Elastin tvori elastični protein epidermalnih vezivnih tkiv s kolagenom

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Povzetek:Nov ksanton glikozid, 135,6-tetrahidroksiksanton-C-4-D-glukopiranozid je bil izoliran iz metanolnega ekstrakta listov Mangifera Indica (Anacardiaceae), ki rastejo v Egiptu. Struktura je bila pojasnjena z 1D in 2D-NMR spektroskopskimi podatki. Fizikalno-kemijske lastnosti spojine, kot so lipofilnost, topnost in formulacija, so bile predvidene s tehniko in silico ADMET z uporabo strežnika SwissADME. Ta tehnika je zagotovila Lipinskijevo pravilo petih, kot so absorpcija GIT, porazdelitev, metabolizem in prepustnost kože. In vitro so bile ocenjene zaviralne aktivnosti proti encimom, ki jih povzroča staranje, kot so kolagenaza, elastaza, hialuronidaza in tirozinaza. Spojina je pokazala izjemne učinke proti kolagenazi, anti-elastazi, anti-hialuronidazi in anti-tirozinazi z vrednostmi IC50 1,06, 419,10, 1,65 oziroma 0,48 ug/mL v primerjavi s pozitivno kontrolo. Spojina je pokazala obetavno predvideno topnost v vodi in razumno prodiranje skozi kožo, kar kaže na primernost spojine za lokalno formulacijo kot sredstvo proti staranju za kozmetične pripravke.

Ključne besede:ksanton; Mangifera indica; staranje; ceolagenaza; elastaza; tirozinaza; hialuronidaza; in silico ADMET

1. Uvod

Proces staranja je kompleksen biokemični proces, povezan z oksidativnim stresom, ki ga poganjajo endogeni kisikovi in ​​dušikovi prosti radikali, ki nastanejo med pričakovano življenjsko dobo in lahko prispevajo k napredovanju s starostjo povezanih manifestacij [1]. Patologije staranja kože, kot so gube, hiperpigmentacije, staračke pege, gube, melazma, pege, lentigo, efelidi, nevusi, porjavelost in melanom, potekajo z aktivacijo reaktivnih kisikovih vrst (ROS) [2]. Prosti radikali ali ROS lahko potencialno povzročijo spremembo v strukturni sestavi kožnih celic in poškodujejo celične membrane s spodbujanjem oksidacije lipidov in beljakovin, kar povzroči poškodbo DNK in celično smrt [3,4]. Poleg tega imajo ROS pomembno vlogo v procesu staranja kože, saj poškodujejo glavne kožne beljakovine, kot sta kolagen in elastin, z aktivacijo encimov kolagenaze in elastaze. Poleg tega prosti radikali povzročajo razgradnjo hialuronske kisline z aktivacijo hialuronidaz, kar vodi do nepravilne hidracije kože [5,6]. Predvidevanje teh dinamičnih procesov velja za ključno vprašanje za dermokozmetično področje in za odkrivanje novih zaščitnih formulacij je potrebnih precej raziskovalnega dela[7]. Antioksidanti so naravni obrambni encimi, ki so prisotni v koži in preprečujejo prekomerne količine prostih radikalov, ki nastajajo v telesu. Vendar pa lahko oksidativno ravnovesje poruši več dejavnikov, vključno s prehrano in onesnaženostjo zraka, ki povzročata oksidativni stres. Pri tem oksidativnem stresu je obremenitev telesa s prostimi radikali bistveno večja od naravnih antioksidantov. Zato je zelo pomembno, da uporabljamo zunanje antioksidante iz virov, kot so prehrana, kozmetika ali farmacevtski izdelki, da nevtraliziramo proste radikale in preprečimo proces staranja kože [5,8]. Sodobne študije so pokazale, da več naravnih sekundarnih presnovkov, predvsem flavonoidov in polifenolov, pomembno prispeva k skupni antioksidativni aktivnosti mnogih rastlin [9]. To je privedlo do zanimanja za raziskovanje antioksidativne aktivnosti številnih rastlin [10]. Poročali so, da je sadje bogato s temi fenoli in flavonoidi ter vitamini [11].

