Victor X3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, ZDA).

Avtorski prispevki:AR je zasnoval idejo, oblikoval, izvedel raziskavo in napisal rokopis. CGG je izvedel raziskavo in napisal rokopis. RW je pomagal pri odvzemu vzorcev krvi in ​​vodenju kartotek bolnikov. DP je klinični PI, ki je bil zadolžen za zbiranje biovzorcev, vprašalnikov in odobritev IRB. Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.

Financiranje:To delo je podprla Simmaron Research Inc., neprofitna raziskovalna organizacija 501C, Incline Village, NV 89451, kot rezultat sredstev Ramsay Award 2023 za AR pobude Solve ME in Foundation Hesse Sibylla, Quebec, QC, Kanada.

Izjava institucionalnega revizijskega odbora:Noben del tega raziskovalnega članka, vključno s slikami in besedili, ni bil prej objavljen ali reproduciran v nobeni knjigi, članku ali drugi objavljeni literaturi. Slike so originalne in niso kopirane iz drugih virov. To ni klinično preskušanje, temveč institucionalna opazovalna študija. Zbiranje biovzorca, smernice za vprašalnike, vodenje evidenc in ustvarjanje edinstvenih identifikacijskih številk je izvedel Western IRB, protokol #20201812 (trenutni datum obnovitve # 7/21/23).

Izjava o informirani privolitvi:Vsi avtorji so podali soglasje za objavo tega recenzijskega članka.

Izjava o razpoložljivosti podatkov:S tem dokumentom ni povezan noben elektronski podatkovni list. V elektronskem repozitoriju ni podatkov.

Nasprotja interesov:AR, CGG, RW in DP so zaposleni v Simmaron Research INC, neprofitni raziskovalni organizaciji 501C. Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.

Okrajšave

ME/CFS=mialgični encefalomielitis ali sindrom kronične utrujenosti; OI=ortostatska intoleranca; SFN=polinevropatija majhnih vlaken; BH4=tetrahidrobiopterin; eNOS=endotelijska sintaza dušikovega oksida; NE=Dušikov oksid. ROS=Reaktivne kisikove vrste. ME/CFS=mialgični encefalomielitis ali sindrom kronične utrujenosti; OI=ortostatska intoleranca; SFN=polinevropatija majhnih vlaken; BH4=tetrahidrobiopterin; eNOS=endotelijska sintaza dušikovega oksida; NO=dušikov oksid; in ROS=reaktivne kisikove vrste.

Reference

1. Lim, EJ; Ahn, YC; Jang, ES; Lee, JZ; Lee, SH; Son, CG Sistematični pregled in meta-analiza razširjenosti sindroma kronične utrujenosti/mialgičnega encefalomielitisa (CFS/ME). J. Transl. med. 2020, 18, 100. [CrossRef]

2. Sin, C.-G. Pregled razširjenosti kronične utrujenosti po vsem svetu. J. Korean Med. 2012, 33, 25–33.

3. Natelson, BH; Lin, J.-MS; Blate, M.; Khan, S.; Chen, Y.; Unger, ER Fiziološka ocena ortostatske intolerance pri sindromu kronične utrujenosti. J. Transl. med. 2022, 20, 95. [CrossRef]

4. Bateman, L.; Bested, AC; Bonilla, HF; Chheda, BV; Chu, L.; Curtin, JM; Dempsey, TT; Dimmock, ME; Dowell, TG; Felsenstein, D. Mialgični encefalomielitis/sindrom kronične utrujenosti: Osnove diagnoze in zdravljenja. V zbornikih klinike Mayo; Elsevier: Amsterdam, Nizozemska, 2021; str. 2861–2878.

5. Basantsova, NY; Starshinova, AA; Dori, A.; Zinchenko, YS; Yablonskiy, PK; Shoenfeld, Y. Definicija nevropatije majhnih vlaken, diagnoza in zdravljenje. Neurol. Sci. 2019, 40, 1343–1350. [CrossRef]

6. Shoenfeld, Y.; Ryabkova, VA; Scheibenbogen, C.; Branch, L.; Martinez-Lavin, M.; Ikeda, S.; Heidecke, H.; Watad, A.; Bragazzi, NL; Chapman, J. Kompleksni sindromi kronične bolečine, utrujenosti in kognitivnih motenj, povezanih z avtoimunsko disavtonomijo in nevropatijo majhnih vlaken. Clin. Immunol. 2020, 214, 108384. [CrossRef]

