Vpliv teka II na rast in metastaze presajenega tumorja pri miših, ki nosijo raka dojke, in njegov mehanizem

Cilj:

Preučiti učinek zdravila Runing II (kitajski zeliščni pripravek za raka dojke) na rast in metastaze presajenih tumorjev raka dojke MA-891-miši, ki nosijo TA2, in njegov mehanizem. Metode: Za opazovanje učinka Runing II na rast in metastaze presajenega tumorja je bil razvit model celičnega seva MA-891 raka dojke s presajenim tumorjem miši TA2 z metastazami na pljučih. Imunohistokemična metoda in analiza slike sta bili sprejeti za odkrivanje ravni vaskularnega endotelnega rastnega faktorja (VEGF), receptorja vaskularnega endotelnega rastnega faktorja (VEGFR), števila mikrožil (MVC) in mikrožilne površine (MVA).

Rezultati: V skupini Running II je bila stopnja inhibicije tumorske mase in stopnja inhibicije metastaz v pljučih 37,3 odstotka oziroma 65,4 odstotka, rast tumorja in metastaze v pljučih sta bili očitno zavrti; Ravni VEGF in VEGFR, MVC in MVA so bile znatno znižane v primerjavi s tistimi v kontrolni skupini s tumorjem (P<0.05). Conclusion: The Chinese herbal preparation Running II can inhibit the metastasis of tumors by inhibiting angiogenesis, and the mechanism is possibly related to the down-regulation of VEGF and VEGFR expression.

Poleg tega smo ob istem času raziskave ugotovili, da ima ehinacea v Cistanchi protitumorski učinek. Za uporabo ehinakozida v protitumorskih zdravilih pričujoči izum najprej doda MTH1, anorgansko pirofosfatazo in dGTP v reakcijsko raztopino (100mM tris-ocetna kislina pH8,0, 40mM NaCl, 10mM magnezijev acetat, 0,005 odstotka Tween20 in 1mMDTT) Pri metodi sta bila encim in substrat inkubirana pri sobni temperaturi 1 uro in nato je bilo dodanih 25 ul raztopine malahitnega zelenega, da se reakcija prekine. Absorpcijo smo zaznali pri 630 nm z bralnikom mikroplošč BIO‑RAD iMark. Rezultati so pokazali, da ima ehinakozid pomemben zaviralni učinek na encimsko aktivnost MTH1; Drugič, učinek ehinakozida na tumorske celice na celični ravni je bil odkrit s testom MTT in rezultati so pokazali, da lahko ehinakozid znatno zavira rast celic raka debelega črevesa SW480 in celic človeškega osteosarkoma U2OS, in pričujoči izum zavira rast ehinakozida MTH1, specifičen encim, ki ohranja preživetje v tumorskih celicah, vodi do vključitve oksidiranih nukleotidov v DNK, kar povzroči smrtonosne dvoverižne prekinitve DNK v rakavih celicah in tako povzroči protitumorske učinke. Nova medicinska aplikacija bo postavila temelje za razvoj novih protitumorskih zdravil v prihodnosti.

Kliknite izdelek cistanche effects

Ključne besede:

tumor dojke; angiogeneza; vaskularni endotelijski rastni faktor (VEGF); Running II (kitajski zeliščni pripravek za raka dojke)

Rak dojke je maligni tumor, ki resno ogroža zdravje žensk in je po pojavnosti na prvem mestu med malignimi tumorji pri ženskah, s tendenco naraščanja iz leta v leto. Čeprav so njegove terapevtske metode nekoliko napredovale, se dolgoročna stopnja preživetja bolnic z rakom dojke ni povečala zaradi invazivne rasti in metastaz tumorjev. Angiogeneza tumorjev je osnovni pogoj za rast, invazijo in metastazo tumorjev.

Zato je zaviranje angiogeneze tumorjev učinkovit način za preprečevanje nastanka in razvoja tumorjev ter podaljšanje življenja bolnika.1 V pričujoči študiji je mehanizem kitajskega zdravila Running II s funkcijami dopolnjevanja qi in hranjenja yina, uravnavanje prehodnih in zanositvenih žil, razreševanje mase in razstrupljanje pri zaviranju tumorja in proti metastazam so preučevali na podlagi angiogeneze in njenih regulativnih dejavnikov v presajenem tumorju raka dojke MA-891 miši TA2 s pljučnimi metastazami.

