Vpliv izvlečkov Cistanche Tubulosa na reproduktivno funkcijo moških pri diabetičnih podganah, ki jih povzroča streptozotocin–nikotinamid-Ⅰ

1. Uvod

Diabetes mellitus (DM) je stanje, pri katerem so povečaneravni glukozev krvi zaradi neučinkovitosti trebušne slinavke pri proizvajanju dovolj insulina ali zaradi nezmožnosti telesa, da bi ga učinkovito uporabljalo. Po podatkih WHO je število ljudi s sladkorno boleznijo naraslo s 108 milijonov leta 1980 na 422 milijonov leta 2014 [1]. Obstajajo štiri glavne kategorije: predsladkorna bolezen (stopnja pred diabetesom), tip 1 (kjer trebušna slinavka ne proizvaja insulina), tip 2 (telo ne uporablja insulina) in gestacijski diabetes (ki se pojavi med nosečnostjo). Oksidativni stres se pojavi zaradi neravnovesja med proizvodnjo reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) in antioksidantov [2], kar končno vodi do sladkorne bolezni. Zapleti sladkorne bolezni vključujejo odpoved ledvic, poškodbe živcev, slepoto, možgansko kap, srčni infarkt, smrt ploda in neplodnost. [1]. Študije kažejo, da so bila jedra semenčic, deoksiribonukleinska kislina (DNK) in mitohondriji znatno poškodovani pri moških s sladkorno boleznijo [3]. Oksidativni stres med transportom sperme bo spremenil proces moškega reproduktivnega sistema [4,5].

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Proces spermatogeneze nadzira hipotalamus-hipofiza-gonadna (HPG) os. Hormon, ki sprošča gonadotropin (GnRH), ki ga proizvaja hipotalamus, spodbuja proizvodnjo luteinizirajočega hormona (LH) in folikle stimulirajočega hormona (FSH). Leydigove celice najdemo ob seminifernem tubulu inproizvajajo testosteronpod nadzorom LH. FSH sproži proizvodnjo antigen-vezavnega proteina (ABP), ki pomaga prenesti moški hormon. Tako neplodnost in druge težave nastanejo predvsem zaradi motenj, ki nastanejo v HPG osi. Dajanje kombinacije streptozotocina in nikotinamida povzroči sladkorno bolezen pri poskusnih podganah. Streptozotocin je kemična spojina, strupena za celice trebušne slinavke, ki proizvajajo inzulin, nikotinamid pa je vodotopen vitamin, ki ščiti celice pred popolno poškodbo [6].

Cistanche tubulosa je vrsta puščavske rastline, znana tudi kot "Rou Cong-Rong" [7]. Je neklorofilna parazitska rastlina, ki raste predvsem na koreninah drevesa Calotropis procera in je široko razširjena v sušni deželi Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolija, Iran in Indija. Splošno ime Cistanche tubulosa je "puščavska hijacinta". Splošno sprejet je v kitajski tradicionalni medicini in je dobil ime "puščavski ginseng". Široko se uporablja v medicini za zdravljenje morbidne levkoreje, obilne metroragije, kroničnih ledvičnih bolezni, zaprtja, impotence in neplodnosti. Kemične sestavineCistanche tubulosa je sestavljen iz nehlapnih feniletanoidnih glikozidov(PHG), iridoidi, lignani, hlapna olja, alditoli, oligosaharidi in polisaharidi [8]. Študije kažejo, daehinakozidiz te rastline ščiti poškodovane fibroblaste z uravnavanjem ravni ROS [9]. Ta spojina deluje antioksidativno, vazorelaksacijsko in protivnetno, skupaj z nevroprotekcijo in preprečevanjem osteoporoze [10,11].

Namen te študije je bil raziskati učinekIzvleček Cistanche tubulosaki vsebuje ECH na reproduktivno disfunkcijo diabetične podgane, ki jo povzroča streptozotocin-nikotinamid.

