Določanje ehinakozida v vodnem izvlečku Cistanche Herba s HPLC

XU Shanshan1 ,WU Kangyu2 ,TU Xingming2 （1. Tretja klinična medicinska fakulteta Univerze kitajske medicine Guangzhou, Guangzhou 510405 Guangdong, Kitajska; 2. Tretja pridružena bolnišnica Univerze kitajske medicine Guangzhou,Guangzhou 510378 Guangdong,Kitajska） 

Povzetek: Cilj Za določanje je bila vzpostavljena metoda HPLCEhinakozidv vodnem izvlečku Cistanche deserticola. MetodeEhinakozid smo določili s HPLC. Ločitev je bila izvedena na Inertsil ODSSP C18 kolona z mobilno fazo je bila sestavljena iz acetonitrila（A）in 0.4-odstotna raztopina fosforne kisline（B）,z gradientno elucijo. Valovna dolžina detekcije je bila nastavljena na 333 nm,in temperatura kolone je bila 30 stopinje. Hitrost pretoka je bila 1,0 ml·min-1 in volumen injekcije je bil 10 μL.RezultatiLinearno razmerje ehinakozida v območju koncentracije 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 bila dobra（r = 0.999 8）. Izterjava je bila 94,59 odstotka -105.31 odstotka（RSD= 2,93 odstotka,n = 9）. Vsebnost ehinakozida v vodnih izvlečkih Cistanche herba je bila 15,527,7.347,12,267 mg·g-1 . 

Zaključek: Uveljavljena metoda HPLC z dobro ponovljivostjo je natančna,preprosto in izvedljivo. Primeren je za določanje ehinakozida v vodnem izvlečkuCistanche deserticola ma. 

Ključne besede:HPLC;vodni izvlečekCistanche deserticola;Ehinakozid;določitev vsebine

Cistanche deserticolaje pogosto uporabljen tonik v tradicionalni kitajski medicini v klinični praksi in ima sloves "puščavski ginseng". Cistanche deserticola, vključena v izdajo Kitajske farmakopeje iz leta 2015, je posušeno, luskasto, mesnato steblo rastline Orobaceae Cistanche deserticola YC Ma ali Cistanche tubulosa (Schenk) Wright. Je tople narave, sladkega in slanega okusa ter spada v meridiane ledvic in debelega črevesa. Ima učinke tonifikacije ledvičnega janga, blagodejno vpliva na esenco in kri, vlaži črevesje in lajša zaprtje. [2]. 

Puščavski ginseng

"Shennong Materia Medica Classic" navaja, da lahko "nahrani sredino, nahrani pet notranjih organov ter okrepi jin in nahrani esenco".Cistanche deserticola vsebuje predvsem feniletanoidne glikozide, iridoide in glikozide, lignane in glikozide, polisaharide, estre in alkaloide [3].Feniletanolni glikozidiso glavne aktivne sestavineCistanche deserticola, med katerimi sta echinacea in poolside indikatorski komponenti za identifikacijo in določanje vsebnosti Cistanche deserticola v kitajski farmakopeji. 

Feniletanol glikozid je glavna aktivna sestavina Cistanche deserticola

Farmakološke študije [4] kažejo, da Cistanche deserticolaima različne farmakološke učinke, kot so vlaženje črevesja in lajšanje zaprtja, ščiti jetra, upira se osteoporozi, deluje antioksidativno, proti staranju in proti utrujenosti. Vodni izvleček izCistanche deserticolalahko spodbuja gene kostnega morfogenetskega proteina 2 osteoblastov pri podganah, kot tudi na tartrat odporno kislo fosfatazo in osteokalcin v serumu ovariektomiranih miši, kot tudi geni Smad1 in Smad5 ter transformirajoči rastni faktorji v kostnem mozgu - Izražanje itd. imaučinek proti osteoporozi [5-6]. Ehinozid lahko spodbuja proliferacijo osteoblastov in spodbuja diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic kostnega mozga v osteoblaste in vitro[7-9]. 

Ehinozid, glavna kemična sestavina Cistanche deserticola

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Natural Cistanche Echinacoside

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

V zadnjih letih je bilo objavljenih veliko poročil o določanju vsebnosti ehinakozida in poolside v alkoholnem izvlečku Cistanche deserticola in njegovih sestavljenih pripravkih [10-12], malo pa je poročil o določanju vsebnosti indikatorske komponente v vodnem izvlečku Cistanche deserticola. V tej študiji je bila uporabljena tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) za določanje vsebnosti ehinakozida v vodnem izvlečku Cistanche deserticola.