MATERIALI

Šestdeset SPF samic miši TA2, težkih (20±2) g, starih 6-8 tednov, je bilo kupljenih na Oddelku za laboratorijske živali Univerze medicinskih znanosti Tianjin. Celični sev raka dojke MA-891 miši je zagotovil prof. Luo Liqin, patološki laboratorij, Inštitut za tumorje, Kitajska akademija medicinskih znanosti.

Runing II sestavljajo Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Yi Yi Ren ( Semen Coicis), Yin Yang Huo (Herba Epimedii), Dang Gui (Radix Angelicae Sinensis) itd., z razmerjem odmerkov 1,67 : 1,67 : 1,33 : 1,33 : 1,33 : 1,33 : 1,33 : 1, ki so bili pripravljeni kot prevretek z Farmacevtski oddelek, bolnišnica Longhua, v skladu s tradicionalno tehniko in shranjen na 4ć za uporabo; Ciklofosfamid (CTX, 200 mg/ampulo, številka podružnice: 981104) in tamoksifen (TAM) sta proizvedla Shanghai Hualian Pharmaceutical Co. Ltd.; Normalno fiziološko raztopino je proizvedlo podjetje Shanghai Fumin Pharmaceutical Co.

Poliklonsko protitelo vaskularnega endotelnega rastnega faktorja (VEGF) (delovne razredčitve 1:25–1:50), receptor vaskularnega endotelnega rastnega faktorja (VEGFR, delovne razredčitve 1:30–1:50) in poliklonsko protitelo FVIIIAg (delovna razredčitev 1:50). ) so bili kupljeni pri Santa Cruz Biotechnology Inc; Drugo protitelo EnVision, zajčje protitelo proti podganji VEGF, kozje protitelo proti kunčjemu FVIII Ag in kozje protitelo proti kunčjemu VEGFR ter EnVision Kit so bili kupljeni pri Dako Co., Danska; 3,3- Diaminobenzidin (DAB) je bil kupljen pri tovarni bioinženiringa Huamei v Šanghaju.

METODE

Razvijanje živalskega modela

Živalski model je bil razvit s sklepanjem na metode Luo in Gao et al.2,3. In vitro kultivirane celice MA-891 raka dojke miši v logaritemski fazi preživetja so bile izbrane in koncentracija celic je bila regulirana kot 1x107 /ml. V aseptičnih pogojih smo sesalske rakave celice inokulirali v podkožni del desne aksile TA2 miši (0,2 ml/miš, tj. 2X106 celic/miš).

Razvrščanje živali v skupine in načini dajanja

Dva dni po inokulaciji smo miši naključno razdelili v 4 skupine, po 15 miši v vsaki skupini. 1) Kontrolna skupina s tumorjem: 0.4 ml normalne fiziološke raztopine so dajali intragastrično, enkrat na dan, petkrat na teden. 2) Skupina Runing II: Runing II smo razredčili z navadno fiziološko raztopino in 0.4 ml te razredčine, kar ustreza 48 g·kg{{10}}·d-1, kar je bilo izračunano v skladu s priloženo tabelo "Pretvorbena tabela med površinami človeškega in živalskega telesa" v "Metodologiji študij o farmakologiji kitajskih zdravil"4 je bilo dano intragastrično, enkrat na dan, petkrat na teden. 3) Kontrolna skupina CTX: Približno odmerku, ki ga je uporabil Jiang Bo,5 je bil CTX razredčen z običajno fiziološko raztopino in 0.4 ml, kar ustreza 50 mg·kg-1·d-1 intragastrično, enkrat vsak drugi dan, trikrat na teden. 4) Kontrolna skupina TAM: TAM je bil razredčen z običajno fiziološko raztopino in 0,4 ml, kar ustreza 2,7 mg·kg-1·d-1, je bilo dano intragastrično, enkrat na dan, petkrat na teden. Zdravila so dajali 3 tedne v vseh štirih skupinah.

Vzorčenje

22. dan po dajanju smo miši žrtvovali z izpahom vratnih vretenc in stehtali. Nato smo vzeli in stehtali tumorsko maso in pljuča. Realna telesna teža miši=utežena telesna teža – teža tumorja. S prostim očesom smo prešteli sive vozle na površini pljuč, tj. žarišča metastaz. Tumorsko maso smo dali v 10-odstotno nevtralno raztopino formaldehida za fiksacijo, čemur je sledila vdelava v parafin, ultratanek rez, imunohistokemično dvostopenjsko napenjanje Envision in določitev VEGF, VEGFR, števila mikrožil (MVC) in površine mikrožil (MVA).