Za več informacij kliknite tukaj

Elastin tvori elastično beljakovino epidermalnih vezivnih tkiv s kolagenom in ima pomembno vlogo pri preprečevanju gubanja in čvrstosti kože[12]. Med staranjem celic se matrične metaloproteinaze, kot so kolagenaza, elastaza in hialuronidaza, povečajo [13]. Zatiranje teh encimov je ena najučinkovitejših terapevtskih strategij za obvladovanje poslabšanja stanja kože med staranjem [14]. Fenolne spojine rastlinskega izvora so bile opisane kot močni mediatorji beljenja zaradi svojih inhibitornih lastnosti tirozinaze [15] in nekatere (od njih bi lahko imele vlogo pri remodeliranju matriksa prek inhibitornega učinka na elastazo [16].

Mangifera indica L. je ena najpomembnejših užitnih rastlin, ki spada v družino Anacardiaceae in je razširjena v mnogih državah, zlasti v tropskih regijah [17]. Sadje manga ima že več kot 4000 let pomembno vlogo na kmetijskem, živilskem, farmacevtskem in prehranskem področju [18]. Poleg tega je plod manga po pridelavi in ​​pokritosti na drugem mestu med industrijskimi rastlinami, takoj za balano [19]. Različni deli Mangifera indica predstavljajo bogat vir različnih fitokonstituentov, vključno s flavonoidi, ksantonoidi, fenolnimi kislinami in triterpenoidi s potencialno vrednostjo kot funkcionalne molekule [18]. Poleg tega sadje oskrbuje človeško telo z vitalnimi sestavinami, kot so ogljikovi hidrati, beljakovine, maščobe, minerali, vitamini, esencialne aminokisline, karotenoidi, prehranske vlaknine in fenoli [20]. Tradicionalno so različne kulture poročale, da se je poparek iz listov uporabljal za več bolezni, kot so driska, krvava griža, anemija, astma, bronhitis, hipertenzija, nespečnost, revmatizem, prebavne motnje, hepatitis, tetanus, spontani splav in krvavitev [21]. Poleg tega so hlape gorečih listov vdihavali proti kolcanju in vnetju grla [18]. Lubje so uporabljali kot diuretik in v antirevmatičnih oblogah. Semena so znana pri zdravljenju prehladov, astme, driske in krvavitev. Poročali so o antioksidativnem delovanju, visoki vsebnosti skupnih fenolov (TPC), vsebnosti skupnih flavonoidov (TFC), lovilni aktivnosti 2,2-difenil-1-pikrilhidrazila (DPPH) in zmožnosti inhibicije linolne kisline delov rastline Mangifera indica [ 22].

Cistanche lahko upočasni staranje

Ta študija je bila zasnovana za raziskovanje in vitro inhibitornih lastnosti nove ksantonske spojine, pridobljene iz 70-odstotnega metanolnega ekstrakta listov Mangifera indica L., proti kolagenazi, elastazi, tirozinazi in hialuronidazi. Nadalje so bile farmakokinetične lastnosti, kot so absorpcija, porazdelitev, metabolizem in toksičnost (in silico napoved ADMET), izvedene z uporabo SwissADME in Lipinskega pravila petih za oceno topnosti zdravila, prepustnosti in potreb po formulaciji.

