Dodatek arzena v prehrani povzroči oksidativni stres z zaviranjem jedrskega faktorja eritroidnega 2-povezanega faktorja 2 v jetrih in ledvicah kokoši nesnic

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

POVZETEK

Ta študija je preučevala učinke prehranskih dodatkov arzena na nesnost, kakovost jajc, histopatologijo jeter in ledvic ter oksidativni stres v jetrih inledvice kokoši nesnic. Poleg tega je bila raziskana pot proteina 1 (Keap1), povezanega z jedrskim faktorjem eritroidnega {{0}} faktorja 2 (Nrf2)-podobnega ECH, da bi razkrili molekularni mehanizem stresa. Petsto dvanajst 40-tednov starih kokoši nesnic Hyline White je bilo naključno razdeljenih v 4 skupine z 8 ogradami na skupino in 16 kokošimi na ogrado. Odmerki arzena, dani 4 skupinam, so bili 0.95, 20.78, 40.67 in 60.25 mg/kg. Rezultati so pokazali, da je prehransko dopolnilo arzena znatno zmanjšalo proizvodnjo jajčec (P, 0.05), povprečno težo jajc (P, 0,05), Haughove enote (P, 0,05), višino beljakovin (P, 0,05) in trdnost jajčne lupine (P, 0,05). Dodatek arzena v prehrani je povzročil tudi kopičenje arzena in histopatološke poškodbe v jetrih inledvica. V skladu s tem so prehranski dodatki arzena znatno povečali serumsko alanin aminotransferazo (P, {{0}}.05), aspartat aminotransferazo (P, 0.05) , ravni dušika sečnine v krvi (P, {{10}}.05) in ravni sečne kisline (P, 0.05). Po izpostavljenosti arzenu so bile aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) (P 0,05), katalaze (P 0,01), glutation reduktaze (P 0,05), glutation peroksidaze (P 0,05) in vsebnost glutationa (P 0,05). pomembno zmanjšala, medtem ko je bila raven malondialdehida značilno povečana (P, 0,05) v jetrih in ledvicah. Pojavile so se pozitivne korelacije med aktivnostmi antioksidativnih encimov in ekspresijo genov antioksidativnih encimov v jetrih in ledvicah, razen pri ekspresiji genov za mangan superoksid dismutazo v ledvicah in aktivnosti SOD. Poleg tega je bila jetrna in ledvična ekspresija mRNA Nrf2 pozitivno povezana z ekspresijo antioksidantnega gena in negativno korelirana z ekspresijo mRNA Keap1. Če povzamemo, prehranski dodatek arzena je povzročil oksidativni stres z zaviranjem poti Nrf2-Keap1 v jetrih in ledvicah kokoši nesnic.

