Učinkovitost in mehanizmi spojine vlaken Angelica Sinensis Cistanche za lajšanje zaprtja

Povzetek:zaprtjeje razširjena bolezen, ki lahko znatno vpliva na kakovost življenja ljudi in poveča tveganje za nekatera s tem povezana obolenja. V tej študiji je bil mišji model akroničnega zaprtja vzpostavljen z uporabo loperamidijevega klorida. Miši so dajali vlakninsko spojino Angelica sinensis Cistanche, ki jo sestavljajo Dang Gui [Angelica sinensis (Oliv.) Diels],Rou Cong Rong (Cistanche deserticolaY.C.Ma), pšenične vlaknine in ksilan z nizko molekulsko maso pri visokih odmerkih (3,6 g·kg-1, 30kratnik priporočenega odmerka za človeka) in nizkih odmerkih (0,6 g·kg{{8} }, 5-kratni priporočeni odmerek za ljudi) 14 dni. Študija je ocenila terapevtsko učinkovitost spojine z opazovanjem fekalne morfologije, merjenjem vsebnosti vode in izvajanjem poskusov gibljivosti tankega črevesa. Poleg tega so bili izvedeni encimski imunosorbentni testi (ELISA) za oceno serumskih ravni gastrointestinalnih hormonov, vključno z motilinom (MTL), gastrinom (GAS), vnetnimi dejavniki interlevkinom -1 (IL-1) in faktorjem tumorske nekroze - (TNF-). Histopatološka preiskava z barvanjem s H&E je bila uporabljena za oceno poškodbe tkiva debelega črevesa. Poleg tega so bili izvedeni Western blot in imunohistokemijski poskusi, da bi preučili ravni izražanja akvaporina-3 (AQP3) in c-Kit v debelem črevesu. Rezultati so pokazali, da lahko vlakninska spojina Angelica sinensis Cistanche izboljša fekalno morfologijo, poveča vsebnost fekalne vode in poveča hitrost tranzita skozi tanko črevo pri miših. Poleg tega je prišlo do pomembnega zvišanja serumskih ravni gastrointestinalnih hormonov in opaznega zmanjšanja ravni vnetnih dejavnikov. Izboljšanje histopatološke poškodbe debelega črevesa je spremljalo izrazito zmanjšanje izražanja proteina vodnega kanala debelega črevesa AQP3 in občutno povečanje izražanja c-Kit. Ti rezultati skupaj kažejo na prisotnost razmerja med odmerkom in odzivom. Te ugotovitve kažejo, da vlakna Angelicasinensis Cistanche Fiber Compound učinkovito lajšajo zaprtje pri miših. Njegovo delovanje je povezano z regulacijo proteina vodnega kanala debelega črevesa AQP3 in izražanja c-Kit, skupaj z modulacijo serumskih vnetnih dejavnikov in gastrointestinalnih hormonov. Ta poskus je odobril Odbor za etiko poskusov na živalih Univerze Jinan.

Ključne besede:zaprtje; mazanje črevesja in lajšanje zaprtja; funkcionalna hrana; debelo črevo; tradicionalna kitajska medicina

KAKO ČASA TRAJA, DA CISTANCHE ZAČNE DELOVATI?

zaprtjejepogosta bolezen prebavil. The global prevalence of constipation in the elderly (>60 let) je 18,9 %[1], razširjenost pa je pogosto večja pri ženskah[2]. Zanj so značilne težave pri defekaciji in pogosto zaprtje. zmanjšanje in strjevanje blata itd., kar vodi v fizično nelagodje in disfunkcijo prebavil ter celo povzroča ali poslabša bolezni prebavil, kardiovaskularne bolezni [3] itd., kar resno vpliva na kakovost življenja. Recepti tradicionalne kitajske medicine se pogosto uporabljajo za izboljšanje zaprtja in imajo dobre in jasne klinične učinke [4,5]. Vlakninska spojina Angelica in Cistanche deserticola, uporabljena v tej študiji, je pripravljena iz Cistanche deserticola, Angelice sinensis, pšeničnih vlaken in ksilooligosaharidov. Cistanche deserticola in Angelica sinensis sta dve pogosto uporabljeni tradicionalni kitajski medicini v odvajalih, ki učinkujeta na uravnavanje delovanja črevesja in izboljšanje zaprtja. [6-9], dve tradicionalni kitajski medicini imata enak izvor kot zdravila in hrana v moji državi. Z njuno kombinirano uporabo lahko dosežemo učinek obnavljanja qija in krvi ter harmoniziranja jina in janga. Pšenična vlakna so bogata z netopnimi in topnimi prehranskimi vlakninami, ki lahko spodbujajo črevesno peristaltiko in defekacijo ter se pogosto uporabljajo kot pomožno zdravilo za zdravljenje zaprtja; ksilo-oligosaharid je funkcionalni oligosaharid, ki lahko uravnava črevesno floro in s tem spodbuja črevesno peristaltiko. , povečati vlažnost blata [10], združiti štiri okuse in zdraviti glavni vzrok bolezni. Namen te študije je bil oceniti učinkovitost te vlakninske spojine angelike in cistanche deserticola na miših z zaprtjem in raziskati njen možni mehanizem delovanja.

