Ehinakozid inducira apoptotično smrt rakavih celic z zaviranjem encima MTH1 za razkuževanje nukleotidnega bazena

Prvi del Kako ehinakozid zavira apoptozo celic in izboljša spomin

Za več informacij se obrnite na: Ali.ma@wecistanche.com

Povzetek:Zaviranje encima MTH1 za razkuževanje nukleotidnega bazena povzroči obsežne oksidativne poškodbe DNA in apoptozo v rakavih celicah, zato se lahko uporablja kot strategija proti raku. Ker so bili naravni izdelki bogat vir medicinskih kemikalij, smo v tej študiji uporabili encimsko reakcijo, katalizirano z MTH1-, kot visoko zmogljiv in vitro presejalni test za iskanje naravnih spojin, ki lahko zavirajo MTH1.Ehinakozid, spojina, pridobljena iz zdravilnih rastlin Cistanche in Echinacea, je v in vitro testu učinkovito zavirala katalitično aktivnost MTH1. Zdravljenje različnih človeških rakavih celičnih linij zEhinakozidje povzročilo znatno povečanje celične ravni oksidiranega gvanina (8-oksoguanina), medtem ko je raven celične reaktivne kisikove vrste ostala nespremenjena, kar kaže, daEhinakozidzaviral tudi aktivnost celičnega MTH1. PosledičnoEhinakozidzdravljenje je sprožilo takojšnje in dramatično povečanje označevalcev poškodb DNA in uravnavanje zaviralca G1/S-CDK p21, čemur je sledila izrazita apoptotična celična smrt in zaustavitev celičnega cikla pri raku, ne pa tudi pri nerakavih celicah. Skupaj so te študije identificirale naravno spojino kot zaviralec MTH1 in kažejo, da so naravni izdelki lahko pomemben vir učinkovin proti raku.

Ključne besede:Ehinakozid, MTH1, 8-oxoG, poškodba DNK,apoptoza, zaustavitev celičnega cikla.

Kliknite, da Cistanche uporablja za spomin

Uvod

Skupina celičnih in mitohondrijskih nukleozid trifosfatov (NTP) in deoksinukleozid trifosfatov (dNTP) je pomembna tarča različnih reaktivnih kisikovih vrst (ROS).1–3 Ker specifičnost DNA polimeraz ni popolna, je mogoče 4,5 oksidirane dNTP vključijo v novo sintetizirano DNK, da povzročijo genetske aberacije, če niso fiksirane.6 Na primer, glavna oksidirana baza v nukleotidnem bazenu, 8-oksoguanin (8-oxoG), lahko tvori bazni par s citozinom in adeninom. Ko se vstavi v nasprotni adenin med replikacijo DNA, lahko povzroči transverzijo T: A=G: C,7 kar je ena najpogostejših mutacij, ki jih najdemo pri raku pri ljudeh.8,9 Čeprav večina oksidiranih prostih dNTP odstranijo encimi za razkuževanje nukleotidnega bazena, so študije v preteklosti pokazale, da je nukleotidni bazen še vedno pomemben vir oksidiranih baz v molekulah DNK in pomembno prispeva k oksidativnim poškodbam DNK.3,10 Celice sesalcev so oborožene s prefinjenimi obrambnimi mehanizmi, minimizirajo genomske lezije, ki jih povzroči ROS. Encimi za razkuževanje nukleotidnega bazena hidrolizirajo oksidirane dNTP in NTP ter tako preprečijo njihovo vgradnjo v molekule DNK in RNK.11,12 MTH1, član superdružine hidrolaz Nudix (zato se imenuje tudi NUDT1),13 je trifosfataza, odgovorna za odstranjevanje oksidiranih purinskih NTP in dNTP (8-oxodGTP, 2-OH-dATP, 8-OH-GTP in 2-OH-ATP) iz nukleotidnih skupin.14 Od 8-oksoguanina (8-oxoG) je glavna oksidirana baza v celicah, MTH1 je najpomembnejši encim za sanacijo nukleotidnih bazenov.15 Kljub temu je tudi pod nadzorom encimov za saniranje nukleotidnega bazena znaten delež oksidiranih dNTP vgrajene v DNK, baze v molekulah DNK pa lahko neposredno oksidira tudi ROS.6 Celice se nato zanašajo na bolj izdelane strategije, ki vključujejo različne glikozilaze DNK, kot sta OGG1 in MUTYH, in postopke popravljanja DNK, vključno z izrezovanjem baz (BER) in neujemanjem. popravilo (MMR), za popravljanje problematičnih baz v molekulah DNA.10, 16,17 BER in MMR običajno popravljata številne oksidirane baze v DNK na dan in tako igrata pomembno vlogo pri zaščiti celovitosti in stabilnosti genoma.