2. Materiali in metode

2.1. Materiali

ECH in CTE sta bila kupljena pri Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Tajvan). Napredni končni produkti glikacije (AGE) so bili kupljeni pri Biovision (San Francisco, CA, ZDA). Celične linije LC-540 in TM3 so bile kupljene pri Inštitutu za raziskave in razvoj živilske industrije (Hsinchu, Tajvan). Pet tednov stare podganje samce Sprague-Dawley (SD) so kupili pri Nacionalnem laboratorijskem centru za živali (Tajpej, Tajvan). Feed Lab Diet® je bil kupljen pri PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Tajvan). 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) je bil pridobljen pri Sigmi (St. Louis, MO, ZDA). Metanol in 4-(2-hidroksietil)-1-piperazin-etansulfonska kislina (HEPES) sta bila prav tako kupljena pri Sigmi. Dulbeccov modificiran medij Eagle/F12 in tripsin-EDTA sta bila pridobljena pri GIBCO (New York, NY, ZDA). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolijev bromid (MTT), dikloro-dihidro-fluorescein diacetat (DCFH-DA), dimetil sulfoksid (DMSO) in nitromodri tetrazolij (NBT) sta bila kupljena pri Sigmi. Glukozni encimski kompleti so bili pridobljeni iz Kyokutoseiyaku, Tokio, Japonska. Insulin ELISA kompleti so bili kupljeni pri Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Švedska). Reagent za ekstrakcijo tkivnih beljakovin T-PER je bil pridobljen pri Thermo Scientific (Chicago, IL, ZDA). Protičloveški/mišji/podganji jedrski faktor kapa B NF-κB poliklonska protitelesa so bila kupljena pri Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ZDA. Poliklonska protitelesa proti receptorju miši/podgane za napredne končne produkte glikacije (RAGE), poliklonska protitelesa StAR proti človeku/miši/podgani in monoklonska protitelesa proti citokromu P450 17A1 človeka/miši/podgane so bila kupljena pri Gene Tex (Irvine, CA, ZDA). Protičloveška/mišja/podgana poliklonska protitelesa CYP11A1 so bila pridobljena iz Cell Signaling Technology (Beverly, PA, ZDA). Reagent Easy-Blue je bil kupljen pri Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, ZDA). Agaroza in marker DNA 100 bp sta bila pridobljena od Promega, Corporation (Madison, WI, ZDA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit je bil kupljen pri QIAGEN, Hilden, Nemčija.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Metode

2.2.1. Analiza in vitro

LC{{0}} in TM3 celične kulture: LC-540 celične linije so bile gojene pri 37 ◦C v mediju Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), dopolnjenem z natrijevim bikarbonatom (1,5 g/L), L-glutamin (2 mM), neesencialne aminokisline (0.1 mM), natrijev piruvat (1.0 mM) in fetalni goveji serum (FBS) (10 %) v 5% CO2 inkubator (CO2 inkubator, Napco 5410, Tajvan). Celično linijo TM3 smo gojili v Dulbeccovem modificiranem mediju Eagle (DMEM), dopolnjenem z glukozo (4,5 g/L), natrijevim piruvatom (0,5 mM), L-glutaminom (2,5 mM), natrijevim bikarbonatom (1,2 g/L), {{ 28}}(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonska kislina (HEPES, 15 mM) in fetalni telečji serum (FCS, 10 %) ali konjski serum (5 %) pri 37 ◦C v 5 % CO2 inkubator.

Določanje sposobnosti preživetja celicEhinakozid (ECH): 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- reagent difeniltetrazolijev bromid (MTT) je bil uporabljen za test viabilnosti celic. Koncentracijo celic smo prilagodili na 2 × 105 celic / ml v 96-plošči z vdolbinicami. Nato smo dodali 20 µL ECH (razredčenega v 2 % gojišča) in inkubirali 24 ur pri 37 ◦C v inkubatorju s 5 % CO2. Kasneje smo dodali 100 µL reagenta MTT in inkubirali 4 ure pri 37 °C v temnih pogojih. Absorbanco smo izmerili pri 570 nm (bralnik ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Švica).

Relativna viabilnost celic (%)=[(Avzorec pri 570 nm − Prazno pri 570 nm)]/[(Akontrola pri 570 − Prazno pri 570)] × 100.