Materiali in metode

Poskusne živali: 40 samcev miši Kunming, starih od 4 do 5 tednov, stopnje brez specifičnih patogenov (SPF), je bilo kupljenih pri Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., številka licence SCXK (Guangdong) 2021-0011, The temperatura okolice je 22 ± 2 stopinji, vlažnost je 50% ± 10%, dnevni in nočni cikel pa je 12 h/12 ​​h. Eksperimentalni protokoli in postopki so bili v skladu z etičnimi načeli uporabe in nege živali in jih je odobril Odbor za etiko poskusov na živalih Univerze Jinan.

Preizkušana snov: Pripravek vlaken Angelica sinensis in Cistanche deserticola je narejen iz Angelice sinensis in Cistanche deserticola, ki ju ekstrahiramo z vodo, koncentriramo, posušimo in zdrobimo, da dobimo suho pasto v prahu (izkoristek paste je 52,95 %). Prah suhe paste se zmeša s pšeničnimi vlakni in ksilo-oligosaharidom za kasnejšo uporabo. Angelica sinensis (številka serije 230404CP108) in Cistanche deserticola (številka serije 230303CP109) sta bili kupljeni pri Hebei Wanxiu Pharmaceutical Co., Ltd. in sta bili testirani v skladu z izdajo kitajske farmakopeje iz leta 2020. Ksilooligosaharidi so bili kupljeni pri Shandong Bailong Chuangyuan Biotechnology Co., Ltd. Številka serije je 20210829026, pregled pa je v skladu z GB/T35545; pšenična vlakna prihajajo od J. Rettenmaier & Söhne GmbH + Co KG, številka serije pa je 07501230126. Na podlagi 60 kg odrasle osebe je priporočeni odmerek spojine vlaken angelike in cistanche za ljudi 7,118 g·d-1 , od tega je odmerek pšeničnih vlaken 3,5 g·d-1. Združljivost te spojine je angelika: cistanche: pšenična vlakna: ksilooligosaharidi=2:2:3:2 (odmerek decoction kosov temelji na surovi drogi). Vzemite 30-kratni priporočeni odmerek za ljudi kot skupina z visokimi odmerki in 5-kratni priporočeni odmerek za ljudi kot skupina z nizkimi odmerki, oziroma 3,6 oziroma 0,6 g·kg-1·d-1. Pripravite suspenzijo s čisto vodo, dobro premešajte in odstavite.

Zdravila in reagenti Loperamidijev klorid (loperamid, LOP), specifikacije: Ena tableta vsebuje loperamidijev klorid

Amin 2 mg, 12 kapsul/škatlo, številka serije izdelka: MIJ3102, kupljeno pri Xi'an Janssen Pharmaceutical Co., Ltd.; Tablete Mosapride Citrate (Quali), specifikacije: Vsaka tableta vsebuje 5 mg Mosapride Citrate, 24 tablet/škatlo, številka serije izdelka: 25220603, kupljeno pri Lunan Beite Pharmaceutical Co., Ltd.; aktivno oglje v prahu, specifikacija: 200 mesh rjav prah, številka serije A805337, kupljen pri Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; arabski gumi, specifikacija: prašek, številka serije A108975, kupljen pri Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.