V celicah, ki so pod povišanim oksidativnim stresom, lahko povečana vključitev oksidiranih nukleotidov v DNK preseže celično sposobnost popravljanja in sproži odziv na poškodbo DNK (DDR).18 Vztrajno signaliziranje DDR bo povzročilo zaustavitev celičnega cikla, prezgodnje celično staranje ali apoptozo, torej postavljajo oviro za nastanek tumorjev.19 Čeprav rakave celice kažejo močno povečano oksidativno napetost in ustvarjajo potencialno smrtonosno breme oksidiranih nukleotidov,20 lahko preživijo z DDR povezano staranje ali apoptozo.21 Veliko študij je pokazalo, da MTH1, z učinkovitim odstranjevanjem nevarno bogatih 8-oxodGTP in 2-OH-dATP v tumorskih celicah igra ključno vlogo pri razvoju raka.22 Ugotovljeno je bilo, da je MTH1 čezmerno izražen pri različnih vrstah raka,23– 25 in 8-oxoG, obseg oksidativnih lezij DNA pa je bil nižji v tumorjih kot v okoliških normalnih tkivih.26–28 Funkcionalno je čezmerna ekspresija MTH1 znatno zmanjšala er mutacij DNK, opaženih v fibroblastih mišjih zarodkov s pomanjkanjem MMR10, in omogočil celicam, da premagajo onkogeno z Ras povzročeno prezgodnje celično staranje in apoptozo;29 medtem ko je supresija MTH1 preprečila razvoj raka pri miših s pomanjkanjem OGG1-30 in spodbudila ROS DDR in celično staranje v Ras-transformiranih celicah.3,29,31 Čeprav ima MTH1 zaščitno vlogo s preprečevanjem mutacij, ki jih povzroči ROS v zdravih celicah, so te študije pokazale, da je MTH1 še posebej potreben za nastanek in preživetje raka celice. Nedavne študije so zagotovile več dokazov v podporo vlogi MTH1 pri razvoju raka.31–34 Supresija MTH1 z RNAi ali zaviralci majhnih molekul v različnih rakavih celičnih linijah je povzročila izrazito povečano vključitev 8-oxodG v genomsko DNA, kar vodi do obsežnih poškodb DNK, apoptotične celične smrti in zmanjšanega preživetja rakavih celic. 32,33 V študijah ksenograftov pri miših je inhibicija MTH1 učinkovito zavirala rast eksplantatov raka. Pomembno je, da zatiranje MTH1 ni vplivalo na rast in preživetje normalnih celic, verjetno zato, ker imajo normalne celice nižji ROS in so zato manj odvisne od MTH1 za preživetje.32,33 Te ugotovitve kažejo, da je inhibicija MTH1 obetavna nova strategija za boj proti raku .

Naravni izdelki so bili bogat vir zdravilnih spojin.35 Številni sodobni terapevtiki, vključno z zdravili proti raku, so bili pridobljeni iz zeliščnih ali botaničnih pripravkov.36–39 Kljub temu ostaja veliko število tradicionalnih zelišč, ki naj bi imela različne terapevtske lastnosti. opisati, predvsem zaradi težav pri nadzoru njihove sestave, da bi nedvoumno opredelili njihovo učinkovitost in mehanizme delovanja.40 Potrebni so novi pristopi, ki omogočajo odkrivanje aktivnih spojin in analizo molekularnih mehanizmov. V zvezi s tem je lahko ciljno vodeno visoko zmogljivo in vitro presejanje ključnega pomena pri iskanju mehanično definiranih zdravilnih spojin iz naravnih virov. V tej študiji smo uporabili encimsko reakcijo, katalizirano z MTH1-, kot visokozmogljiv in vitro test za iskanje naravnih spojin, ki lahko zavirajo MTH1. Presenetljivo je to razkrilo predvajanjeEhinakozid, naravni izdelek, ki je najbolj znan po svoji močni antioksidativni aktivnosti, lahko zavira MTH1.