7. Leonardi, L.; Adam, C.; Beaudonnet, G.; Beauvais, D.; Cauquil, C.; Ne, A.; Morassi, O.; Benmalek, A.; Trassard, O.; EchanizLaguna, A.; et al. Kožne amiloidne usedline in izguba živčnih vlaken kot označevalci pojava in napredovanja nevropatije pri dedni transtiretinski amiloidozi. EUR. J. Neurol. 2022, 29, 1477–1487. [CrossRef] [PubMed]

8. Ichinose, H.; Nomura, T.; Sumi-Ichinose, C. Presnova tetrahidrobiopterina: njegov pomen pri monoaminergičnih nevronih in nevroloških motnjah. Chem. Rec. 2008, 8, 378–385. [CrossRef] [PubMed]

9. Xia, T.; Gray, DW; Shiman, R. Regulacija fenilalanin hidroksilaze jeter podgan. III. Nadzor katalize s (6R)-tetrahidrobiopterinom in fenilalaninom. J. Biol. Chem. 1994, 269, 24657–24665. [CrossRef]

10. Nagatsu, T.; Nagatsu, I. Tirozin hidroksilaza (TH), njen kofaktor tetrahidrobiopterin (BH4), drugi encimi, povezani s kateholamini, in njihovi človeški geni o zdravilih in genskih terapijah Parkinsonove bolezni (PD): zgodovinski pregled in obeti. J. Neural Transm. 2016, 123, 1255–1278. [CrossRef]

11. Sawada, M.; Sugimoto, T.; Matsuura, S.; Nagatsu, T. (6R)-Tetrahidrobiopterin poveča aktivnost triptofan hidroksilaze v rezinah rafe podgan. J. Neurochem. 1986, 47, 1544–1547. [CrossRef]

12. Chen, D.-D.; Chen, L.-Y.; Xie, J.-B.; Shu, C.; Yang, T.; Zhou, S.; Yuan, H.; Chen, AF Tetrahidrobiopterinska regulacija redoks funkcije eNOS. Curr. Pharm. des. 2014, 20, 3554–3562. [CrossRef] [PubMed]

13. Higashi, Y.; Sasaki, S.; Nakagawa, K.; Kimura, M.; Noma, K.; Hara, K.; Jitsuiki, D.; Goto, C.; Oshima, T.; Chayama, K. Tetrahidrobiopterin izboljša s staranjem povezano okvaro vazodilatacije, odvisne od endotelija, s povečanjem proizvodnje dušikovega oksida. Ateroskleroza 2006, 186, 390–395. [CrossRef]

14. Wang, WZ; Fang, XH; Stephenson, LL; Khiabani, KT; Zamboni, WA Učinki dodatka BH4 po dolgotrajni ishemiji v skeletnih mišicah. Mikrokirurgija 2007, 27, 200–205. [CrossRef]

15. Yang, Y.-M.; Huang, A.; Kaley, G.; Sun, D. Odklop eNOS in endotelna disfunkcija v starih žilah. Am. J. Physiol.-Heart Circ. Physiol. 2009, 297, H1829–H1836. [CrossRef]

16. Karbač, S.; Wenzel, P.; Waisman, A.; Munzel, T.; Daiber, A. Odklop eNOS pri boleznih srca in ožilja - vloga oksidativnega stresa in vnetja. Curr. Pharm. des. 2014, 20, 3579–3594. [CrossRef]

17. Sindler, AL; Delp, MD; Reyes, R.; Wu, G.; Muller-Delp, JM Učinki staranja in telesne vadbe na odklop eNOS v arteriolah odpornosti skeletnih mišic. J. Physiol. 2009, 587, 3885–3897. [CrossRef]

18. Gottschalk, G.; Peterson, D.; Knox, K.; Maynard, M.; Whelan, RJ; Roy, A. Povišan ATG13 v serumu bolnikov z ME/CFS stimulira odziv na oksidativni stres v celicah mikroglije preko aktivacije receptorja za končne produkte napredne glikacije (RAGE). Mol. Celica. Neurosci. 2022, 120, 103731. [CrossRef] [PubMed]

19. Blau, N.; Thony, B.; Spada, M.; Ponzone, A. Tetrahidrobiopterin in podedovane hiperfenilalaninemije. Turk. J. Pediatr. 1996, 38, 19–35. [PubMed]