Absolutni etanol (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, 64-17-5); Amonijev persulfat (Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., A6295-500g); Tris-Base (FD2010), 5× nakladalni pufer (FD002), -aktinsko protitelo (FD0060), kozje protikunčje sekundarno protitelo (FDR007), kozje protimišje sekundarno protitelo (FDM007) in komplet za razvijanje barv ECL (FD8020) vsi so bili kupljeni pri Hangzhou Fude Biotechnology Co., Ltd.; RIPA lizni pufer (Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd., P0013B); 4% paraformaldehid (Biosharp Company, BL539A); Imunohistokemijski komplet (Jiangsu KGI Biotechnology Co., Ltd., KGOS60); komplet za kvantifikacijo beljakovin bicinhoninske kisline (BCA) (Thermo Fisher Scientific, SLZ60212); motilin (MTL), gastrin (GAS) in vnetni dejavniki interlevkin-1 (IL-1), faktor tumorske nekroze (faktor tumorske nekroze-, TNF-) ELISA komplet (Shanghai Enzyme Biotechnology Co., Ltd.) ., YJ201829, YJ037432, YJ002095, YJ301814); akvaporin 3 (akvaporin 3, AQP3) protitelo (Affinity Company, AF5222); c -Kit protitelo (tehnologija celične signalizacije, 3074S).

Instrument: vodomer za super čisto vodo (Millipore Company, ZDA, Milli Q); Elektronska tehtnica (Sartorius, Nemčija)

Podjetje, BS224S); Elektronska analitična tehtnica (Shanghai Benpu Instrument Technology Co., Ltd., FA2204N); Visokohitrostna hladilna centrifuga (Sigma Company, Nemčija, 3K15); Čitalec mikroplošč (Thermo Company, ZDA, Multiskan Mk 3); Parafinski mikrotom (Leica, Nemčija) Company, RM2255); Kovinska kopel s konstantno temperaturo (Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd., TU-100C); Popolnoma samodejni hitri mlinček vzorcev (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd., JXFSTPRP-24); Instrument za elektroforezo (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., DYY-6C); vrstični mikroskop (Precipoint Company, Precipoint M8); sistem za kemiluminescenčno slikanje (Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd., Tanon 5200).

Razvrščanje v skupine in vzpostavitev modela: 40 miši je bilo prilagojeno vzrejenih 5 dni in nato naključno razdeljenih v negativne kontrolne skupine.

(kontrola), modelna skupina (LOP), skupine z visokim in nizkim odmerkom spojin (LOP+PF-H, OP+PF-L), pozitivna kontrolna skupina (mosapridijev citrat, LOP+MOS). Vsak dan od 9 do 10 zjutraj so vse skupine razen negativne kontrolne skupine dobile 10 mg·kg-1 loperamidijevega klorida z gavažo, da bi vzpostavili model zaprtja pri miših, negativna kontrolna skupina pa je dobila enako količino čiste vode z gavažo. Od 14 do 15 ur sta skupini z visokim in nizkim odmerkom spojine dajali spojino 3,6 oziroma 0,6 g·kg-1, skupina s pozitivno kontrolo pa je dobila mosapridijev citrat (MOS) 5 mg·kg{{ 19}}.

, negativni kontrolni skupini in modelni kontrolni skupini sta 14 zaporednih dni dajali enake količine čiste vode z gavažo.

Status in značilnosti iztrebkov miši so opazovali in beležili med obdobjem intervencije z zdravilom. Zabeleženi so bili osnovni status in iztrebki miši v vsaki skupini.

Znaki, stehtajte 3-krat na teden in prilagodite odmerjanje. 3., 7., 10. in 14. dan po dajanju smo od vsake miši zbrali 3 do 4 pelete svežega blata, jih takoj stehtali in zabeležili kot mokro težo, posušili v pečici in zabeležili kot suho težo ter fekalno vlago vsebina je bila izračunana. Izračunajte vsebnost fekalne vlage (%)=(mokra teža − suha teža)/mokra teža × 100 %.

