ABSTＲAKT

Cilj: razjasniti, ali je splošnocistanozidi(GCs) izboljšakognitivna disfunkcijahitro starajoče se miši (SAMP8) s posredovanjem specifičnih androgenih receptorjev (AＲ) vuravnavanje izražanja sinaptičnih proteinov． 

Metode: Skupaj 76 7-mesečnih samcev miši SAMP8 smo naključno razdelili v skupino modela, skupino GC, skupino GC + flutamid (F), skupino GC + fulvestrant (ICI), skupino F in skupino ICI． Učne in spominske funkcije miši v vsaki skupini so bile testirane z Morrisovim vodnim labirintom. Za testiranje sta bila uporabljena Western blotting in RT-PCRraven izražanja sinaptofizina( SYN), postsinaptična gostota － 95 (PSD － 95) in možganski nevrotrofični faktor (BDNF) miši v vsaki skupini．

Rezultati: GC so bistveno izboljšali učenje in kognitivno funkcijo miši SAMP8.

V primerjavi s skupino GCs je bila funkcija učenja in spomina miši v skupini GCs + F in skupini GCs + ICI znatno zmanjšana. Rezultati Western blottinga in RT-PCR so pokazali, da je bila stopnja ekspresije BDNF, SYN in PSD－95 znatno povečana na ravni beljakovin in ravni genov v skupini GC v primerjavi z modelno skupino (P ＜ 0． {{ 11}}5) . Raven ekspresije SYN je bila povečana v skupini GCs + F in GCs + ICI, ravni ekspresije BDNF in PSD － 95 pa so se znatno zmanjšale v skupini GCs + F in GCs + ICI v primerjavi s skupino GCs (P ＜ 0． 05) .

Zaključek: GC lahko posebej posredujejo AＲ za povečanje sinaptične plastičnosti pri miših SAMP8, kar posledično izboljša učenje in kognitivno funkcijo．

KLJUČNE BESEDE:Splošni cistanozidi; androgeni receptor; Sinaptična plastičnost; SAMP8 miši

Cistanche dodatek Izboljšanje kognitivnih funkcij Prehransko dopolnilo PhGs75% Ech 30% Act 12%

Alzheimerjeva bolezen(AD) je pogostanevrološka degenerativna bolezen, za katerega je klinično značilno progresivno upadanje kognitivnih funkcij ter spremembe duševnega in psihološkega stanja [1]. Študije so pokazale, da so ravni testosterona pri moških bolnikih z AD znatno nižje kot pri normalnih moških.

Zakognitivne funkcije bolnikovse je po tem do različnih stopenj izboljšaloketonsko nadomestno zdravljenje[2], kar kaže, da je lahko s starostjo povezano znižanje ravni androgenov dejavnik tveganja za AD pri starejših moških.

Skupni glikozidi Cistanche deserticola (splošni cistanozidi, GC) so eden glavnih izvlečkov Cistanche deserticola, ki lahko izboljšajo učenje, povezano z AD, inkognitivna disfunkcija[3]. Poleg tega je dajanje GC z gavažo znatno povečalo raven testosterona pri živalih [4]. GC imajo tudi funkcijo spodbujanja janga in lahko delujejo

Androgenom podobni farmakodinamični učinki. Prejšnje študije so poročale, da lahko testosteron izboljša učenje in kognitivne funkcije modelnih živali AD, ta proces pa temelji na specifičnem androgenem receptorju (androgenski receptor, AR), posredovanem [5].

Dobro je znano, da je kognitivna disfunkcija pri bolnikih z AD tesno povezana s sinaptično plastičnostjo. Vendar pa specifični mehanizem, s katerim GC uravnavajo sinaptično plastičnost in s tem izboljšujejo učne in kognitivne funkcije, še vedno ni jasen. Namen te študije je bil raziskati, ali GC posredujejo specifične ARＲ, da vplivajo na sinaptično plastičnost in s tem izboljšajo učenje in kognitivne funkcije pri AD.

1 Materiali in metode

1. 1 Poskusne živali in oprema

Samci 3-mesečnih miši SAMP8 so bili kupljeni na Medicinski fakulteti Pekinške univerze (SCXK [Peking] 2016-0010) in so jih gojili, dokler niso bili stari 7 mesecev. Živali so bile v čistem okolju pri (24 ± 1) stopinjah in

Živalim je bila zagotovljena naravna osvetlitev, prost dostop do hrane in vode ter humanitarna oskrba v skladu z načeli 3R za uporabo poskusnih živali. To eksperimentalno študijo je odobril Odbor za etiko poskusnih živali medicinske fakultete Baotou (Baotou Medical College št. 20201102).