Ključne besede:arzen, kokoš nesnica, pot Nrf2-Keap1, oksidativni stres, ledvice

UVOD

V zadnjih letih je bilo ugotovljeno, da se nevarnosti za okolje pojavljajo v naraščajočih koncentracijah. Arzen je zelo metaloidni toksikant, tudi v zelo nizki koncentraciji v krmi za perutnino. Njegova fiziološka vloga pri perutnini je dobro opredeljena, saj je potreben za sintezo metabolitov metionina, vključno s cisteinom. Priporočene koncentracije arzena v krmi za perutnino so med {{0}}.012 in 0,050 mg/kg (Balo s in sod., 2019). Vendar je prejšnja preiskava pokazala, da koncentracije arzena v perutninski krmi verjetno presegajo ravni tolerance živali, če perutninska krma vsebuje morske alge, bakrov karbonat, bakrov sulfat pentahidrat, dibakrov klorid trihidroksid ali železov karbonat (Adamse et al., 2017). . Kazi idr. (2013) poročajo, da obstaja velika verjetnost, da arzen v krmi za perutnino vpliva na zdravje pitovnih piščancev. Prevelike količine arzena v krmi za perutnino in njegovi toksikološki učinki na perutnino so še vedno resni problemi. Ko presežek arzena vstopi v žival, lahko povzroči različne škodljive učinke na zdravje, kot so imunotoksičnost, toksičnost za dihala, kardiovaskularna toksičnost, hepatotoksičnost, hepatotoksičnost, nefrotoksičnost, nevrovirulenca, reproduktivna toksičnost in genotoksičnost. Toksikološki učinki arzena na visceralne organe so bili dokumentirani predvsem v študijah na sesalcih, kar kaže na to, da arzen predstavlja tveganje za delovanje jeter in ledvic (Waalkes et al., 2004; Mazumder, 2005; Zheng et al., 2014). Kljub temu so toksikološki učinki izpostavljenosti arzenu v prehrani na jetra in ledvice kokoši nesnic še vedno nejasni. Toksičnost arzena pri živalih je tesno povezana z oksidativnim stresom, ki moti pro/antioksidativno ravnovesje (Flora, 2011). Ko arzen vstopi v celico, se veže z intracelularnim glutationom (GSH) ali ga oksidira, kar povzroči nastanek prostih radikalov. Kot vemo, lahko citoprotektivne gene uravnavajo številni intracelularni transkripcijski faktorji, vključno z jedrnim faktorjem eritroid 2-povezanim faktorjem 2 (Nrf2), aktivatorskim proteinom 1 in jedrnim faktorjem kappa-B (Kwak et al., 2001). ). Transkripcijski faktor Nrf2 je vitalna molekula, ki uravnava raven stresa v celicah. V mirovanju Nrf2 medsebojno deluje s Kelch podobnim ECH-povezanim proteinom 1 (Keap1), ki se večinoma nahaja v citoplazmi. Ko se sproži oksidativni stres, se Nrf2 po ločitvi od molekule Keap1 premakne iz citoplazme v jedro in nato aktivira izražanje citoprotektivnih genov (Motohashi in Yamamoto, 2004). Nato citoprotektivni geni nadalje uravnavajo aktivnosti spodnjih antioksidantnih encimov, vključno s superoksid dismutazo (SOD), glutation reduktazo (GR), glutation peroksidazo (GSH-Px) in katalazo (CAT). Prejšnja študija je pokazala, da transkripcijski faktor Nrf2 sodeluje pri stresu, ki ga povzroča arzen pri sesalcih (Sinha et al., 2013). Vendar natančni učinki izpostavljenosti arzenu na učinke oksidativnega stresa pri kokoših nesnicah ostajajo nedosegljivi. V tej študiji smo raziskali učinek prehranskega dodatka arzena na nesnost, kakovost jajc, serumske biokemične indekse, jetrne in ledvične histopatološke spremembe ter oksidativni stres pri kokoših nesnicah. Poleg tega je bila raziskana pot Nrf2-Keap1 za identifikacijo molekularnega mehanizma v jetrih inledvicekokoši nesnic. Ta študija ponuja nekaj vpogledov v biološko teorijo prehranske toksičnosti arzena v jetrih inledvicakokoši nesnic.

cistanche redditdolajšati bolečine v ledvicah

MATERIALI IN METODE

To študijo je odobril Institucionalni odbor za nego in uporabo živali. Vsi poskusni postopki, izvedeni na živalih, so bili izvedeni v skladu s kitajskim združenjem za laboratorijske živalske vede.

Živali, diete in načrtovanje eksperimentov

Petsto dvanajst {{0}}tednov starih kokoši nesnic Hyline White s podobnimi telesnimi stanji je bilo naključno izbranih in razdeljenih v 4 skupine. Vsaka skupina je vsebovala 8 ponovitev 16 ptic. Arzen je bil dodan osnovni dieti s koruznim fižolom v 4 različnih koncentracijah (0, 20, 40 in 60 mg/kg; v obliki arsanilne kisline) (dodatna tabela 1). Koncentracije arzena v krmi so bile izmerjene z atomsko absorpcijsko spektrometrijo generiranja hidridov po prejšnji metodologiji (Dos Passos et al., 2012). Dejanske koncentracije arzena v 4 skupinah so bile 0,95, 20,78, 40,67 in 60,25 mg/kg. Ptice so bile nameščene v kletkah (60 ! 50 ! 50 cm3), opremljenih z 1 krmilnico in 2 nastavnima napitkoma, v kletko pa sta bili nameščeni 2 kokoši. Skozi celotno poskusno obdobje so imele kokoši prost dostop do krme in pijače. Celoten poskus je trajal 10 tednov, vključno s 1-tedenskim prilagoditvenim obdobjem in 9-tedenskim uradnim poskusnim obdobjem.

Nesnost in kakovost jajc

Skozi celotno poskusno obdobje smo dnevno beležili indekse nesnosti, vključno s porabo krme, proizvodnjo jajčec na dan in maso jajc (EW). Določitve vnosa krme in EW v vsaki skupini so bile izvedene z uporabo občutljive tehtnice (XS2002S, Mettler Toledo, Zürich, Švica). Razmerje pretvorbe krme (FCR) smo izračunali po naslednji formuli: FCR 5 vnos krme v gramih/masa jajc v gramih. Skupno 40 jajc iz vsake skupine je bilo naključno zbranih za merjenje parametrov kakovosti jajc v 24 urah po odlaganju jajc na koncu poskusa. Jajca smo stehtali z občutljivo tehtnico (XS2002S, Mettler Toledo). Nato so bili Haughova enota, višina beljaka, barva rumenjaka in moč jajčne lupine določeni z digitalnim testerjem za jajca (DET6000, Nabel Co. Ltd., Kyoto, Japonska). Debelina jajčne lupine z notranjo membrano je bila določena na ostrem, srednjem in topem delu jajca z uporabo mikrometra s številčnico(547-350, Mitutoyo, Kawasaki, Japonska), srednje vrednosti pa so bile uporabljene za statistično analizo.