2. Rezultati in razprava

2.1. Razjasnitev strukture izolirane spojine

Spojino dobimo kot rumene kristale (18,29 mg). Kromatografska analiza je pokazala bledo-oranžno-rumeno liso na TLC pod dolgo UV svetlobo (365 nm) v sistemih topil DCM:MeOH (7:3) in BAW. Ko je bilo mesto obdelano z 1-odstotno metanolno raztopino železovega klorida, je postalo temno zeleno in rumeno z brizganjem raztopine amoniaka. 1H-NMR, APT in HMBC spektralni podatki spojine so zbrani v tabeli 1. 1H-NMR spektralna analiza (DMSO-dg, sobna temperatura) (sliki S1 in S2) je pokazala prisotnost dveh nizkopoljskih aromatskih dubletnih signalov pri oH 7,57 in 6,79 s sklopitveno konstanto 8,24 Hz, kar kaže na prisotnost dveh orto-sklopljenih protonov. Poleg tega je aromatsko območje H-NMR spektra pokazalo prisotnost singletnega signala pri Su 5,96, kar kaže na prisotnost enega samega protona v aromatskem obroču. Anomerni proton C-glukozilne enote je bil zaznan pri Su 4,60 ppm z vrednostjo sklopitvene konstante 7 Hz, dodeljene za -anomer. Ta vzorec aromatskih protonov v H-NMR spektru izolirane spojine je podoben ksantonski strukturi. Poleg tega je prisotnost -anomernega protona pri ou 4,60 z značilnimi kemijskimi premiki glukoze pri 3,21 do 4,60 lH-NMR (sladkorna regija) pokazala, da obstaja C-glikozidna povezava med sladkorjem in ksantonom. Kot je prikazano na sliki S3, je spekter APT spojine razkril prisotnost devetnajstih ogljikovih signalov, ki predstavljajo strukturo ksantona in C-glukozida.pregledi cistanche tubulosaPoskus APT je identificiral tri skupine CH (C-8,131,95; C-7,115,10;C-2, 95,35 ppm) v ksantonskem delu in anomernem C-1' C-glukoze pri SH75,13 ppm. Izvedli smo dvodimenzionalne poskuse NMR (HMBC; slika S4), da bi potrdili glikozidno povezavo C-glukoze pri C-4ksantona. Obilni korelacijski signali 2,3JCH log-območja so potrdili ogrodje ksantona z opaženimi navzkrižnimi vrhovi od H-1'(6) 4,60) do C-4(6c 104,13 ppm) in C-3 (6c 158,95).bioflavonoidi citrusovZa ksantonski del je bila zaznana tudi korelacija dolgega dosega 2,3JCH od H-2(8) do C-4(6c 104,13 ppm), C-3 (8c 158,95), in C-4b(6c 107,45). Poleg tega je bila zaznana 2-37-dolgotrajna korelacija od H-8(8)7,57) do karbonilne skupine C-9( 6c 195.14),C-8a(6c 131.22) in C-6 （6c161.87）. Za isti obroč aJcH signalizira od H-7（6μ 6.79） do C{ {39}}a（6c 131.22） so opazili. Te korelacije so ponazorjene v strukturi spojine na sliki 1. HSQC spojine je pokazal korelacije 1JcH med vsakim protonom in njegovim lociranim ogljikom, kot je prikazano na sliki S5. Eksperiment H,H COSY (slika S6) je razkril močno navzkrižno korelacijo vrhov med H-7 （δu 6,79）in H-8(8H7,57）). Nadalje je spojina pokazala psevdomolekularni ionski vrh [MH]- pri m/z 421, kar kaže na molekulsko formulo CgHngOrin v negativnem načinu analize ESI-MS (slika S7). Podatki iz 1H-NMR, APT, IH, H COSY, HMBC in HSQC so nas pripeljali do predpostavke, da bi bila spojina lahko 1,3,5,6-tetrahidroksiksanton-C-4- -D-glukopiranozid. To je bilo potrjeno s primerjavo s podatki NMR o izomangiferinu v literaturi [23, 24].