Določanje pogonske funkcije tankega črevesa je bilo izvedeno v skladu z eksperimentalnimi metodami, ki jih zahteva referenčna literatura [11] in »Metode za testiranje in vrednotenje funkcijskih funkcij zdrave hrane (2023 Edition)«. Po zadnjem odmerku so bile miši v vsaki skupini 16 ur tešče in brez vode. Modelna skupina, formula spojine. Skupinam z visokimi in nizkimi odmerki ter pozitivni kontrolni skupini je bila dana suspenzija loperamidijevega klorida (10 mg·kg-1) z gavažo, negativna kontrolna skupina pa je dobila enako količino čiste vode z gavažo. 0.5 h kasneje so skupini z visokim in nizkim odmerkom spojine ter pozitivni kontrolni skupini dali črnilo (ki je vsebovalo 5 %), ki je vsebovalo ustrezne odmerke testnega vzorca (3,6 g·kg-1, 0,6 g·kg-1, 5 mg·kg-1). (aktivno oglje v prahu, 10 % arabskega gumija) in enake količine črnila smo dali skupinam negativov in modelov. Živali so bile ubite takoj po 0,5 ure z izpahom materničnega vratu in izmerjeni sta bili "skupna dolžina tankega črevesa" in "dolžina napredovanja črnila". Izračunajte stopnjo pomika črnila=dolžina pomika črnila (cm)/skupna dolžina tankega črevesa (cm) × 100 %.

Za odkrivanje ravni MTL, GAS, TNF- in IL-1 v serumu je bila mišjim zrklom odvzeta kri, centrifugirana pri 4 stopinjah, 3 500 r·min-1 za 10 minut smo vzeli zgornji serum in določili MTL in GAS v mišjem serumu v skladu s kompletom ELISA. in ravni TNF-, IL-1.

H&E odkriva patološke spremembe v tkivu debelega črevesa. Debelo črevo miši speremo z navadno fiziološko raztopino in inkubiramo v 4 % paraformaldehidu.

Fiksirali so jih v aldehidu, rutinsko vdelali po 24 urah, razrezali, spekli in obarvali s H&E ter opazovali patološke spremembe tkiva debelega črevesa pod svetlobnim mikroskopom.

Za odkrivanje izražanja AQP3 in c-Kit v tkivu debelega črevesa smo uporabili imunohistokemijsko metodo. Zbrana so bila tkiva debelega črevesa miši iz vsake skupine.

Parafinski rezi, razvoskanje, hidracija, pridobivanje antigena, blokiranje endogene katalaze, blokiranje z 2 % kozjim serumom, dodajanje protiteles AQP3 oziroma c-Kit in inkubacija čez noč pri 4 stopinjah, fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom, PBS) 5 minut, protibarvanje s hematoksilinom, gradient dehidracija etanola, prosojnost ksilena, nevtralno tesnjenje dlesni, skeniranje pod vrstičnim mikroskopom in uporaba programske opreme Image J za analizo rezultatov.

Western blot metoda je bila uporabljena za odkrivanje izražanja AQP3 in c-Kit v tkivu debelega črevesa. Vzemite 10 mg zamrznjenega mišjega debelega črevesa in ga postavite v centrifugirno epruveto s 150 μL liznega pufra RIPA, ki vsebuje 1 % zaviralca proteaze. Za homogenizacijo tkiva uporabite hitri mlinček. , centrifugirajte homogenat z nizkotemperaturno centrifugo pri 10 000 r·min-1 10 minut, vzemite supernatant, določite koncentracijo beljakovin z metodo kvantifikacije beljakovin BCA, zmešajte z nakladalnim pufrom, denaturirajte beljakovine in analizirajte rezultate za vsak vzorec. Naložili smo 30 ug beljakovin, podvrgli elektroforezi SDS-PAGE, mokremu prenosu na membrano in nato blokirali s 5 % posnetim mlekom v prahu pri sobni temperaturi 1,5 ure, trikrat sprali s TBST, primarno protitelo postavili na stresalnik in inkubirali čez noč 4 stopinje, nato odstranimo in speremo s pufrom TBST. 3-krat speremo z raztopino, inkubiramo s sekundarnim protitelesom 1 uro pri sobni temperaturi in nato 3-krat speremo s TBST. Za razvijanje barv se uporablja kemiluminiscenčna delovna raztopina ECL, za razvijanje pa se uporablja popolnoma avtomatski sistem za kemiluminiscenčno slikanje. Za analizo rezultatov se uporablja programska oprema Image J.

Statistične metode Vsi podatki, vključeni v ta poskus, so izraženi v obliki povprečja ± standardni odklon. GraphPad Prism je bil uporabljen za risanje eksperimentalnih podatkov, primerjava med skupinami pa je bila izvedena z uporabo enosmerne ANOVA ali dvosmerne ANOVA; kadar so bile razlike med skupinami statistično značilne, je bila uporabljena metoda najmanj pomembne razlike (LSD). ) Naredite parne primerjave med skupinami in P < 0.05 velja za statistično pomembno razliko.