Zbirka vzorcev

Po poskusu vzreje je bilo naključno izbranih 32 ptic iz vsake skupine in usmrčenih z rezanjem vratnih žil. Vzorce krvi smo odvzeli v sterilne centrifugalne epruvete in takoj prepeljali v laboratorij za merjenje serumskih biokemičnih indeksov. Nato so bile ptice razrezane, jetra inledviceodstranili iz trebušne votline. Jetra inledvicavzorce smo razrezali na 4 dele. En del je bil takoj fiksiran v 4-odstotnem paraformaldehidu za histopatološko preiskavo. Druge 3 dele smo takoj shranili v tekoči dušik za nadaljnjo določitev parametrov oksidativnega stresa, odlaganja arzena in izražanja genov.

Test usedanja arzena

Po merjenju kakovosti jajc smo rumenjak ločili od beljaka. Kopičenje arzena v beljku in rumenjaku je bilo izmerjeno z atomsko absorpcijsko spektrometrijo hidridne generacije po prejšnji metodologiji (Dos Passos et al., 2012). Kopičenje arzena v celem jajcu smo izračunali tako, da smo sešteli vsebnost arzena v beljaku in rumenjaku. Na podoben način je bila uporabljena atomska absorpcijska spektrometrija za ustvarjanje hidridov za določanje kopičenja arzena v jetrih inledvice kokoši nesnic(Dos Passos et al., 2012).

Določanje biokemičnih indeksov seruma

Ravni skupnih beljakovin, albumina, globulina, alanin aminotransferaze (ALT) in aspartat aminotransferaze (AST) so pomembni indeksi za oceno delovanja jeter. Ti parametri so bili izmerjeni z uporabo ustreznih kompletov za testiranje (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kitajska) v skladu z navodili proizvajalca. Ravni dušika sečnine v krvi (BUN), sečne kisline (UA) in kreatinina (CT) so pomembni indeksi za ocenjevanje delovanja ledvic in so bile določene s kompleti za odkrivanje (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).

Histopatološke spremembe

Tkiva jeter in ledvic, fiksirana v 4-odstotnem paraformaldehidu, so bila dehidrirana v 70-, 80-, 90-, 95- in 100-odstotnem etanolu in na koncu vdelana v parafin. Tkiva so bila narezana na kose debeline 6- mm in nato obarvana s hematoksilinom in eozinom. Nato sledijo opazovanja histopatoloških sprememb v jetrih inledvicatkiva opravil patolog pod optičnim mikroskopom (Olympus, Melville, NY).

Testi lipidne peroksidacije (LPO) in antioksidativne encimske aktivnosti

Aktivnosti SOD, CAT, GR in GSH-Px ter vsebnosti malondialdehida (MDA) in GSH v jetrih in ledvicah so bile določene z ustreznimi kompleti za analizo (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Na kratko, vsebnost MDA smo izmerili s spektrofotometrično metodo, ki temelji na reakciji med tiobarbiturno kislino in MDA (Janero, 1990). Aktivnost GR in vsebnost GSH smo določili z uporabo 5,5- ditiobis(2-nitrobenzojske kisline) (Carlberg in Mannervik, 1985; Abegg et al., 2012). Aktivnost SOD je bila določena glede na inhibitorno reakcijo med redukcijo nitro modrega tetrazolija in ksantin oksidazo. Aktivnost CAT je bila določena na podlagi tvorbe stabilnega vodikovega peroksida amonijevo-molibdatnega kompleksa (Aebi, 1984). Aktivnost GSH-Px je bila določena z vrednotenjem redukcije t-butil hidroperoksida (Wheeler et al., 1990).

Totalna izolacija RNA in kvantitativna PCR v realnem času

Celotno RNA smo izolirali iz jetrnega in ledvičnega tkiva s kompletom Trizol RNAiso (Invitrogen, Carlsbad, CA) po navodilih proizvajalca. Vzorci RNA so bili obratno prepisani v cDNA z uporabo PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, Dalian, Kitajska). Prednji in povratni primerji za manganovo superoksid dismutazo (MnSOD), bakrov-cink superoksid dismutazo (CuZnSOD), CAT, GR, GSH-Px, Nrf2, Keap1 in gospodinjski gen (b-aktin) so prikazani v dodatni tabeli 2. Številčnost genov je bila izmerjena s sistemom StepOnePlus Real-Time PCR (ABI 7500, Applied Biosystems, Foster City, CA). Pogoji cikla so bili 95 C za 30 s, čemur je sledilo 35 ciklov 95 C za 5 s, 59 C za 10 s in 72 C za 30 s. Večkratna razlika v izražanju mRNA je bila izmerjena z metodo relativne kvantifikacije z uporabo učinkovitosti PCR v realnem času in normalizirana na raven b-aktina, da bi primerjali relativne spremembe CT med vsemi skupinami (Livak in Schmittgen, 2001).