1. Material

1.1 Naprava

LC-20AT tekočinska kromatografija visoke ločljivosti, SPD-20A detektor, SIL-20Avtomatski vzorčevalec, CTO-10ASvp temperaturna škatla kolone, LCsolution delovna postaja za tekočinsko kromatografijo, Shimadzu Corporation Japonske; Elektronska analitična tehtnica MES125P-OCE-DU, Sartorius, Nemčija; SHZ-D (III) večnamenska vakuumska črpalka s krožečo vodo, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd;

1.2RC2BSO25 hladilni obtočni sistem rotacijskega uparjalnika, rotacijski uparjalnik RV10DS96, IKA, Nemčija; DK-S26 električna termostatska vodna kopel, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; Stroj za ultra čisto vodo serije UPR, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Medicinski materiali in reagenti

Medicinski material Meat Rong, kupljen pri Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., številka serije: 18010011806001, 181001. Posušena, luskasta, mesnata stebla rastline Leobaceae Cistanche deserticola, ki jih je identificiral glavni kitajski zeliščar Tu Xingming iz tretjega pridruženega združenja Bolnišnica Univerze tradicionalne kitajske medicine Guangzhou so shranjeni v sobi za inšpekcijo zdravil tretje pridružene bolnišnice Univerze tradicionalne kitajske medicine Guangzhou; Referenčna snov ehinozid, vsebnost 89,7 odstotka, Kitajski inštitut za nadzor hrane in zdravil, številka serije: 111670-201706; Acetonitril je kromatografsko čist (Merck, Nemčija); Metanol in fosforna kislina sta analitsko čista (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); Voda je ultra čista voda.

2. Metode in rezultati

2.1 Priprava vodnega izvlečka iz Cistanche deserticola

Vzemitecistanche v prahu, dodajte 10-kratno količino destilirane vode, segrejte in refluktirajte, da ekstrahirate dvakrat, vsakič 1 uro. Filtrirajte, združite filtrat in z rotacijskim uparjalnikom koncentrirajte filtrat do vsebnosti surovega zdravila 0.100 g · mL-1. Shranjujte pri 4 stopinjah za stanje pripravljenosti. 2.2 Kromatografski pogoji in primernost sistema Kromatografska kolona: kolona InertsilODS SPC18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm）); mobilna faza: acetonitril (A) - 0.4-odstotna raztopina fosforne kisline (B), gradientna elucija: 0~ 5 min, 17 odstotkov A; 5 ~ 25 minut, 20 odstotkov A; 25 ~ 30 minut, 17 odstotkov A; Valovna dolžina zaznavanja: 333 nm; Temperatura kolone: ​​30 stopinj; Hitrost pretoka: 1,0 ml · min -1; Volumen vbrizganja: 10 μ L. Pod tem kromatografskim pogojem je ločljivost med vrhovi ehinaceje in sosednjih komponent večja od 1,5, teoretično število stolpcev za vrhove ehinaceje pa ne sme biti manjše od 4000. Kromatogram je prikazan na sliki 1.

Slika 1 Kromatogrami HPLC ehinakozida（A） in vodnega izvlečka Cistanche herba（B）

2.3 Priprava raztopine

2.3.1 Referenčna raztopina

Odtehtajte ustrezno količinoehinacetinreferenčno snov, jo natančno stehtajte, postavite v 10 ml merilno bučko, dodajte metanol, da se raztopi, in zagotovite, da vsebuje 898,794 ehinacetina na mililiter μG referenčne raztopine, shranjeno pri 4 stopinjah v stanju pripravljenosti.

Ehinozid Cistanche deserticola

2.3.2 Preskusna raztopina

Natančno odmerite 2.0 mL vodnega ekstrakta Cistanche deserticola, odparite v vodni kopeli, raztopite v metanolu, dovedite do konstantne prostornine v 10 mL merilni bučki, dobro pretresite, 0,22 μM mikroporozna membransko filtracijo, namreč.

2.4 Preiskava linearne povezave

Natančno izmerite {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2,50, in 3.00 mL referenčne raztopine pod 2.3.1 in ju prenesemo v 5 ml merilno bučko, dodamo metanol do konstantne prostornine in dobro pretresemo, da dobimo gradientne koncentracije 44,9397, 89,8794, 179,7588, 359,5176, 449,3970 , in 539,2764 μG · mL-1 referenčne raztopine, 0,22 μM filtracija z mikroporozno membrano. Izvedite določanje v skladu s kromatografskimi pogoji v 2.2 in zabeležite površino vrha. Z uporabo masne koncentracije referenčne snovi kot abscise (X, μ G · mL-1) je površina vrha ordinata (Y) in dobimo enačbo linearne regresije: Y=13185. 0X-32273.0, r=0.9998. Rezultati so pokazali, da je ehinaceja v razponu od 44,9397 do 539,2764 μ. Linearno razmerje v območju koncentracije g · mL-1 je dobro.