Test redukcije nitromodrega tetrazolija (NBT) in test 2,2-difenil-1-pikrilhidrazila (DPPH): število celic je bilo prilagojeno na 1 × 1{{10}}6 celic/ mL. Nato smo dodali 5 0 mg/mL ECH, resveratrola (RES) in naprednih končnih produktov glikacije (AGE) (kontrola) in jih sokultivirali 18 ur pri 37 ◦C. Nato smo dodali 0,3 mL raztopine NBT (0,1 mg/mL NBT, 5% FBS in 3% dimetil sulfoksida (DMSO), raztopljenega v 10 mL DMEM) in inkubirali pri 37 ◦C v 5% CO2 1 uro. Po centrifugiranju (pri 800 × g 3 minute) odstranimo supernatant in dodamo 200 µL DMSO ter stresamo 5 minut v ultrazvočnem oscilatorju (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Tajvan). Absorbanca je bila izmerjena pri 630 nm. Za analizo radikalov DPPH je bil kot standard vzet Trolox (v 95 % alkoholu). Nato smo 75 µL 0,5 mM raztopine DPPH zmešali s 25 µL vzorcev in pustili reagirati pri sobni temperaturi v temnem prostoru 30 minut. Zmes smo pretresli in izmerili absorbanco pri 517 nm.

Analiza vsebnosti reaktivnih kisikovih vrst (ROS): število celic je bilo prilagojeno na 2 × 105 celic/ml v 12-plošči z vdolbinicami, ki vsebuje 2 % FBS. Nato smo na ploščo dodali 50 µL/mL ECH, RES in AGEs in inkubirali pri 37 ◦C 24 ur. Po 24 urah smo dodali 20,70 -diklorofluorescein-diacetat (DCFH-DA) in inkubirali pri 37 ◦C 30 minut. Po centrifugiranju (400 × g, 5 min) smo supernatant odstranili in celice dvakrat sprali s fosfatno pufrano fiziološko raztopino (PBS). Nato smo celice suspendirali v 1 ml PBS in določili ravni ROS z uporabo pretočnega citometra (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, ZDA).

Identifikacija in kvantitativna analiza beljakovin: Proteine ​​smo ekstrahirali z uporabo reagenta za ekstrakcijo beljakovin (T-PER). Gostota celic je bila prilagojena na 2 × 105 celic/mL v 12-plošči z vdolbinicami in 50 µL/mL ECH, RES in receptorja za antagonist napredovalega končnega produkta glikacije (RAGE), dodani pa so bili AGE in inkubirani pri 37 ◦C v inkubatorju s 5 % CO2 24 ur. Nato smo dodali 400 µL T-PER, celice postrgali in centrifugirali pri 125,000× g 20 minut (4 ◦C). Supernatant smo zbrali in shranili pri –80 ◦C (zamrzovalnik –80 ◦C, Nuaire, Plymouth, MN, ZDA) za nadaljnjo analizo. Za kvantifikacijo beljakovin je bil uporabljen komplet bicinhoninske kisline (BCA). Nato smo 10 µL standardne celične raztopine in 200 µL reagenta BCA dodali v 8-plošče z vdolbinicami in inkubirali pri 37 ◦C v inkubatorju s 5 % CO2 30 minut. Absorbanca je bila izmerjena pri 562 nm. Analiza identifikacije beljakovin je bila izvedena z elektroforezo natrijevega dodecil sulfata (SDS)-poliakrilamidnega gela (SDS-PAGE). Vzorci so bili pripravljeni z dodajanjem proteinskega lizata pufru za nalaganje beljakovin in izvedena je bila Western blot analiza za odkrivanje specifičnih proteinov.