Stopnja zaviranja teže tumorja

Stopnja inhibicije tumorja=(srednja masa tumorja kontrolne skupine po zdravljenju – povprečna masa tumorja skupine z zdravili po zdravljenju)/srednja masa tumorja kontrolne skupine po zdravljenju × 100 odstotkov.

Stopnja inhibicije metastaz v pljučih

Stopnja inhibicije pljučnih metastaz=(povprečno število pljučnih metastaznih vozlišč kontrolne skupine – povprečno število pljučnih metastaznih vozlišč skupine zdravil)/povprečno število pljučnih metastaznih vozlišč kontrolne skupine x 100 odstotkov.

Imunohistokemijsko barvanje v dveh korakih

Vzeli smo parafinski odsek 4 μm, čemur je sledilo rutinsko deparafiniranje s ksilenom, gradientna dehidracija in izpiranje s PBS, 5 min x 3-krat; rez je bil potopljen v 0.01 mol/L, pH 6,0 citratni pufer, postavljen v mikrovalovno pečico pri 98° za 10 minut za popravilo antigenov in naravno ohlajen pri sobni temperaturi po odvzemu iz mikrovalovna pečica; kapljanje prvega protitelesa (zgoraj omenjeno protitelo oziroma razredčitev ustreznega protitelesa), 37ć, 90 min, izpiranje s PBS, 5 min x 3-krat; kapljanje drugega protitelesa Envasion, pri sobni temperaturi 60 min, izpiranje s PBS, 5 min x 3-krat; kapljanje novo pripravljene raztopine za razvijanje barve DAB, nadzor razvijajoče se barve 3–10 min pod mikroskopom, nasprotno barvanje 45 s s campeachyjem, izpiranje z vodo iz pipe, sušenje s puhalom, montaža z nevtralnim gumijem. Celica s citoplazmo rjavo-rumenih ali črno-rjavih zrnc je bila ocenjena kot pozitivna. Znani pozitivni del raka dojke je bil uporabljen kot pozitivna kontrola, tisti, v katerem je prvo protitelo nadomestil pufer PBS, pa je bil uporabljen kot negativna kontrola.

Analiza slike

Uporabljeni so bili video kamera ACE (ločljivost 930 vrstic) in slikovni analizator LEICAQ500W ter popolnoma avtomatski sistem za analizo slike LEICA. Pod mikroskopom x 200 sta bili v vsakem odseku naključno izbrani 2 vidni polji za določanje VEGF ali 3 vidna polja za določanje VEGFR in MVA, v vseh skupinah pa je bil izračunan odstotek pozitivne površine glede na celotno površino vidnega polja. . Za določitev MVC je bilo v vsakem odseku pod mikroskopom x 100 izbranih 5 regij z najbogatejšimi krvnimi žilami, nato pa so bile pod x 400 preštete mikrožile v vsakem vidnem polju 5 regij brez prekrivanja in uporabljena je bila povprečna vrednost kot povprečni števec mikrožil (MVC) tumorja.

Statistična metoda

Uporabljena je bila programska oprema SPSS8.0 in za primerjavo med stopnjami je bil uporabljen hi-kvadrat test, za primerjavo povprečij pa t-test ali enosmerna ANOVA.

REZULTATI

Učinki Running II na zaviranje tumorjev in proti metastazam na presajenem tumorju raka dojke MA-891-miši TA2 z metastazami na pljučih

It was shown in Table 1 that the tumor weight inhibition rate was 37.3% in the Runing II group and 86.2% in the CTX control group, both tumor inhibition rates being >30 odstotkov, s pomembno razliko (oba P<0.05) as compared with both tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor-inhibiting effect. And there was a significant difference (P<0.05) between the Runing II group and the CTX control group in the tumor inhibition rate, indicating that the tumor-inhibiting effect of Runing II was lower than that of CTX. The lung metastasis inhibition rate was 65.4% in the Runing II group and 43.9% in the CTX control group, with significant difference (both P<0.05) as compared with a tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor metastasis-inhibiting action. And there was a significant difference between the Runing II group and the CTX control group (P<0.05) in the lung metastasis inhibition rate, suggesting that the anti-metastasis action of Runing II is superior to that of CTX.