2.5 Preskus natančnosti

Vzemite 539,2764 μG · mL-1 referenčne raztopine, neprekinjeno 6-krat injicirajte vzorec v skladu s kromatografskimi pogoji v 2.2 in zabeležite površino vrha. Rezultati RSD površine vrha ehinaceje je bil 1,81 odstotka, kar kaže na dobro natančnost instrumenta.

2.6 Preskus stabilnosti

Natančno izmerite 2.0 mlCistanche deserticolavodnega ekstrakta odparite do suhega v vodni kopeli, raztopite v metanolu, dovedite do konstantnega volumna v 10 ml merilni bučki, dobro pretresite, 0.22 μ Filter z mikroporozno membrano, vbrizgajte vzorce za določanje po 0, 2, 4, 8, 12 in 24 urah v skladu s kromatografskimi pogoji v 2.2 in zabeležite površino vrha. Rezultati RSD površine vrha ehinaceje je bil 1,16 odstotka, kar kaže, da je imela preskusna raztopina dobro stabilnost v 24 urah.

2.7 Preskus ponovljivosti

Natančno odmerite 6 obrokov po 2.0 ml vodne raztopineizvleček Cistanche deserticola, vzporedno pripravite 6 obrokov preskusne raztopine v skladu z metodo, opisano v 2.3.2, vbrizgajte vzorce za določanje v skladu s kromatografskimi pogoji, opisanimi v 2.2, in zabeležite površino vrha. Rezultati RSD masne koncentracije ehinaceje je bil 1,28 odstotka, kar kaže na dobro ponovljivost metode.

Poskus Cistanche deserticola

2.8 Preizkus obnovitve dodatka vzorca

Natančno odmerite 9 obrokov po 1.0 mlCistanche deserticolavodnega ekstrakta, dodajte {{0}}.8, 1.0 in 1,2 mL referenčne raztopine (101,552 mg · mL - 1), odparite v vodni kopeli, raztopite v metanol in dopolnite do oznake v ml merilni bučki; Dobro pretresite, 0,22 μ filter z m mikroporozno filtrirno membrano pripravite preskusno raztopino z visoko, srednjo in nizko koncentracijo. Pripravite 3 dele vsake koncentracije vzporedno, izmerite v skladu s kromatografskimi pogoji v 2.2, zabeležite površino vrha in izračunajte okrevanje vzorca od odvisnosti. Rezultati so prikazani v tabeli 1.

2.9 Določitev vsebnosti vzorca

Natančno odmerite 3 porcije po 2.0mLvodni izvleček iz Cistanche deserticola, odparimo do suhega v vodni kopeli, raztopimo v metanolu, dovedemo do konstantnega volumna v 10mL merilni bučki, dobro pretresemo, 0,22 μ Filter z mikroporozno membrano, merimo v skladu s kromatografskimi pogoji v 2.2, zabeležite površino vrha in izračunajte vsebnost ehinaceje. Rezultati so prikazani v tabeli 2.

Tabela 1 Rezultati testov izkoristka ehinakozida

Tabela 2 Rezultati določanja vsebnosti ehinakozida v vodnem izvlečku navadnega lubadarja

3.Diskusija

3.1 Metoda priprave preskusnega izdelka

Vodni izvleček izCistanche deserticolavsebuje različne kemične sestavine, kot so fenil etanol glikozidi in polisaharidi, ki povzročajo določene motnje pri testiranih komponentah. Ta študija je preučevala dve različni koncentraciji topil, 50-odstotni metanol in metanol. Rezultati so pokazali, da je bil učinek ločevanja vrhov v kromatogramu preskusnega produkta z uporabo 50-odstotnega metanola kot topila slab med ehinacejo in sosednjimi komponentami; Z uporabo metanola kot topila je ločljivost vrha glikozida ehinaceje dobra in ni motenj drugih vrhov nečistoč. Zato je bil kot topilo za preskusno raztopino izbran metanol. Z uporabo metanola kot topila smo vodni ekstrakt Cistanche deserticola uparili do suhega v vodni kopeli. Uporabljeni sta bili dve metodi obdelave: raztapljanje metanola, stresanje s konstantnim volumnom in ultrazvočno (10 min) raztapljanje metanola. Rezultati so pokazali, da med obema metodama ni pomembne razlike. Ta metoda je bila izbrana za pripravo testne raztopine zaradi preprostega postopka raztapljanja metanola in stalnega volumskega stresanja.