Statistične analize

Vsi podatki so izraženi kot povprečje 6 SE. Statistična analiza je bila izvedena z enosmerno ANOVA z uporabo SPSS različice 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Ko so bile razlike med skupinama značilne (označene s P, 0.05), so povprečja primerjali s Tukeyjevo pošteno pomembno razliko za post hoc večkratne primerjave. Pearsonove korelacije so bile analizirane z bivariatno korelacijsko analizo (SPSS različica 20.0, SPSS Inc.). Koeficient signifikantnosti in korelacijski koeficient sta predstavljena kot "p" oziroma "r".

REZULTATI

Nesnost in kakovost jajc V primerjavi s tistimi v skupini z arzenom {{0}}.95 mg/kg sta se proizvodnja jajčec in EW znatno zmanjšala v skupini 6{0.25 mg/ kg arzenove skupine (P, 0.05). Vendar pa arzen v prehrani ni vplival na vnos krme ali FCR (tabela 1). V primerjavi s skupino {{20}},95 mg/kg arzena, se je Haughova enota znatno zmanjšala v skupini 40,67 mg/kg (P, 0,05) in 60,25 mg /kg (P, 0,05) arzenovih skupin. Poleg tega sta se tako višina beljakovin kot trdnost jajčne lupine znatno zmanjšali v skupini z 20,78 mg/kg arzena v primerjavi s skupino z 0,95 mg/kg arzena (P, 0,05), dosegli plato v skupini z 40,67 mg/kg arzena in močno zmanjšali v 60,25 mg/kg skupine arzena (P, 0,05). Prehranski arzen ni vplival na barvo rumenjaka ali debelino jajčne lupine (tabela 1)

Odlaganje arzena

Odlaganje arzena v beljak (P, {{0}}.05), rumenjak (P, 0.05) in celotno jajce (P, 0.05) se je znatno povečalo, ko se je odmerek arzena v prehrani povečal z 0,95 na 60,25 mg/kg (tabela 2). Podobno, ko se je odmerek arzena v prehrani povečal z 0,95 na 60,25 mg/kg, se je odlaganje arzena v jetrih (P, 0,05) in ledvicah (P, 0,05) znatno povečalo (tabela 2)

Korelacijska analiza med kakovostjo jajc in odlaganjem arzena v jajcih

Odlaganje arzena v beljak je bilo negativno povezano s Haughovo enoto (r {{0}}.622, P, 0.{{10}}1), beljak višina (r 5 20.878, P, 0.01) in trdnost jajčne lupine (r 5 20.897, P, 0.{{ 30}}1). Medtem je bilo odlaganje arzena v rumenjaku tudi negativno povezano s Haughovo enoto (r 5 20.654, P, 0,01), višino beljakovin (r 5 20.893, P, 0,01) in trdnost jajčne lupine (r 5 20.902, P, 0,01). Podobno so bile ugotovljene negativne povezave med odlaganjem arzena v celem jajcu in Haughovo enoto (r 5 20.640, P, 0,01), višino beljakovin (r 5 20.888, P, 0,01) in trdnost jajčne lupine (r 5 20.902, P, 0,01) (tabela 3)

Biokemijski indeksi seruma

V primerjavi s tistimi v skupini, ki je prejemala {{0}}.95 mg/kg arzena, so bile ravni ALT znatno povečane v 2{0.78 mg/kg (P, 0.{ {16}}5), 40.67 mg/kg (P 0,05) in 60,25 mg/kg (P 0,05) arzenovih skupin. Medtem so bile ravni AST v skupini, ki je jemala 60,25 mg/kg arzena, znatno povišane v primerjavi s tistimi v skupini, ki je jemala 0,95 mg/kg arzena (P, 0,05). Prehranski arzen ni vplival na skupne ravni beljakovin ali albumina v serumu (tabela 4).

V primerjavi s tistimi v skupini, ki je prejemala {{0}}.95 mg/kg arzena, sta bili ravni BUN in UA znatno povečani v skupini, ki je prejemala 60,25 mg/kg arzena (P, 0,05), medtem ko izpostavljenost arzenu s hrano ni. vplivajo na raven CT v serumu (tabela 4).