Materiali in metode

Materiali

Naravne zeliščne spojine so bile kupljene pri Yuanye Biological Technology Co., Šanghaj, Ljudska republika Kitajska. Ime, kataloška številka, številka registra Chemical Abstracts Service (CAS) in čistost vsake spojine so navedeni v tabeli S1. Založne raztopine spojin smo pripravili v 100-odstotnem dimetil sulfoksidu (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ZDA), delovne raztopine pa smo pripravili v testnem pufru ali celotnem mediju celične kulture. Enako raztopino brez preskusne spojine, ki je vsebovala enako količino DMSO, smo uporabili kot kontrolo nosilca. (S)-krizotinib je bil kupljen pri Selleck Chemicals, Houston, TX, ZDA.

In vitro presejanje

In vitro encimski test, uporabljen za presejanje naravnih zeliščnih spojin, je sledil postopkom, ki so jih opisali Gad et al.32 Na kratko, serijske razredčitve posameznih spojin so bile pripravljene v testnem pufru, sestavljenem iz 100 mM Tris- acetat (pH 8.0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg acetat, 0,005 odstotka Tween 20 in 1 mM DTT. Nato smo dodali 0,5 nM rekombinantnega humanega MTH1 (Abcam, Cambridge, UK), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) in 0,2 U/mL anorganske pirofosfataze (Thermo Fisher Scientific) in plošče inkubirali na stresalniku za plošče 1 uro pri sobni temperaturi. Končni reakcijski volumen je bil 100 μL na 96-plošči z vdolbinicami. Na koncu reakcije smo dodali malahitno zeleno (J&K Scientific, Peking, Ljudska republika Kitajska)41 in plošče inkubirali pri sobni temperaturi še 15 minut. Absorbanco pri 630 nm smo izmerili z bralnikom mikroplošč BioRad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, ZDA). Vrednosti inhibitorne koncentracije (IC50) so bile določene z nelinearno regresijsko analizo z uporabo programske opreme GraphPad Prism.

Kultura celic

Človeški osteosarkom MG-63, hepatokarcinom SK-HEP-1, rak dojke MCF7, rak debelega črevesa in danke SW480, embrionalna ledvica HEK293 in celične linije mišjih fibroblastov NIH/3T3 so bile iz ameriške zbirke tipskih kultur in normalne človeške linija jetrnih celic L-O2 je bila kupljena pri KenGen Biotech, Nanjing, Ljudska republika Kitajska. Te celice so vzdrževali pri 37 stopinjah v vlažnem ozračju s 5 odstotki CO2 po navodilih ponudnikov. Institucionalni revizijski odbor za uporabo teh celičnih linij ni zahteval nobene etične izjave.

Merjenje znotrajceličnega 8-oxoG

Znotrajcelične ravni {{0}}oxoG so bile izmerjene z barvanjem s Cy3-konjugiranim avidinom.42 Skupno 1 × 104 celic je bilo zasejanih na okrogel pokrovček v 12-ploščah z jamicami. Naslednji dan smo celice obdelali z 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ali 80 μMEhinakozid5 ur, 12 ur ali 24 ur in jih nato fiksirali z ledeno mrzlim metanolom 20 minuti, čemur je sledila inkubacija v tris-pufrirani fiziološki raztopini (TBS) z 0.1 odstotki Triton X -100 (Sigma-Aldrich) 15 minut. Vzorci so bili blokirani v TBS z 0.1 odstotki Triton X-100 in 15 odstotki fetalnega govejega seruma 1 uro pri sobni temperaturi in nato obarvani s Cy3-konjugiranim avidinom (0,5 ug/ mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, ZDA) v raztopini za blokiranje 1 uro pri 37 stopinjah. Po 3-kratnem 5-minutnem izpiranju v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS) smo pokrovna stekelca zapečatili na stekelcih v nosilnem mediju VECTASHIELD s 4′,6-diamidino-2-fenilindolom (Vector Laboratories, Burlingame, CA , ZDA). Slike so bile posnete in analizirane s konfokalnim mikroskopom Zeiss LCM 510.

Merjenje intracelularnega ROS

Intracelularne ravni ROS so bile izmerjene s pretočno citometrijo z uporabo kompleta za testiranje ROS na osnovi celic (Beyotime Biotechnology, Haimen, Ljudska republika Kitajska). Celice, gojene v ploščah s šestimi jamicami, smo obdelali z 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ali 80 μMEhinakozid5 ur, 12 ur ali 24 ur, dvakrat speremo s PBS in inkubiramo z 10 μM diklorofluorescein diacetatom 30 minut pri 37 stopinjah. Celice smo nato tripsinizirali in analizirali s pretočnim citometrom FACSCaliber (BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA). Znotrajcelične ravni ROS so bile izražene kot povprečna intenzivnost dikloro dihidro fluoresceina fluorescence celic. Prikazane številke so bile povprečja treh neodvisnih poskusov.