Glavni reagenti v poskusu so:Cistanche deserticola skupni glikozidi(GCs, Xi'an Ciyuan Biological Co., Ltd.); antagonist androgenih receptorjev-flutamid (Sigma Company, ZDA); antagonist estrogenskih receptorjev-fulvestrant (ICI 182780, ZDA) Med Chem Express); zajčje protitelo proti mišjem BDNF,

protitelo PSD-95, protitelo SYN, protitelo proti aktinu (Proteintech Company iz Združenih držav); raztopina za elektroforezo beljakovin, raztopina za prenos beljakovin, TEMED, akrilamidni pufer, amonijev persulfat, Tris (Beijing Solebao Technology Co., Ltd.); Komplet za sintezo cDNA, kvantitativno odkrivanje fluorescence Talent

Komplet reagentov (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.) itd. Glavna eksperimentalna oprema vključuje rezervoar za elektroforezo z navpično ploščo, aparat za elektroforezo, rezervoar za prenos, stresalnik za razbarvanje (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), sistem za slikovno analizo beljakovinskega gela (Shanghai Tanon Technology Co., Ltd.), instrument za kvantitativno PCR s fluorescenco v realnem času (ZDA Roche) itd.

1. 2 Združevanje in upravljanje

Dve miši sta naravno poginili med postopkom hranjenja, preostalih 78 miši pa smo naključno razdelili v modelno skupino, skupino GC, skupino GC + flutamid (F), skupino GC + fulvestrant (ICI), skupino F, ICI

Skupine po 13 živali. Razen modelne skupine, skupine F in skupine ICI so druge skupine 30 dni neprekinjeno prejemale GC v odmerku 50 mg/(kg·d).

Od 24. dne po dajanju GC sta skupini GC + flutamid (F) in skupini GC + fulvestrant (ICI) prejeli intraperitonealno injekcijo F (5 mg/kg/dan) 30 minut po dajanju GC. z gavažo. ), ICI (1 mg/kg/dan), neprekinjeno injiciranje 7 dni. Prilagodite koncentracijo odmerjanja, da zagotovite, da je največji volumen želodca miši 0,5 ml, 1-krat/dan.

1. 3 Morrisov vodni labirint

Miši so se na vodno okolje prilagodile en dan vnaprej. Morrisov vodni labirint je trajal 6 dni. Prvih 5 dni je bil preizkus pozicioniranja in navigacije. Miši so trenirali enkrat na dan v vsakem od štirih kvadrantov po 1 minuto. Vsak interval treninga je bil 15 minut, hkrati pa so se beležili tudi rekordi. Ubežna zakasnitev preskusa določanja položaja živali in navigacije; 6. dan odstranite platformo iz vode in izvedite test raziskovanja vesolja. Zabeležite število prehodov platforme in odstotek časa, porabljenega v ciljnem kvadrantu miške. ciljni kvadrant) in plavalna trajektorija prostorskega raziskovanja (plavalna trajektorija testa spatialprobe) in drugi indikatorji.

1. 4 Western blot detekcija

Ekspresija proteinov SYN, PSD-95 in BDNF, povezanih s sinapsami. Po Morrisovem vodnem labirintu so vse miši rutinsko anestezirali, jim odrezali glave, odstranili možgane in jim odstranili hipokampuse. Hipokampalno tkivo je bilo lizirano z beljakovinami, razdejano z ultrazvokom pri 4 stopinjah, 30 minut na ledu in centrifugirano pri 12,000 r/min 15 minut pri 4 stopinjah. Vzeli smo supernatant in izmerili koncentracijo beljakovin z metodo BCA. Po nalaganju proteina izvedite elektroforezo gela za zlaganje pri konstantni napetosti 80 V, elektroforezo gela za ločevanje pri konstantni napetosti 120 V in mokri prenos pri konstantnem pretoku 300 mA; odstranite PVDF membrano, jo blokirajte s 5 % posnetim mlekom 80 minut pri sobni temperaturi in trikrat operite membrano s TBST. 15 min/čas, primarno protitelo inkubiramo čez noč na stresalni mizi pri 4 stopinjah; naslednji dan je bila membrana 3-krat sprana s TBST.

15 min/čas je bilo sekundarno protitelo inkubirano pri sobni temperaturi 2 uri, nato je bilo izvedeno barvno razvijanje ECL in slikanje je bilo izvedeno s sistemom za kemiluminiscenčno slikanje. -aktin je bil uporabljen kot notranja referenca, vrednost optične gostote pasu pa je bila analizirana s programsko opremo Image J.

1. 5ＲRT－PCRＲDetekcija

Ekspresija mRNA za SYN, PSD-95 in BDNF je bila ekstrahirana iz celotne RNA hipokampalnega tkiva v skladu z metodo ekstrakcije Trizol, cDNA pa je bila ustvarjena po reverzni transkripciji. Za kvantitativno detekcijo relativne fluorescence je bil uporabljen komplet za kvantitativno detekcijo fluorescence Talent. Poskus je bil ponovljen trikrat in rezultati so bili pretvorjeni v 2 - ΔΔCT je bil analiziran. Primerje mišjega -aktina, SYN, PSD-95 in BDNF je zasnovalo podjetje Shanghai Sangon Company, zaporedja primerjev pa so prikazana v tabeli 1.

1. 6 Statistična analiza

Prek SPSS 25. 0 statistične programske opreme za obdelavo, programske opreme Graphpad Prism 8 je bila uporabljena za risanje statističnih grafov, enosmerna ANOVA pa je bila uporabljena za primerjavo parnih srednjih vrednosti več vzorcev. P < 0. 05 pomeni, da je razlika statistično pomembna.