2.2.2. Analiza in vivo

Načrt živalskega modela: Šestdeset {{0}} tednov starih samcev podgan Sprague–Dawley (SD) je bilo kupljenih pri Nacionalnem laboratorijskem centru za živali (Tajpej, Tajvan). Vsaka podgana je bila posamično nameščena v razkužilnih kletkah iz nerjavečega jekla pri nadzorovani temperaturi (23 ± 1 ◦C) in vlažnosti (40–60 %) z 12-urnim ciklom svetlobe/12-urne teme. Hrana in voda sta bili zagotovljeni ad libitum. Vsaka podgana je bila udomačena v prvem tednu in je kot glavno prehrano dobila laboratorijsko prehrano za glodavce 5001. Vsi postopki so sledili standardu Odbora za institucionalno oskrbo in uporabo živali (IACUC odobritev št. 101026) Nacionalne tajvanske oceanske univerze, Tajvan. Po udomačitvi so bile podgane razdeljene v dve skupini: kontrolno skupino (Con), ki je bila hranjena z laboratorijsko dieto 5001, in diabetično skupino, ki je bila ves poskus hranjena z visoko vsebnostjo maščob (HFD, 40 %). Po 4-tedenskem hranjenju s HFD so podgane s sladkorno boleznijo injicirali streptozotocin (65 mg/kg) (STZ), da bi inducirali diabetes mellitus (DM). V 15 minutah po injiciranju STZ je bil injiciran nikotinamid (230 mg/kg telesne teže). Teden dni po injiciranju je bil opravljen peroralni glukozni tolerančni test (OGTT), da bi ugotovili uspešno indukcijo sladkorne bolezni (DM). Po tem so bile živali razdeljene v šest skupin: kontrolna (krmljena z laboratorijsko dieto 5001); skupina DM (DM + 45% HFD); DMR skupina (DM + rosiglitazon: 0,571 mg/kg TM) + 45 % HFD; skupina DME1 (DM + CTE: 80 mg/kg telesne mase) + 45% HFD; skupina DME2 (DM + CTE: 160 mg/kg telesne mase) + 45 % HFD; in skupina DME4 (DM + CTE: 320 mg/kg TM) + 45 % HFD. Rosiglitazon (RSG) je bil vzet kot pozitivna kontrola. Uporabljeni so bili trije odmerki CTE (80, 160 in 320 mg/kg) v skladu s priporočili Tajvanske agencije za hrano in zdravila (TFDA) za funkcionalno oceno zdrave hrane. Zdravljenje je potekalo do konca poskusa. Vse poskusne podgane so žrtvovali po 6 tednih. Kri, zbrano pri podganah, smo 15 minut centrifugirali pri 3000 obratih na minuto pri 4 °C. Supernatant je bil pregledan za naslednjo analizo:

Določanje skupne glukoze, trigliceridov in holesterola: Določanje glukoze je bilo izvedeno z glukoznimi encimskimi kompleti. Nato smo reagentom dodali 20 µL vzorcev krvne plazme in jih hranili pri 37 ◦C 5 minut. Celotne trigliceride in koncentracijo skupnega holesterola smo določili z uporabo encimskih kompletov za trigliceride in holesterol. Nato smo reagentom dodali 10 µL krvne plazme in izvedli poskus po navodilih proizvajalca. Absorbanco smo izmerili pri 510 nm.

Celotna glukoza/trigliceridi/holesterol v plazmi (mg/dL)=(Avzorec − ABlank)/(Astandard − ABlank) × 200.

Asample: Absorbanca vzorcev krvi, ABlank: Vrednost absorpcije kompletov brez vzorca, Astandard: Vrednost absorpcije standardnega reagenta, 200: standardni reagenti pri koncentraciji 200 mg/dL.

Ocena insulina, leptina in homeostatskega modela – določanje odpornosti proti insulinu (HOMA-IR):Raven inzulina je bila določena z inzulinskim testom ELISA. Tukaj, 25µDodali smo l krvne plazmereagentov, absorbanca pa je bila izmerjena pri 450 nm. Skupno vsebnost leptina smo določili z uporabo aleptinski encimski imunometrični komplet.Potem, 100µL plazme smo analizirali in absorbancosmo izmerili pri 450 nm z uporabo čitalnika ELISA. Celoten poskus je bil izveden v skladu znavodila proizvajalca. Vrednost HOMA-IR je bila določena iz modela homeostazeocenjevalna enačba=Koncentracija inzulina v plazmi na tešče (mg/mL)× glukoze v plazmi na teščekoncentracije (mmol/L)/22,5.

Peroksidacija lipidov v plazmi: tukaj je bilo {{0}}.5 ml krvne plazme zmešano z 1 ml reagenta (15 %, m/v trikloroocetne kisline v 0.25 N klorovodikove kisline (HCl). ) in 0.375 %, m/v tiobarbiturne kisline v 0,25 N HCl) in postavljeno v vodno kopel (vodna kopel, BUCHI 461, Zürich, Švica) pri 100 ◦C za 15 minut. Po ohlajanju smo dodali 1 ml n-butanola, močno pretresli in centrifugirali pri 1500 × g 10 minut. Supernatant smo zbrali in absorbanco izmerili pri 532 nm [12].