Histopatološke spremembe

Videz jetrnega tkiva je bil v skupini z {{0}}.95 mg/kg arzena normalen in nespremenjen. Ko pa se je odmerek arzena v prehrani povečal z 20,78 na 60,25 mg/kg, so proliferacija žolčevodov, steatoza hepatocitov in deformacija centralne vene postali hujši (sliki 1A–1D). Videz ledvičnega tkiva je bil normalen in nespremenjen v skupini z 0,95 mg/kg arzena. Vendar je prišlo do hudega krčenja glomerulov v skupini z 20,78 mg/kg arzena v primerjavi s skupino z 0,95 mg/kg arzena. Ko se je odmerek arzena v prehrani povečal s 40,67 na 60,25 mg/kg, so postali povečani ledvični tubuli, tubularna fibroza in hialinizacija hujši (sliki 1E–1H).

Biomarkerji oksidativnega stresa

V primerjavi s tistimi v skupini, ki je jemala {{0}}.95 mg/kg arzena, so bile ravni MDA v jetrih znatno povečane v skupini, ki je prejemala 6{0.25 mg/kg arzena (P, {{12} }.05) in ledvične ravni MDA so bile znatno povečane pri 20,78 mg/kg (P 0,05), 40,67 mg/kg (P 0,05) in 60,25 mg/kg (P 0,05) arzena skupine (slika 2A). Ravni GSH v jetrih inledvicaznatno zmanjšal v skupini z 20,78 mg/kg arzena v primerjavi s tistimi v skupini z 0,95 mg/kg arzena (P, 0.05). , in dosegel plato v skupinah arzena 40.67 in 60.25 mg/kg (slika 2B). Aktivnost SOD v jetrih se je pomembno zmanjšala v skupinah z arzenom v odmerku 40,67 mg/kg (P, 0,05) in 60,25 mg/kg (P, 0,05) v primerjavi s skupino, ki je prejemala arzen v odmerku 0,95 mg/kg. Ledvična aktivnost SOD se je znatno zmanjšala v skupini z 20,78 mg/kg arzena v primerjavi s skupino z 0,95 mg/kg arzena (P, 0,05) in dosegla plato v skupinah z 40,67 in 60,25 mg/kg arzena (slika 2C). Aktivnost CAT v jetrih inledvicaobčutno zmanjšal, ko se je odmerek arzena v prehrani povečal s {{0}}.95 na 60.25 mg/kg (P, 0.05, slika 2D). V primerjavi s skupino, ki je prejemala 0,95 mg/kg arzena, se je aktivnost GR v jetrih in ledvicah pomembno zmanjšala v skupini, ki je prejemala 60,25 mg/kg arzena (P, 0,05, slika 2E). ). Poleg tega se je v primerjavi s skupino, ki je prejemala 0,95 mg/kg arzena, aktivnost GSH-Px v jetrih znatno zmanjšala v skupini, ki je prejemala 60,25 mg/kg arzena (P, 0,05), aktivnost GSH Px v ledvicah pa se je močno zmanjšala v skupini, ki je prejemala 20,78 mg/kg arzena. (P, 0,05) in dosegel plato v skupinah z arzenom 40,67 in 60,25 mg/kg (slika 2F).