Učinki Running II na izražanje VEGF in VEGFR v presajenem tumorju miši TA2, ki nosijo MA-891-

Kot je prikazano v tabeli 2, sta bila izražanja VEGF in VEGFR tako v skupini s tekom II kot v kontrolni skupini s CTX znatno nižja kot v kontrolni skupini s tumorjem (P<0.05), with a significant difference between the two. In the Running II group, the VEGF and VEGFR expressions were not significantly different from those in the CTX control group (P>0.05), je bila izraženost VEGF znatno nižja kot v kontrolni skupini TAM (P<0.05), and the VEGFR expression was similar to that in the TAM control group (P>0.05). In the CTX control group, the VEGF and VEGFR expression was lower than those in the TAM control group. In the TAM control group, the VEGF expressions were similar to that in the tumor-bearing control group (P>0.05), izražanje VEGFR pa je bilo nižje od tistega v kontrolni skupini s tumorjem (P<0.05).

Učinek Running II na MVA in MVC presajenega tumorja pri miših TA2, ki nosijo MA-891-

Kot je prikazano v tabeli 3, so bile ravni MVA in MVC pri presajenem raku v skupinah, ki so prejemale zdravila, bistveno nižje od tistih v kontrolni skupini s tumorjem (P<0.05); in the Running II group, the levels of MVA and MVC were significantly higher than those in the CTX control group (P<0.05), the level of MVC was lower than that in the TAM control group (P<0.05), and the MVA level was similar to that in the TAM control group (P>0.05).

DISKUSIJA

Tradicionalna kitajska medicina meni, da sta nastanek in razvoj tumorja posledica celovitih učinkov idiopatskih in empatičnih dejavnikov, vendar s poudarkom na prvih. V prejšnji klinični študiji sta prof. Lu in Tang ugotovila, da sta pomanjkanje vitalnega qi-ja v notranjosti in neskladje žil in žil glavni vzrok za nastanek tumorja, notranja invazija, premikanje in širjenje patogenov raka pa so glavni pogoji za rast in metastaze raka dojke.6 Zato pri zdravljenju zagovarjajo hranjenje vitalnega qi-ja in odstranjevanje mas. Running II je kitajska zeliščna formula, ki je povzeta skozi dolgoletno klinično prakso po načelu zdravljenja najprej krepitve odpornosti telesa in nato odpravljanja patogenih dejavnikov. V formuli so suverene sestavine Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), Yin Yang Huo (Herba Epimedii), z učinki dopolnjevanja qi in negovanja yina, uravnavanja glavnega krvnega obtoka in oploditvenih žil, kar je v skladu s pogosto opaženimi značilnostmi raka dojke, kot sta pomanjkanje qija in yina ter neskladje pretoka in oploditvenih žil. Klinično ta formula doseže očiten učinek podaljšanja časa preživetja, povečanja kakovosti življenja, stabilizacije žarišča tumorja in preprečevanja metastaz raka.

S to študijo je bil vzpostavljen model presajenega tumorja raka dojke MA-891 celičnega seva miši TA2 z metastazami na pljučih in opazovan učinek Running II na rast solidnega tumorja in metastaz na pljučih ter ugotovljeno, da obstajajo pomembne razlike v tumorju stopnja inhibicije in stopnja inhibicije metastaz v pljučih med skupino Running II in skupino s tumorjem ter med skupino Running II in kontrolno skupino CTX, kar kaže, da ima Running II očitne funkcije zaviranja rasti tumorja in preprečevanja metastaz. Poleg tega tamoksifen (TAM) nima očitne funkcije zaviranja rasti tumorja in preprečevanja metastaz v modelnih miših, kar je podobno rezultatu, da je rak dojke MA-891 sev celic ER in poročilo o neposrednem delovanju nizke koncentracije TAM v tujini.7