Imunofluorescentno barvanje

Celice, gojene na pokrovnih stekelcih, smo obdelali z 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ali 80 μMEhinakozid5 ur, 12 ur ali 24 ur in nato enkrat izperemo s PBS, fiksiramo s 4 odstotki paraformaldehida v PBS za 20 minuti in blokiramo v TBS z 0,1 odstotkom Triton X-100 in 15 odstotki fetalni goveji serum 1 uro pri sobni temperaturi. Fiksne celice smo 2 uri pri sobni temperaturi obarvali s primarnim protitelesom proti 8-oxoG (mišji monoklonski anti-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (kunčji anti-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery , TX, ZDA) ali aktivno kaspazo-3 (zajčja anti-kaspaza-3, Bioss, Peking, Ljudska republika Kitajska), čemur sledi barvanje z Alexa 488-konjugiranim oslovskim antimišjim ( Abcam) ali Cy3-konjugirano kozje anti-kunčje protitelo (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, ZDA) 1 uro pri sobni temperaturi. Po 3-kratnem 5-minutnem izpiranju v PBS smo pokrovna stekelca zapečatili na objektnih stekelcih v pritrdilnem mediju VECTASHIELD z DAPI (Vector Laboratories). Slike so bile posnete s konfokalnim mikroskopom Zeiss LCM 510.

Test nastajanja kolonij

Dan pred obdelavo smo celice zasejali v ploščo s šestimi vdolbinicami v koncentraciji 1×104 celic na vdolbinico. Nato so jih 7 dni zdravili z 0 μM, 60 μM ali 80 μM ehinakozida. Po izpiranju s PBS so bile celice fiksirane z ledeno mrzlim metanolom in obarvane s kristalno vijolično raztopino (Sigma Aldrich) (0,5 odstotka v 25-odstotnem metanolu). Slike so bile fotografirane po sušenju plošč čez noč. Kristalno vijolične kristale smo raztopili z dodatkom 70 odstotkov etanola in absorbanco pri 595 nm smo izmerili z bralnikom mikroplošč BioRad 680. Podatki so bili analizirani s programsko opremo GraphPad Prism.

MTT test

En dan pred zdravljenjem smo celice zasejali v 96-plošče z vdolbinicami v koncentraciji 1×104 celic na vdolbinico, čemur je sledilo zdravljenje s serijskimi razredčinami ehinakozida 24 ur ali 48 ur ali s 60 μM ehinakozida 5 ur , 12 ur ali 24 ur. Medij smo odstranili in celice sprali s PBS, nato pa 20 μL 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,

V vsako vdolbinico smo dodali raztopino 5-difenil tetrazolijevega bromida (MTT) (5 mg/mL v PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific). Plošče smo inkubirali pri 37 stopinjah še 4 ure. Na koncu smo raztopino MTT odstranili in v vsako vdolbino dodali 150 μL DMSO. Plošče smo inkubirali na stresalniku za plošče 10 minut in absorbanco pri 570 nm izmerili z bralnikom mikroplošč BioRad 680. Vsak poskus je bil izveden dvakrat v treh izvodih. Podatki so bili analizirani s programsko opremo GraphPad Prism. Vrednosti IC50 so bile določene z nelinearno regresijsko analizo.

Analiza celičnega cikla

Celice v ploščah s šestimi jamicami so bile 24 ur obdelane z 0 μM, 6{{10}} μM ali 80 μM ehinakozida, pobrane s tripsinom (Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA) , dvakrat izperemo s PBS in nato fiksiramo z ledeno mrzlim etanolom (70 odstotkov) 2 uri pri –20 stopinjah. Fiksirane celice smo dvakrat sprali v hladnem PBS in resuspendirali v 300 μL sveže pripravljenega PBS z 0,1 odstotka Triton X-100, 0,2 mg/ml RNaze A brez DNaze (Sigma Aldrich), 10 ug/mL propidijevega jodida (PI). ) (Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Švica). Po inkubaciji pri 37 stopinjah v temi 20 minut smo celice filtrirali skozi najlonsko mrežico Falcon (BD Biosciences), naložili na pretočni citometer FAC-Calibur in analizirali s programsko opremo ModFit (BD Biosciences).