Genske ekspresije antioksidativnih encimov, molekul Nrf2 in Keap1

Izražanje gena CuZnSOD v jetrih se je znatno zmanjšalo v skupini z 20,78 mg/kg arzena v primerjavi s skupino z 0,95 mg/kg arzena (P, 0.{{16} }5) in na ravni v skupinah 40.67 in 60.25 mg/kg arzena. Izražanje gena CuZnSOD v ledvicah se je pomembno zmanjšalo pri 40,67 mg/kg (P , 0.05) in 60,25 mg/kg (P , 0.05) skupine arzena v primerjavi s skupino 0.95 mg/kg arzena (slika 3A). V primerjavi s skupino, ki je jemala 0,95 mg/kg arzena, je bila ekspresija gena MnSOD v jetrih znatno zmanjšana v skupini, ki je jemala 20,78 mg/kg arzena (P, 0.{{73 }}5) in na ravni v skupinah 4{{80}}.67 in 60.25 mg/kg arzena. Ledvična ekspresija gena MnSOD se med skupinami ni pomembno razlikovala (slika 3B). Izražanje gena CAT v jetrih se je znatno zmanjšalo v skupini z 20,78 mg/kg arzena v primerjavi s skupino z {{105}},95 mg/kg arzena (P, 0,05) in doseglo plato v skupinah z arzenom 40,67 in 60,25 mg/kg. Ledvična ekspresija gena CAT se je znatno zmanjšala v skupini z 20,78 mg/kg arzena v primerjavi s skupino z 0,95 mg/kg arzena (P, 0,05) in dosegla plato v skupini z 40,67 mg/kg arzena ter močno zmanjšala v skupini z 60,25 mg/kg skupino z arzenom v primerjavi s skupino z 0,95 mg/kg arzena (P, 0,05, slika 3C). Izražanje gena GR v jetrih in ledvicah se je znatno zmanjšalo v skupini z 20,78 mg/kg arzena v primerjavi s skupino z 0,95 mg/kg arzena (P, 0,05) in doseglo plato v skupinah z 40,67 in 60,25 mg/kg arzena (slika 3D). Poleg tega se je ekspresija gena GSH-Px v jetrih znatno zmanjšala, ko se je odmerek arzena v prehrani povečal z 0,95 na 40,67 mg/kg (P, 0,05) in nato dosegel plato v skupini, ki je prejemala 60,25 mg/kg arzena. Ledvična ekspresija gena GSH-Px se je znatno zmanjšala v skupini z 20,78 mg/kg arzena v primerjavi s skupino z 0,95 mg/kg arzena (P, 0,05) in dosegla plato v skupinah z 40,67 in 60,25 mg/kg arzena (slika 3E). Izražanje gena Nrf2 v jetrih in ledvicah se je znatno zmanjšalo v skupini z 20,78 mg/kg arzena v primerjavi s skupino z 0,95 mg/kg arzena (P, 0,05) in doseglo plato v skupinah z 40,67 in 60,25 mg/kg arzena (sliki 4A in 4C). ). V nasprotju s tem se je izražanje gena Keap1 v jetrih in ledvicah močno povečalo v skupini z 20,78 mg/kg arzena v primerjavi s skupino z 0,95 mg/kg arzena (P, 0,05) in doseglo plato v skupinah z 40,67 in 60,25 mg/kg arzena (slike 4B in 4D).

Korelacijske analize v zvezi s potjo Nrf2- Keap1

Genska ekspresija CuZnSOD (jetra, r {{0}}.613, P, 0,01;ledvica, r {{0}}.687, P , 0.{{10}}1), CAT (jetra, r 5 0.738, P , 0.01; ledvica, r 5 0.903, P , 0.01), GR (jetra, r 5 0.477, P, 0,05; ledvice, r 5 0.485, P, 0,05) in GSH-Px (jetra, r 5 0.450, P, 0,05; ledvice , r 5 0.767, P , 0,01) v jetrih in ledvicah ter genska ekspresija patičnega MnSOD (r 5 0.707, P , 0,01) sta bila v pozitivni korelaciji z aktivnostmi njunih ustreznih antioksidativni encimi. Poleg tega je bila ekspresija gena Nrf2 v pozitivni korelaciji z ekspresijo genov CuZnSOD (jetra, r 5 0.756, P, 0,01;ledvica, r {{0}}.736, P , 0.01), CAT (jetra, r 5 0.893, P , 0,01;ledvica, r {{0}}.740, P , {{10}}.01), GR (jetra, r 5 0 0,837, P, 0,01; ledvice, r 5 0,915, P, 0,01) in GSH-Px (jetra, r 5 0,822, P, 0,01; ledvice, r {{17} }.722, P, 0,01) v jetrih inledvicain izražanje gena MnSOD v jetrih (r {{0}}.720, P, 0,01). Obstajala je negativna korelacija med ekspresijo mRNA Nrf2 in Keap1 (jetra, r 5 20.746, P, 0,01;ledvica, r {{0}}.771, P , 0,01) v jetrih in ledvicah. Poleg tega ni bilo korelacije med ekspresijo gena MnSOD in encimsko aktivnostjo SOD ali ekspresijo mRNA Nrf2 vledvice kokoši nesnic(tabela 5).