kitajsko zelišče cistanche

3.2 Izbira mobilne faze

V tej študiji se je sklicevala na mobilno fazo (metanol-0.1 % mravljinčne kisline), uporabljeno za določanje vsebnosti Cistanche deserticola v kitajski farmakopeji (zvezek I) (2015). Rezultati so pokazali, da se je vrh glikozida ehinaceje razširil in da je prišlo do pojava vodilnega roba, kar je lahko povezano s šibko sposobnostjo eluiranja mobilne faze; Glede na ustrezno literaturo [12-13] je bil kot mobilna faza uporabljen acetonitril-0.5-odstotna ocetna kislina, vendar je bila oblika vrha ehinaceje slaba in prišlo je do pojava repa. Glede na pH-vrednost mobilne faze smo kot mobilno fazo na koncu uporabili acetonitril-0.4 odstotno fosforno kislino. Posledično je bilo teoretično število vrhov ehinaceje na plošči večje od 4000, ločljivost med vrhovi ehinaceje in sosednjih komponent pa je bila večja od 1,5. Oblika vrha je bila simetrična, brez motenj zaradi vrhov nečistoč, osnovna linija pa je bila stabilna. Zato smo v tej študiji kot kromatografsko mobilno fazo za določanje vsebnosti ehinaceje uporabili acetonitril - 0.4-odstotno fosforno kislino. V tej študiji,z metodo HPLC smo določili ehinacejo v vodnem izvlečku Cistanche deserticola.

Cistanche ekstrakt v prahu

Metoda je preprosta, natančna in ponovljiva. Primeren je za določanje ehinaceje v vodnem izvlečku cistanche deserticola in se lahko uporablja kot metoda za nadzor kakovosti vodnega izvlečka cistanche deserticola.Ta študija je določila le vsebnost ehinaceje v vodnem izvlečku Cistanche deserticola.V prihodnosti,Predvidena je določitev vsebnosti ehinaceje v sestavljenem prevretku Cistanche deserticola za raziskovanje vpliva različnih dejavnikov na vsebnost ehinaceje, ki bo referenca za kontrolo kakovosti prevretka, ki vsebuje Cistanche deserticola.

referenca:

[1] Zhong Ping Puščavski ginseng in cistanche [J] Forest and Human Beings, 2004, 24 (11): 25

[2] Farmakopeja Nacionalne farmakopejske komisije Ljudske republike Kitajske (I. del) [M] Peking: China Medical Science and Technology Press, 2015:135-136

[3] Chen Fei, Chen Zhuo, Xing Xuefei et al. Napredek raziskav pri Cistanche deserticola [J] Drug Evaluation Study, 2013, 36 (6): 469-475

[4] Fang Jian Napredek v farmakoloških raziskavah Cistanche deserticola [J] Guangming Traditional Chinese Medicine, 2017, 32 (14): 2140 - 2142

[5] Xing Xiaoxu, Liu Zhongjie, Han Bo Vpliv vodnega izvlečka cistanche deserticola na ekspresijo gena kostnega morfogenetskega proteina 2 v osteoblastih podgan [J] China AnimalHusbandry and Veterinary Medicine, 2013, 40 (1): 17-21

[6] LIANG H, YU F, TONG Z, et al. Vodni izvleček rastline Cistanches herba vpliva na raven ekspresije BGP in TRAP v serumu Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA in TIEG1 mRNA pri bolezni osteoporoze [J]. Molecular Biology Reports, 2013, 40 (2）:757-763.

[7] Fang Hailin, Li Junkao, Yao Senming, et al Observation on Echinoside Promoting Proliferation Osteoblast Rat By Activating ERK/BMP-2 Signal Pathway [J] Grassroots Medical Forum, 2015, 19 (4): {{5 }}

[8] Študija Tian Yuan o diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic kostnega mozga v osteoblaste, inducirane z ehinazidom, in njegov mehanizem [D] Shenyang: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2015

[9] Wei Dawei, Ge Ziyu, Liu Yihan itd. Študija o diferenciaciji mezenhimskih izvornih celic kostnega mozga v osteoblaste, ki jo povzroča ehinozid [J] Farmakologija in klinika tradicionalne kitajske medicine, 2017, 33 (2): 48-52

[10] Tian Yubiao, Yang Guang'an, Huang Weijie et al. Določanje ehinozida in pilozida v mikroprahu Cistanche deserticola s HPLC [J] Kmetijska univerza Anhui, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Yang Sude, Hu Junhua, Li Jiachun et al. Hkratno določanje ehinozida, pilozida in izopilozida v kapsulah skupnega glikozida Cistanche s HPLC [J] Svetovna znanost in tehnologija – Posodobitev tradicionalne kitajske medicine, 2015, 17 (3) : 609-613

[12] Xu Xiaoxue Farmakodinamične in metabonomske študije o učinkih Cistanche deserticola proti osteoporozi in njenih učinkovitih sestavin [D] Yinchuan: Ningxia Medical University, 2017

[13] Yan Yao, Meng Xinyuan, Xu Huanhuan et al. Določanje ehinozida in pilozida v oralni tekočini Qirong Runchang s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti [J] Journal of Xinjiang Medical University, 2018, 41 (7): 886-888892