Analiza fragmentacije DNA

Celice, gojene v ploščah s šestimi jamicami, smo 24 ur obdelovali z 0 μM, 60 μM ali 80 μM ehinakozida in jih 20 minut fiksirali v ledeno mrzlem 4-odstotnem paraformaldehidu (Sigma-Aldrich). Po izpiranju s PBS so bile celice zaprte v VECTASHIELD Mounting Medium z DAPI (Vector Laboratories). Morfologija jedra je bila fotografirana s fluorescentnim mikroskopom Olympus. Za odkrivanje fragmentacije DNK na agaroznih gelih smo DNK ekstrahirali z uporabo QIAamp DNA mikro kompleta (Qiagen NV, Venlo, Nizozemska) in izvedli elektroforezo na 2-odstotnih agaroznih gelih, ki vsebujejo 0,1 ug/mL etidijevega bromida.

Analiza apoptoze s pretočno citometrijo

Apoptotične celice smo pregledali z uporabo kompleta za odkrivanje apoptoze Annexin V-FITC (Best, Šanghaj, Ljudska republika Kitajska) po navodilih proizvajalca. Celice, gojene v 96-ploščah z jamicami, so bile obdelane z 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM ali 160 μM ehinakozida 2 uri, 5 ur, 12 ur ali 24 ur, dvakrat speremo s PBS in nato resuspendiramo v vezavnem pufru. Nato smo zaporedno dodali 5 μL Annexin V-FITC in 5 μL PI (Roche) in celice inkubirali 15 minut v temi pri sobni temperaturi. Celice smo naložili na pretočni citometer FACSCalibur (BD Biosciences) in podatke analizirali s programsko opremo Cell Quest (BD Biosciences).

Western blot analiza

Celice, gojene v ploščah s šestimi jamicami, so bile obdelane z 0 μM, 6{{10}} μM ali 80 μM ehinakozida 5 ur, 12 ur ali 24 ur, dvakrat speremo s PBS in postrgamo s plošče z 100 μL pufra za radioimunoprecipitacijo (150 mM NaCl, 1,0 odstotka IGEPAL CA-630, 0,5 odstotka natrijevega deoksiholata, 0,1 odstotka natrijevega dodecil sulfata in 50 mM Tris, pH 8,0) (Sigma-Aldrich), ki vsebuje 1 mM fenilmetan sulfonil fluorida. Vzorci so bili centrifugirani pri 12,000× g 20 minut pri 4 stopinjah. Koncentracije beljakovin v supernatantih so bile določene z Bradfordovim reagentom (Dingguo, Changchun, Ljudska republika Kitajska). Vzorci so bili denaturirani pri 95 stopinjah 10 minut in ločeni na 12-odstotnem natrijevem dodecil sulfatu-poliakrilamidnem gelu za elektroforezo. Po elektroforezi smo proteine ​​prenesli na membrane iz poliviniliden fluorida (Millipore), čemur je sledilo blokiranje v slanici s tris pufrom s Tweenom 20 (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1 odstotka Tween 20), ki je vseboval 5 odstotkov (m/v) nemastnega mleka 1 uro pri sobni temperaturi. Blote so testirali s primarnimi protitelesi proti p21 (Abcam), poli (ADP-riboza) polimerazi (Bioss) ali aktivirani kaspazi-3 (Bioss), ki so jim sledila sekundarna protitelesa, konjugirana s hrenovo peroksidazo (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Signali so bili razviti z uporabo kompleta za odkrivanje Western blotting izboljšane kemiluminiscence (Trans gen Biotech, Changchun, Ljudska republika Kitajska). Poskuse smo ponovili trikrat.

Merjenje mitohondrijev

membranski potencial

Potencial mitohondrijske membrane smo izmerili z barvilom JC{{0}} (Biotechnology) po navodilih proizvajalca. Celice, gojene v ploščah s šestimi jamicami, smo 5 ur, 12 ur ali 24 ur obdelali z 0 μM, 60 μM ali 80 μM ehinakozida, jih dvakrat sprali v PBS in nato 20 minut inkubirali z JC-1. Slike so bile posnete s fluorescenčnim mikroskopom Olympus.

Statistična analiza

Statistična analiza je bila izvedena s programsko opremo GraphPad Prism. Pomembnost je bila izračunana z enosmerno analizo variance in P0.05 je veljal za statistično značilen. Rezultati so bili izraženi kot povprečje ± standardni odklon.