Tumor je tipična bolezen, odvisna od krvnih žil, njegova rast, infiltracija in metastaze pa so odvisne od angiogeneze. Istočasno neovaskularizacija ponovno oskrbuje metastazni kanal za tumorske celice, kar ustvarja ugodne pogoje za rast, metastaziranje in širjenje tumorja. 8, 9 VEGF je proangiogenski faktor z najmočnejšim, edinstvenim in specifičnim delovanjem na vaskularne endotelne celice in številne tumorske celice lahko izločajo VEGF, ki poveča vaskularno permeabilnost in neposredno deluje na vaskularne endotelne celice prek vezave na receptor VEGF, spodbujanje njegove delitve in proliferacije, induciranje angiogeneze tumorja in vplivanje na število mikrožil, za spodbujanje rasti in metastaz tumorja.10,11 Večina tumorskih celic ima visoko ekspresijo VEGF, medtem ko je v normalnih tkivih le majhno število organov, kot npr. ledvice, jajčnik itd. imajo večjo ekspresijo VEGF. Zato nekateri znanstveniki menijo, da se VEGF lahko uporablja kot označevalec presnove tumorja in metastaz12 ter bolj idealen tarčni del za blokiranje neoangiogeneze v tumorjih,13 in poseganje v vaskularne regulativne dejavnike tumorjev in njegovo delujočo povezavo, uravnavanje izražanja faktorjev angiogeneze in zaviranje angiogeneze lahko nadzoruje rast in metastaze tumorja.

Rezultati v tej študiji kažejo, da lahko Runing II zmanjša izražanje VEGF in VEGFR, da morebiti blokira prevajanje signala migracije in proliferacije endotelijskih celic, ki jih povzroči VEGF, ter dodatno zavira angiogenezo v tumorjih, s čimer ima antineoplastične učinke in učinke proti metastazam. .

Prejšnje študije so pokazale, da je v poteku rasti malignih tumorjev prehitra rast tkiva neizogibno povzročila resno anoksijo lokalnega tkiva, anoksija pa bi lahko spodbudila sintezo mRNA VEGF in upočasnila razgradnjo mRNA VEGF, da bi povzročila nastanek veliko število lokalnih novih kapilarnih žil.14,15 Pri opazovanju imunohistokemično pozitivnih obarvanih celic so avtorji ugotovili očitno izražanje VEGF v citoplazmi umirajočih nekrotičnih tumorskih celic, nasprotno, manj ali nič izražanja VEGF v tumorskih celicah z aktivno proliferacijo , kar je lahko povezano z višjo stopnjo faktorja, ki povzroča anoksijo v tumorskih celicah, v skladu s poročilom Talks KL, et al.16 Running II vsebuje Dang Gui (ᔧᔦ Radix Angelicae Sinensis), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Sheng Yi Yi Ren (Semen Coicis), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae) itd., ki delujejo tako, da aktivirajo krvni obtok, razrešujejo sluz in odstranjujejo motnost. Zavirajo sintezo in izločanje VEGF, verjetno z izboljšanjem lokalne mikrocirkulacije tumorja, povečanjem oskrbe tumorskih celic s kisikom, s čimer zavirajo rast tumorja, da deluje proti metastazam.

REFERENCE

1. Folkman J. Angiogeneza in rak dojke. J Clin Oncol 1994; 12: 441-443.

2. Folkman J. Raziskave angiogeneze: od laboratorija do klinike. Forum (Genova) 1999; 9: 59-62.

3. Potgens AJ. Ekspresija faktorja vaskularne prepustnosti vpliva na tumorsko angiogenezo v linijah človeškega melanoma, ki so bile ksenotransplantirane golim mišim. Am J Pathol 1995; 5: 775-782.

4. Sauter ER, Nesbit M, Watson JC, et al. Vaskularni endotelijski rastni faktor je trg tumorske invazije in metastaz v ploščatoceličnih karcinomih glave in vratu. Clin Cancer Res 1999; 5: 775-782.

5.Warren RS, Yuan H, Matli MR, et al. Regulacija z vaskularnim endotelijskim rastnim faktorjem s hipoksijo. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

6. Levy AP, Levy NS, Goldberg MA. Posttranskripcijska regulacija vaskularnega endotelnega rastnega faktorja s hipoksijo. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

7.Talks KL, Turley H, Gatter KC, et al. Izražanje in porazdelitev faktorjev HIF-1 alfa in HIF-2 alfa, ki jih povzroči hipoksija, v normalnih človeških tkivih, rakih in makrofagih, povezanih s tumorji. Am J Pathol 2000; 157: 411-421.

For more information:1950477648nn@gmail.com