Koncentracija malondialdehida (MDA) (nM/mL)=[(Vzorec pri 532 nm − Prazen vzorec pri 532 nm)/ (Standard pri 532 nm − Prazen vzorec pri 532 nm)] × 5.

standard pri 532 nm − prazen pri 532 nm)] × 5. Določanje ravni testosterona in luteinizirajočega hormona (LH) v plazmi: Za merjenje ravni testosterona v krvni plazmi je bil uporabljen komplet testosteron ELISA. Za določanje koncentracije LH smo uporabili komplet RIA. Nato smo dodali 50 µL plazme in izračune temeljili na koncentraciji hormona LH-RP-3 (standard). Nadaljnji koraki so potekali po navodilih proizvajalca.

Določanje koncentracije faktorja tumorske nekroze (TNF) in interlevkina-6 (IL-6): Zajeto protitelo je bilo 250-krat razredčeno v pufru za oblaganje, dodano 96- ploščo z vdolbinicami (100 µL/vdolbinico) in hranite pri 4 ◦C čez noč. Supernatant smo odsesali in petkrat sprali s pralnim pufrom (1-krat PBS, 0,05 % Tween 20). Po inkubaciji (1 h) z 200 µg testnega razredčila smo celice 5-krat sprali s pralnim pufrom in v vsako vdolbino dodali 100 µL TNF-standardne raztopine ali testne vzorce ter inkubirali 2 uri. Po izpiranju smo dodali 100 µL IL-6-detektiranih protiteles in jih inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi. Supernatant smo aspirirali in 5-krat sprali. Nato smo dodali 480 µL encima avidin-hrenova peroksidaza (HRP) in inkubirali 30 minut pri sobni temperaturi. Supernatant smo aspirirali in petkrat sprali s pralnim pufrom. Nato smo dodali 100 µL raztopine substrata in inkubirali 15 minut pri sobni temperaturi. Kasneje smo v vsako vdolbino dodali 50 µL stop raztopine (1M fosforne kisline) in izmerili absorbanco pri 450 nm.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA OBNOVO SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiza parametrov sperme in testisov

Odvzem vzorcev sperme: Odvzem vzorcev sperme je bil izveden v skladu z metodo, ki je bila prej navedena v [13]. Spermo smo zbrali iz supernatanta in uporabili za nadaljnjo analizo.

Število semenčic, gibljivost semenčic in nenormalna semenčica: Število semenčic je bilo izračunano s hemocitometrom in raztopino tripan modrega. Nato smo 100 µL semenčične tekočine zmešali z raztopino tripan modrega in z uporabo hemocitometra in mikroskopa izračunali število semenčic, gibljivost in nenormalno semenčico [14].

Zmanjšanje nitro modrega tetrazolija NBT in lipidne peroksidacije sperme in testisov: Peroksidacijo lipidov in zmanjšanje NBT smo analizirali po istem postopku analize plazme.

Določanje aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) in katalaze: Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) smo analizirali z uporabo kompleta RANSEL. Tukaj je bilo {{0}}.05 mL homogenatov testisov dodanih 1,7 mL reakcijske raztopine (0.05 mM ksantina, 0,025 mM 2-({ {9}}jodofenil)- 3-(4-nitrofenol)-5-feniltetrazolijev klorid (INT)). Po mešanju smo dodali 0,25 mL ksantin oksidaze (80 U/L) in reagirali pri sobni temperaturi 30 s. Absorbanca je bila izmerjena pri 505 nm. Koncentracijo beljakovin v homogenatu testisov smo določili s kompletom Bio-Rad DC za testiranje beljakovin in izračunali njeno specifično aktivnost (U/mg beljakovin). Aktivnost katalaze (CAT) je bila določena v skladu s predhodno opisano metodo [15].