Rezultati

Identifikacija ehinakozida kot zaviralca MTH1

Za iskanje naravnih spojin, ki lahko zavirajo MTH1, smo uporabili encimsko reakcijo, katalizirano z MTH1-, kot visoko zmogljivo v presejalnem testu Vitro. Poleg oksidiranih purinskih nukleotidov lahko MTH1 hidrolizira tudi običajni deoksigvanozin trifosfat, da ustvari deoksigvanozin monofosfat in pirofosfat. V prisotnosti presežka anorganske pirofosfataze se vsi pirofosfati pretvorijo v anorganske fosfate, ki jih je mogoče kvantificirati s testom absorbance na osnovi malahitnega zelenega41, kar omogoča posredno merjenje aktivnosti MTH1.32 Za testiranje testnega sistema smo najprej izmerili učinek (S)-krizotiniba, spojine z dokazano močjo zaviralca MTH1.33 Rezultat je pokazal, da (S)-krizotinib dejansko močno zavira MTH1 (slika 1A) z IC50 500 nM, kar je bilo sedemkrat višje od poročanega Huber et al (72 nM).33 To je verjetno posledica razlik v metodah odkrivanja ali virih kemikalij in encimov. Sprejeli smo manj občutljiv kromogeni pristop, medtem ko so Huber in drugi uporabili zelo občutljivo bioluminiscenčno metodo.33 Ob upoštevanju tega smo pregledali 12 komercialno dostopnih naravnih spojin (tabela S1), od katerih je vsaka glavna sestavina tradicionalnih zelišč s potencialnim protitumorskim delovanjem. dejavnost. Ehinakozid, spojina, očiščena iz parazitske zdravilne rastline Cistanche salsa (slika 1C), je znatno zaviral reakcijo (slika 1B) z IC50 7,01±2,13 μM (slika 1D). Dodajanje 50-krat več pirofosfataze ni vplivalo na rezultat, medtem ko je dodajanje petkrat več proteina MTH1 občutno zmanjšalo stopnjo inhibicije, kar nakazuje, da je ehinakozid specifično zaviral aktivnost MTH1 v in vitro encimskem testu.

Ehinakozid je zaviral celični MTH1 za povečanje intraceličnega 8-oxoG

Nato smo vprašali, ali lahko ehinakozid zavira znotrajcelično aktivnost MTH1. Inhibicija celičnega MTH1 bo povečala znotrajcelični 8-oxoG. Pokazalo se je, da se avidin veže na 8-oxoG z visoko specifičnostjo;42 zato smo uporabili imunofluorescentno barvanje s Cy3-konjugiranim avidinom za primerjavo znotrajceličnih ravni 8-oxoG v različnih rakavih celičnih linijah pred in po zdravljenju z ehinakozidom. Človeški osteosarkom MG-63, hepatokarcinom SK-HEP-1, rak dojke MCF{{10}} in kolorektalne rakave celice SW480 so bile zdravljene z 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ali 80 μM ehinakozida 5 ur, 12 ur ali 24 ur. Barvanje s Cy3-konjugiranim avidinom je razkrilo, da je 24-urno zdravljenje s 60 µM ehinakozida jasno in pomembno povečalo raven celičnega 8-oxoG (Cy3-avidin reaktivna snov) v teh rakavih celicah ( sliki 2A in B). Višja koncentracija (80 μM) ehinakozida je povzročila močnejše obarvanje celic 8-oxoG (slika 2B), kar kaže na razmerje med odmerkom in odzivom. Podobne rezultate smo dobili z imunofluorescentnim barvanjem z mišjim monoklonskim protitelesom proti-8-oxoG (slika S1A).43 Koncentracija ehinakozida (60 μM), ki je bila potrebna za znatno povečanje celičnega 8-oxoG, je bila veliko višja kot IC50 (7,01 μM) iz testa in vitro. To je verjetno posledica razlike v občutljivosti obeh testov. Imunofluorescentno barvanje je veliko manj občutljivo kot in vitro encimski test; poleg tega na število molekul zaviralcev, ki lahko dosežejo celični MTH1 in sodelujejo z njim, vplivajo kompleksni biološki procesi; poleg tega se v testu in vitro kot substrat uporablja manj priljubljen dGTP, zato je morda lažje (vzeti manj inhibitorjev) zavirati MTH1, kar ima za posledico nižji IC50 v testu in vitro.