20. Birnbacher, R.; Scheibenreiter, S.; Blau, N.; Bieglmayer, C.; Frisch, H.; Waldhauser, F. Hiperprolaktinemija, orodje za nadzor zdravljenja pomanjkanja tetrahidrobiopterina: Endokrine študije pri prizadeti deklici. Pediatr. Res. 1998, 43, 472–477. [CrossRef]

21. Hyland, K.; Kasim, S.; Egami, K.; Arnold, L.; Jinnah, H. Pomanjkanje tetrahidrobiopterina in izguba dopamina v genetskem mišjem modelu Lesch-Nyhanove bolezni. J. Podedovati. Metab. Dis. 2004, 27, 165–178. [CrossRef]

22. Li, L.; Chen, W.; Rezvan, A.; Jo, H.; Harrison, DG Pomanjkanje tetrahidrobiopterina in odklop sintaze dušikovega oksida prispevata k aterosklerozi, ki jo povzroča moten pretok. Arterioskler. Thromb. Vasc. Biol. 2011, 31, 1547–1554. [CrossRef]

23. Chuaiphichai, S.; Starr, A.; Nandi, M.; Channon, KM; McNeill, E. Pomanjkanje tetrahidrobiopterina v endotelijskih celicah zmanjša vaskularno disfunkcijo in hipotenzijo, ki jo povzroči LPS. Vasc. Pharmacol. 2016, 77, 69–79. [CrossRef] [PubMed]

24. Choi, HJ; Lee, SY; Cho, Y.; Ne, H.; Kim, JZ; Hwang, O. Tetrahidrobiopterin povzroča mitohondrijsko disfunkcijo v dopaminergičnih celicah: posledice za Parkinsonovo bolezen. Neurochem. Int. 2006, 48, 255–262. [CrossRef] [PubMed]

25. Lee, SY; Moon, Y.; Hee Choi, D.; Jin Choi, H.; Hwang, O. Posebna ranljivost podganjih mezencefaličnih dopaminergičnih nevronov za tetrahidrobiopterin: pomen za Parkinsonovo bolezen. Neurobiol. Dis. 2007, 25, 112–120. [CrossRef]

26. Kwak, SS; Suk, J.; Choi, JH; Yang, S.; Kim, JW; Sohn, S.; Chung, JH; Hong, YH; Lee, DH; Ahn, JK; et al. Indukcija avtofagije s pomanjkanjem tetrahidrobiopterina. Avtofagija 2011, 7, 1323–1334. [CrossRef] [PubMed]

27. Porkert, M.; Sher, S.; Reddy, U.; Cheema, F.; Niessner, C.; Kolm, P.; Jones, DP; Hooper, C.; Taylor, WR; Harrison, D.; et al. Tetrahidrobiopterin: novo antihipertenzivno zdravljenje. J. Hum. hipertenzije. 2008, 22, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

28. Channon, K. Tetrahidrobiopterin: Regulator endotelne sintaze dušikovega oksida pri vaskularnih boleznih. Trendi Cardiovasc. med. 2004, 14, 323–327. [CrossRef]

29. Feng, Y.; Feng, Y.; Gu, L.; Liu, P.; Cao, J.; Zhang, S. Kritična vloga presnove tetrahidrobiopterina (BH4) pri spreminjanju radiosenzitivnosti: os BH4/NOS kot angel ali hudič. Spredaj. Oncol. 2021, 11, 720632. [CrossRef]

30. Mandarano, AH; Maja, J.; Giloteaux, L.; Peterson, DL; Maynard, M.; Gottschalk, CG; Hanson, MR Bolniki z mialgičnim encefalomielitisom/sindromom kronične utrujenosti kažejo spremenjeno presnovo celic T in povezave s citokini. J. Clin. Raziskati. 2020, 130, 1491–1505. [CrossRef] [PubMed]

Zavrnitev odgovornosti/opomba založnika:Izjave, mnenja in podatki, vsebovani v vseh publikacijah, so izključno last posameznih avtorjev in sodelavcev in ne MDPI in/ali urednikov. MDPI in/ali urednik(-i) zavračajo odgovornost za kakršne koli poškodbe ljudi ali premoženja, ki so posledica kakršnih koli idej, metod, navodil ali izdelkov, navedenih v vsebini.

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】