H&E (hematoksilin in eozin) barvanje

Testis smo 24 ur namakali v 10 % formalinu in shranili pri 4 ◦C. Tkiva so bila v mikro velikosti in pritrjena na stekelce. Po fiksaciji (95 % metanol + 5 % ocetna kislina) stekelca za 3 minute potopili v hematoksilin, 5 minut sprali s tekočo vodo in jih nato namočili s 50 %, 70 % in 90 % alkoholom za eno minuto. Po tem smo stekelca 10 s obarvali z eozinom in eno minuto namakali v 100 % alkoholu, dokler ni zbledel. Na koncu smo stekelce eno minuto namočili v ksilen. Kasneje je bilo predmetno stekelce posušeno na zraku in zapečateno. Obarvano epruveto smo postavili v mikroskop z invertnim faznim kontrastom (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokio, Japonska), da bi opazovali morfologijo.

Analiza hipotalamusa

Genska zaporedja mišjega KISS1, G-protein sklopljenega receptorja (GPR) 54, supresorja citokinskega signaliziranja 3 (SOCS-3) in sirtuina 1(SIRT1) so bila identificirana iz podatkovne baze genov NCBI (National Center for Biotechnology Information). in poseben primer je bil zasnovan z uporabo primerja 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, ZDA.). Primerji, uporabljeni v poskusu, so navedeni v tabeli 1.

Ekstrakcija ribonukleinske kisline (RNA) iz hipotalamusa. Ekstrakcija RNA iz hipotalamusa možganov je bila izvedena z uporabo RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Dobljene mRNA smo kvantitativno izmerili z reverzno transkripcijo (RT) in verižno reakcijo s polimerazo (PCR). DNA komplementa, pridobljena z analizo RT, je bila shranjena pri –20 ◦C za kasnejšo uporabo. Ekstrahirano DNA smo podvrgli analizi verižne reakcije s polimerazo (PCR) z uporabo polimeraze Taq. Nato smo vzeli 5~10 µL produkta PCR in ga analizirali z elektroforezo na 1,5 % koloidu agarja. Slika je bila posneta s slikovnim sistemom UVP BioDoc-It. Vzeli smo reverzno prepisano komplementarno deoksiribonukleinsko kislino (cDNA) in izvedli PCR z uporabo kompleta IQ SYBR Green Supermix. Kasneje so ga analizirali s programsko opremo optičnega sistema iQTM 5. Proteine ​​smo ekstrahirali z uporabo reagenta za ekstrakcijo proteinov (T-PER). Nato smo 20 mg homogenata testisov dodali 400 µL T-PER in centrifugirali (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Nemčija) pri 4 ◦C (125,000× g ) 20 minut. Naslednja metoda je bila podobna "analizi identifikacije in kvantifikacije beljakovin" v analizi in vitro.

2.3. Statistična analiza

Eksperimentalni rezultati so bili izraženi kot povprečje ± standardni odklon (povprečje ± SD), podatki pa so bili analizirani s programsko opremo Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, New York, NY, ZDA. Razlike med skupinama smo analizirali z enosmerno analizo variance (ANOVA). Več primerjav različnih skupin smo analizirali z Duncanovim testom pri vrednosti p < 0,05 kot značilni ravni.

3. Rezultati

3.1. Analiza in vitro

3.1.1. Primerjava antioksidativnih aktivnosti ECH, CTE in RES

Dolgoročno hvisok oksidativni stres in kronično vnetje sta glavna vzroka za sladkorno bolezenzapleti [16]. CTE vsebujejo različnefeniletanoidne glikozide, kot je ehinakozid(ECH) in akteozid, s potencialom antioksidativnega delovanja [17]. DPPH odstranjevanje radikalovje bil izveden test za oceno antioksidativne aktivnosti ECH. Trolox in resveratrol(3,5,4'-trihidroksistilben, RES) smo vzeli kot standard oziroma pozitivno kontrolo. Kot prikazanona sliki1, je ECH pokazal boljšo aktivnost lovljenja radikalov in aktivnost je bila znatno višjakot pri pozitivni kontroli (RES).

3.1.2. Viabilnost celic ECH na LC-540 in TM3 Leydigovih celicah

MTT test smo izvedli za oceno viabilnosti celic različnih koncentracij ECH. LC-540 Leydigove celice in TM3 Leydigove celice so po zdravljenju z ECH pokazale več kot 80 % viabilnosti (slika 2). V primerjavi z drugimi koncentracijami je koncentracija 100- µM (razredčine 100 µM v 2 % FBS) ECH pokazala boljšo viabilnost celic v celicah TM3 Leydig. Rezultat je pokazal, da povečana koncentracija ECH ne prispeva pomembnejše toksičnosti za celice.