Celični {{0}}oxoG ustvarja ROS, ki ga antioksidanti antagonizirajo. Tako bi povečanje celične ROS ali zatiranje aktivnosti antioksidantov povzročilo tudi povečanje celične ravni 8-oxoG. Ehinakozid je sam po sebi močan antioksidant44,45 in bi zato moral okrepiti in ne zavreti aktivnosti antioksidantov. Da bi preverili, ali je bila celična raven ROS spremenjena z zdravljenjem z ehinakozidom, so bile iste rakave celice zdravljene z 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ali 80 μM ehinakozida 5 ur, 12 ur ali 24 ur in nato analizirane s pretokom citometrija po barvanju s fluorescentno sondo 2',7'-diklorofluorescein diacetatom. Rezultati so pokazali, da nobeno od teh zdravljenj ni spremenilo celične ravni ROS (slika 2C in D). Tako je povišana celična raven 8-oxoG najverjetneje posledica zaviranja MTH1 z ehinakozidom.

Ehinakozid je povzročil obsežne poškodbe DNK, zlasti v rakavih celicah. Vključitev {{0}}oxoG v DNK bo spodbudila BER in MMR, ki ustvarjata prekinitve in vrzeli enoverižne DNK (SSB).16,17 Običajno ti prelomi, vrzeli pa se zaprejo z mehanizmi popravljanja, ki vključujejo zapolnjevanje vrzeli in ligacijo s polimerazami in ligazami DNA. 46, 47 Vendar lahko hitro povečanje celičnega SSB nasiči celično sposobnost popravljanja, kar povzroči nastanek številnih prelomov dvojne verige DNA (DSB)18 in DDR signalizacija. Da bi preverili, ali je z ehinakozidom povzročeno povečanje celičnega 8-oxoG povzročilo poškodbe DNK, smo pregledali enega od zgodnjih označevalcev poškodbe DNK, 53BP1, ki se veže na mesta DSB kot najzgodnejši celični odziv na DSB.48 MG -63, SK-HEP-1, MCF-7 in SW480 rakave celične linije in nerakaste celične linije človeška normalna jetra L-O2,49 človeška embrionalna ledvica HEK 293 in mišji fibroblast NIH /3T3 so bili zdravljeni z 0 µM, 15 µM, 30 µM, 60 µM ali 80 µM ehinakozida 5 ur, 12 ur ali 24 ur. Fluorescentno imunsko obarvanje je pokazalo, da je 24-urno zdravljenje s 60 µM ehinakozida posebej povečalo število celic s petimi ali več močno obarvanimi jedrnimi žarišči 53BP1 pri vseh vrstah raka, vendar ne pri nobeni od nerakavih celičnih linij (sliki 2E in F). Znatno povečanje števila celic 53BP1 plus so opazili že 5 ur po začetku zdravljenja z ehinakozidom (slika 2F). Višja koncentracija (80 μM) ehinakozida ali daljši čas zdravljenja (12 ur in 24 ur) je povzročil večje povečanje števila celic 53BP1 plus (slika 2F) in števila celičnih žarišč 53BP1. Ti rezultati skupaj kažejo, da je zaviranje MTH1 z ehinakozidom povzročilo kopičenje 8-okso in obsežne poškodbe DNK pri raku, ne pa tudi v nerakavih celicah.

Ehinakozid je zaviral proliferacijo rakavih celic

V cikličnih celicah bodo nepopravljeni prelomi DNA verig povzročili kolaps replikacijskih vilic DNA, kar bo nato povzročilo blokado celične proliferacije z indukcijo ustavitve celičnega cikla in apoptozo.50 Da bi preverili učinke ehinakozida na celično rast in proliferacijo, smo najprej analiziral rast rakavih celic MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 in SW480, zdravljenih z ehinakozidom, s testom tvorbe kolonij. Rezultati so pokazali, da so rakave celice, zdravljene s 60 µM ali 80 µM ehinakozida, tvorile veliko manj kolonij in kolonije, ki so nastale, so bile veliko manjše (slika 3A in B), kar kaže na močno zavrt potencial rasti. Nato smo analizirali proliferacijo teh rakavih celic, skupaj z nerakastimi celicami L-O2, HEK 293 in NIH/3T3 s testom MTT. Rezultati so pokazali, da je ehinakozid odvisno od odmerka zaviral proliferacijo raka, ne pa tudi nerakavih celic (slika 3C). Študija časovnega poteka rakavih celic, zdravljenih s 60 µM ehinakozida, je pokazala, da po 5 urah ni bilo bistvene razlike med nezdravljenimi in zdravljenimi skupinami, vendar je po 12 urah proliferacijo rakavih celic znatno zaviral 60 µM ehinakozid (slika 3D).