DISKUSIJA

Arzen je v naravi vseprisoten in strupen metaloid. Povzroča več toksikoz pri ljudeh in živalih, vključno s hepatotoksičnostjo, nefrotoksičnostjo, nevrovirulentnostjo, imunotoksičnostjo, kardiovaskularno toksičnostjo, hepatotoksičnostjo in reproduktivno toksičnostjo (Mandal in Suzuki, 2002). Arzen najmočneje cilja na reproduktivni sistem živali. Prejšnje študije so pokazale, da izpostavljenost roksarsonu s hrano moti nesnost in proizvodnjo jajc (Chiou et al., 1999; Zhang et al., 2017). V tej študiji je dodatek arzena v prehrani znatno zmanjšal nesnost, vključno s proizvodnjo jajc in EW. Prejšnje študije so pokazale, da prehranski dodatek arzena povzroči kopičenje arzena v jajcih in zmanjša kakovost jajc (Chiou et al., 1998; Zhang et al., 2017). V tej študiji je prehransko dopolnilo arzena znatno zmanjšalo Haughovo enoto, višino beljakovin in moč jajčne lupine. Razen barve rumenjaka in debeline jajčne lupine so bile ugotovljene negativne korelacije med odlaganjem arzena v jajcih in parametri kakovosti jajc. To nakazuje, da lahko odlaganje arzena v jajcu vpliva na Haughovo enoto, višino beljaka in moč jajčne lupine. Kot vemo, je debelina palisadne plasti v jajčni lupini determinanta debeline jajčne lupine (Ruiz in Lunam, 2000), medtem ko odlaganje pigmenta določa barvo rumenjaka. Tako smo ugibali, da prehranski dodatek arzena morda ne bo vplival na debelino palisadne plasti odlaganja pigmenta v jajcih kokoši nesnic. Pojavljajoči se dokazi kažejo, da so jetrne in ledvične motnje pogoste pri sesalcih po izpostavljenosti arzenu (Liu in Waalkes, 2008; Huang et al., 2009). Prejšnja študija je pokazala, da izpostavljenost arzenu povzroči histopatološke lezije v jetrih, vključno z dezorientacijo tkiva, peliozo in vakuolizacijo, ki jo spremljajo karioliza, apoptoza in nekroza hepatocitov v Channa punctatus (Roy in Bhattacharya, 2006). V tej študiji smo opazili hude spremembe v proliferaciji žolčnega voda, steatozo hepatocitov in deformacijo osrednje vene v jetrih, ko se je odmerek arzena v prehrani povečal z 20,78 na 60,25 mg/kg. Roy in Bhattacharya (2006) sta tudi ugotovila, da izpostavljenost arzenu povzroči krčenje glomerulusa, nepravilnosti v ledvičnih tubulih in povečanje Bowmanovega prostora. V tej preiskavi kot odmerek arzena v prehrani

povečal z 20,78 na 60,25 mg/kg, so bile ledvične histopatološke spremembe zelo resne, vključno s povečanjem ledvičnih tubulov, glomerulnim skrčenjem ter tubularno fibrozo in hialinizacijo, kar je skladno s prejšnjo študijo (Roy in Bhattacharya, 2006). Glede na prejšnja poročila je bilo dokazano, da sta ravni AST in ALT v serumu nadomestna označevalca jetrne vnetne reakcije in fifibroze (Wang et al., 2008; Khattab et al., 2015). V tej študiji je povečanje ravni AST in ALT v serumu pomenilo, da se je jetrni vnetni odziv okrepil po izpostavljenosti arzenu, kar je bilo skladno z opaženimi histopatološkimi spremembami v jetrih kokoši nesnic. Patel in Kalia (2013) sta tudi ugotovila, da se z arzenom povzročena hepatotoksičnost kaže z zvišanjem serumskih ravni ALT in AST pri podganah Wistar. Ledvično delovanje se rutinsko spremlja z ravnmi BUN, CT in UA v serumu. Ugotovili smo, da so se serumske ravni BUN in UA znatno povečale, serumska raven CT pa se je po dodatku arzena v prehrani povečevala, kar pomeni, daledvicaodškodnineposledica izpostavljenosti arzenu pri kokoših nesnicah, kar je skladno s prejšnjimi raziskavami (Liu et al., 2000). Ugotovljeno je, da je poškodba tkiva, ki jo povzroči izpostavljenost arzenu, tesno povezana z oksidativnim stresom (Jomova et al., 2011). Ko se sproži oksidativni stres, intracelularne reaktivne kisikove vrste (ROS) inducirajo LPO, kar je mogoče spremljati z znotrajceličnimi nivoji MDA (Storey, 1996). V tej študiji so se jetrne in ledvične ravni MDA znatno povečale po dodatku arzena v prehrani, kar nakazuje, da je prišlo do povečanja LPO, kar je morda kazalo na oksidativno poškodbo jeter inledvice kokoši nesnic.GSH ima tudi pomembno vlogo pri uravnavanju intracelularnega oksidativnega stresa (Finkel in Holbrook, 2000). V primerjavi s tistimi v skupini z 0,95 mg/kg arzena so ravni GSH