3.1.3. Učinek ECH na s AGE inducirano proizvodnjo superoksida z NBT testom v LC-540 in TM3 Leydigovih celicah

AGE povzročajo oksidativno škodo v telesu zaradi oksidacije glukoze in tvorbe prostih radikalov, kot so O2-, hidroksilni radikali in karbonilne skupine [18]. Po stimulaciji s 50 ug/ml AGEs smo celice LC-540 (slika 3a) in TM3 (slika 3b) obdelali z ECH in RES (5 μM in 10 μM vsak). Rezultati so pokazali, da je bila proizvodnja superoksidnega aniona povečana v kontrolni skupini (stimulirani AGEs), vendar je bila proizvodnja superoksidnega aniona zmanjšana po kontrolni skupini (stimulirani AGEs), vendar se je proizvodnja superoksidnega aniona zmanjšala po proizvodnji superoksida in zaščitena celice pred oksidativnimi poškodbami. V primeru celic LC-540 je 10 µM ECH pokazal skoraj podobno aktivnost kot normalna skupina. Proizvodnja superoksida v obeh celicah se je zmanjšala s povečanjem koncentracije ECH in RES.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Vpliv ECH na produkcijo H2O2 v AGE-stimuliranih LC-540 Leydigovih celicah

Test DCFH-DA je bil izveden za odkrivanje prisotnosti oksidativnih vrst. Fluorescentno barvilo DCFH-DA po vstopu v celice oksidira znotrajcelični H2O2 in tvori diklorofluorescein (DCF). Kot je prikazano na sliki 4, je prišlo do znatnega povečanja znotrajcelične proizvodnje H2O2 v skupini, stimulirani z AGE (kontrola), medtem ko je dodatek 10 µM ECH in RES znatno zmanjšal proizvodnjo H2O2 v celicah. Dajanje 10 µM ECH je povzročilo samo približno 47,1 % proizvodnje H2O2, kar je bistveno manj kot v kontrolni skupini.

3.1.5. Vpliv ECH na ravni izražanja beljakovin RAGE in NF-κB v Leydigovih celicah LC-540, stimuliranih z AGE

Western blot analiza je bila izvedena za potrditev prisotnosti RAGE v LC-540 Leydigovih celicah. Učinek ECH na ravni ekspresije beljakovin RAGE (slika 5a) in NF-κB (slika 5b) v Leydigovih celicah, stimuliranih z AGE, je prikazan na sliki 5. Rezultati so pokazali, da je koncentracija 50 µg/ml AGE povzročila višje RAGE in NF- Izražanje κB v LC-540 Leydigovih celicah in 10 µM koncentracija ECH in RES sta bistveno zmanjšala izražanje RAGE in NF-κB. Ekspresija NF-κB je bila bistveno manjša pri RES in ECH kot pri antagonistih RAGE. Rezultati so torej potrdili, da je ECH zmanjšal stopnjo vnetja z znižanjem ravni RAGE in NF-κB.

3.1.6. Vpliv ECH na pot sinteze testosterona v AGE-stimuliranih LC-540 Leydigovih celicah.

Proces spermatogeneze in moške neplodnosti je odvisen od prisotnosti testosterona. Kot je prikazano na sliki 6, se je izražanje proteinov StAR (slika 6a), CYP11A1 (slika 6b), CYP17A1 (slika 6c) in HSD17 3 (slika 6d) znatno zmanjšalo v LC{{11, ki ga stimulira AGE }} Leydigove celice (kontrolna skupina). Izražanje proteinov StAR, CYP11A1, CYP17A1 in HSD17 3 se je znatno povečalo, ko so dodali antagonist RAGE, RES in ECH. Povečano izražanje proteinov StAR in CYP11A1 so opazili v skupinah, zdravljenih z ECH in RES. Stopnja izražanja CYP17A1 je bila skoraj podobna v skupinah RES in ECH. Ekspresije proteina HSD17 3 v Leydigovih celicah, obdelanih z ECH, so bile veliko višje kot v celicah, zdravljenih z antagonisti RES in RAGE. Povečano izražanje proteinov StAR, CYP11A1, CYP17A1 in HSD17 3 je kazalo na normalno proizvodnjo testosterona.