Ustavitev celičnega cikla, ki jo povzroči ehinakozid

V skladu z opazovanji celične rasti in proliferacije je Western blot analiza pokazala, da je 24-urno zdravljenje s 60 μM in 80 μM ehinakozidom znatno povečalo raven beljakovin G1 /blokatorja S-CDK in inhibitorja sinteze DNA p21Cip/ WAF1 v rakavih celicah MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 in SW480 (sliki 4A in B). Poleg tega so, podobno kot pri 53BP1, opazili znatno povečanje ravni proteina p21 že 5 ur po začetku zdravljenja z ehinakozidom (slika 4B). Analiza števila celic na različnih stopnjah celičnega cikla s pretočno citometrijo je pokazala, da je zdravljenje z ehinakozidom odvisno od odmerka zmanjšalo odstotek celic v fazah S in G2/M, medtem ko se je odstotek celic v fazi G1 povečal (slika 4C). in D). Po 24-urnem zdravljenju celic MG-63 z 80 μM ehinakozida se je število celic v fazi G2/M zmanjšalo s 15 odstotkov na skoraj nič, celic v fazi S pa s 37 odstotkov na 17 odstotkov, medtem ko se je število celic v fazi G0/ 1 faza se je povečala s 43 odstotkov na 80 odstotkov (slika 4E). Ti rezultati kažejo, da je zdravljenje z ehinakozidom povzročilo zaustavitev celičnega cikla in blokiralo rakave celice v fazi G1.

Ehinakozid inducira apoptozo v rakavih celicah

V skladu z opažanji o celični proliferaciji je Western blot analiza pokazala, da je 24-urno zdravljenje s 60 μM in 80 μM ehinakozida povečalo ravni aktivne kaspaze-3 in razcepljenih proteinov poli (ADP-riboza) polimeraze v rakave celice (sliki 5A in B), kar kaže na indukcijo od kaspaze odvisne apoptoze. Nato smo pregledali več celičnih markerjev apoptoze. Najprej je bila jedrska morfologija rakavih celic, zdravljenih z ehinakozidom, razkrita z barvanjem z barvilom DNA DAPI, ki je pokazalo, da je 24-urno zdravljenje s 60 μM in 80 μM ehinakozida povečalo število znakov apoptoze, vključno s piknozo in kondenziranim kromatinom (svetlejša jedra). ) (slika 5C). Drugič, DNK, ekstrahirano iz podobno obdelanih rakavih celic, smo analizirali z elektroforezo na agaroznem gelu, ki je razkrila tipičen vzorec apoptotične lestve (slika S1B). Nazadnje je bila celično aktivna kaspaza-3 odkrita z imunofluorescentnim barvanjem, ki je razkrilo močne aktivirane signale kaspaze-3 v rakavih celicah, zdravljenih z ehinakozidom (slika S1C). Nato smo izmerili odstotek apoptotičnih celic z Annexin V-FITC in PI dvojnim barvanjem in pretočno citometrijo. Analiza celic, zdravljenih z 0 µM, 15 µM, 30 µM, 60 µM, 80 µM ali 160 µM ehinakozida 2 uri, 5 ur, 12 ur ali 24 ur, je pokazala, da 60 µM ali višje koncentracije ehinakozida povzročijo pomembno apoptozo pri rakavih celicah MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 in SW480 (slika 6A), vendar ne v nerakavih celicah L-O2, HEK 293 in NIH/3T3 (Slika S2). Po 24-urnem zdravljenju celic MG-63 s 60 μM, 80 μM ali 160 μM ehinakozida se je odstotek apoptotičnih celic povečal z 8,89 odstotka na 33,72 odstotka, 39,01 odstotka oziroma 48,12 odstotka (slika 6A). . Študija časovnega poteka je pokazala, da po 5 urah ni bilo bistvene razlike med skupinami, ki niso bile zdravljene, in skupinami, ki so bile zdravljene, vendar so opazili pomembno apoptozo po 12-urnem zdravljenju s 60 μM ali višjimi koncentracijami ehinakozida (sliki 6B in S3).

Končno je merjenje potenciala mitohondrijske membrane s fluorescenčnim barvilom JC-1 jasno pokazalo izrazito izgubo potenciala mitohondrijske membrane po 12-urnem zdravljenju s 60 μM ehinakozida (slika 6C), vendar ne po 5 urah, kar kaže na aktivacijo notranja pot apoptoze, ki sledi poškodbam DNK, ki jih povzroči povišan 8-oxodG.