so se znatno zmanjšale v skupinah, zdravljenih z višjimi koncentracijami arzena, kar nakazuje, da bi se lahko arzen vezal na GSH in tako zmanjšal antioksidativne sposobnosti jeter inledvica.Flora idr. (1997) so poročali, da izpostavljenost arzenu zmanjša koncentracijo GSH in povzroči izrazite lezije v jetrih inledvicepodgan. Poleg tega imajo znotrajcelični antioksidativni encimski sistemi zaščitne vloge za zaščito pred oksidativnim stresom, vključno s SOD, CAT, GR in GSH-Px (Finkel in Holbrook, 2000). V tej študiji je dodatek arzena v prehrani znatno zmanjšal aktivnosti SOD, CAT, GR in GSH-Px v jetrih in ledvicah kokoši nesnic. Kadar antioksidativni sistemi ne morejo nevtralizirati presežka intracelularnih ROS, pride do oksidativne poškodbe zaradi LPO, ki lahko posledično oslabi aktivnosti antioksidativnih encimov. Prejšnja študija je podobno poročala, da arzen povzroča oksidativni stres v ledvicah podgan (Sener et al., 2016). Antioksidativni encimi so proteini in jih lahko regulirajo geni na transkripcijski ravni. V tej študiji je izpostavljenost arzenu znatno zmanjšala izražanje mRNA CuZnSOD, CAT, GR in GSHPx. Poleg tega je bila ekspresija genov CuZnSOD, CAT, GR in GSH-Px pozitivno povezana z aktivnostmi antioksidativnih encimov, kar pomeni, da je izpostavljenost arzenu zmanjšala aktivnosti antioksidativnih encimov z zaviranjem izražanja mRNA. Podobno so poročali o korelacijah med aktivnostmi antioksidativnih encimov in izražanjem genov v jetrih in ledvicah kokoši nesnic po izpostavljenosti živemu srebru. Vendar prehranski dodatek arzena ni vplival na izražanje MnSOD vledvica.To je morda zato, ker ima SOD več izoencimov in na njegovo aktivnost gen MnSOD ne vpliva. Nrf2 ima ključno vlogo v obrambnem sistemu pred oksidativnim stresom. V bazalnih pogojih se Nrf2 veže na Keap1 v citoplazmi. Ko je znotrajcelična raven ROS dovolj visoka, da spremeni reaktivne tiolne skupine Keap1, se Nrf2 veliko lažje premakne v jedro, kjer draži na antioksidante odzivno

element in nato aktivira spodnje zaščitne gene (Sinha et al., 2013). V tej študiji smo ugotovili, da je izpostavljenost arzenu znatno zmanjšala ekspresijo gena Nrf2 in ekspresijo antioksidativnih encimov na nižji stopnji. Zmanjšana regulacija genov za antioksidativne encime Nrf2 in navzdol po izpostavljenosti arzenu je pokazala, da je arzen zaviral izražanje genov za antioksidativne encime z zaviranjem izražanja genov Nrf2 v jetrih inledvica. Poleg tega je bilo povečanje ekspresije gena Keap1 negativno povezano z ekspresijo gena Nrf2 in antioksidantnega encima, kar nakazuje, da uravnavanje citoplazemskega Keap1 spodbuja translokacijo Nrf2 iz citoplazme v jedro (Kensler et al., 2007). Podobna študija je poročala, da je medcelična pot Nrf2-Keap1 inaktivirana kot odziv na izpostavljenost arzenu (Janasik et al., 2018). Kljub temu je prejšnja študija tudi poročala, da izpostavljenost arzenu izboljša pot Nrf2-Keap1 za zaščito pred oksidativnimi poškodbami (Massrieh et al., 2006). Te ugotovitve niso v nasprotju s to študijo. V zgodnjih fazah oksidativnega stresa se lahko aktivirajo zaščitni učinki Nrf2-Keap1, da se prepreči oksidativni stres. Kljub temu se pot Nrf2-Keap1 morda ne bo uprla oksidativnim poškodbam, ki jih povzroča dolgotrajna izpostavljenost visokim odmerkom arzena (Kensler et al., 2007). Nato je lahko pot Nrf2- Keap1 zavrta, v jetrih in ledvicah kokoši nesnic pa lahko pride do znotrajcelične oksidativne poškodbe ali celo apoptoze. Glede na sedanje rezultate ta študija zagotavlja nekaj novih dokazov za obrambo jeter in ledvic z antioksidanti pri izpostavljenosti arzenu pri kokoših nesnicah in prvič pojasnjuje osrednjo vlogo poti Nrf2-Keap1 pri oksidativnem stresu, ki ga povzroča arzen . Če povzamemo, prehranski dodatek arzena je zmanjšal nesnost in kakovost jajc kokoši nesnic. Histopatološke poškodbe so se pojavile v jetrih inledvicapo izpostavljenosti arzenu v prehrani. Poleg tega je izpostavljenost arzenu v prehrani povzročila jetrni in ledvični oksidativni stres z oslabitvijo poti Nrf2-Keap1 pri kokoših nesnicah.