2.2. Predvidevanje farmakokinetike izolirane spojine In Silico

Spletni strežnik SwissADME je bil uporabljen za oceno zdravilne sposobnosti izolirane spojine z oceno Lipinskega pravila pet (RO5) za podobnost zdravilu [25]. Lipinski je poročal, da ima 90 odstotkov peroralno aktivnih zdravil, ki so dosegla klinični status faze II, MWT manj kot ali enako 500, logp manj kot ali enako 5, darovalci H-vezi manj kot ali enako 5 in akceptorji H-vezi manj kot ali enako 10[26]. SwissADME napoveduje dodatnih šest fizikalno-kemijskih parametrov, povezanih s podobnostjo zdravila, kot so lipofilnost [27], velikost, polarnost [28], topnost [29,30], prožnost in nasičenost [31,32] kot je prikazano na sliki 2 in tabeli 2.cistanche UKSWISSADME graf podobnosti izolirane spojine zdravilu je pokazal, da je večina fizikalno-kemijskih lastnosti spojine v želenem območju [33] razen števila akceptorjev H-vezi, donorjev H-vezi in polarnosti spojine od vrednost PSA je 201,28 A2 (zaželeno območje (med 20 in 130 A2)[28]. To visoko polarnost lahko pripišemo prisotnosti sladkornega dela. Izolirana spojina je pokazala obetavno predvideno topološko topološko topnost v vodi log S(Ali)[29 ] in Log S (ESOL) [30]. To bo olajšalo prihodnjo formulacijo te spojine. Predvidena farmakokinetika je pokazala, da ima spojina nizko predvideno absorpcijo GIT brez prepustnosti v BBB v skladu z modelom kuhanega jajca Dania [34], ki ga je sprejel spletni strežnik SwissADME[33].cistanche wirkungPoleg tega spojina ni pokazala zaviralnih učinkov na pet izooblik citokroma P450 (1A2, 2C19, 2C9, 2D6 in 3A4) [35], kar kaže na majhno možnost interakcij med zdravili. Predvideno prepustnost kože se izračuna z modelom večkratne linearne regresije, ki povezuje velikost molekule in lipofilnost s prepustnostjo kože [36]. Bolj ko je log Kp negativen (s Kp v cm/s), manj je molekula prepustna za kožo [33,36].izvleček cistanche tubulosaPredvideni dnevnik prepustnosti kože Kp v cm/s je -9,14 cm/s.

2.3. Ocena lastnosti proti staranju kože

2.3.1. Določanje aktivnosti proti kolagenazi in proti elastazi

Kolagen in elastin sta vitalna strukturna proteina povrhnjice, ki skupaj s hialuronsko kislino vzdržujeta elastičnost, tonus kapilar in moč kože [39]. Med procesom staranja oksidativni stres in prekomerna izpostavljenost UV svetlobi povzročita aktivacijo hidrolizirajočih encimov, kot so elastaza, kolagenaza in hialuronidaza, zaradi česar se izgubi moč in prožnost kože, pojavijo se gube[40] . Zaviranje aktivnosti kolagenaze in elastaze je ena od učinkovitih strategij za zaščito kože pred manifestacijami staranja kože [41]. Kot je pojasnjeno na sliki 3A, je spojina pokazala zmerno anti-kolagenazno lastnost z vrednostjo ICso 419,10 ug/mL v primerjavi s fenantrolinom （IC50=182.80ug/mL） kot standardom. Kar zadeva učinek zaviranja elastaze (slika 3B), je pokazal izjemen učinek z vrednostjo ICso 1,06 ug/mL, medtem ko je pozitivna kontrola, N-metoksisukcinil-Ala-Pro-Val-klorometil keton, dosegla vrednost ICso 0,63 ug /mL. V skladu s temi rezultati je predhodna študija poročala, da je metanolni ekstrakt listov manga 10-kratno močnejši zaviralec elastaze kot standardni tokoferol, pripisan nekonkurenčni zaviralni lastnosti mangiferina[42]. Poleg tega so prejšnja poročila dokazala antielastazno aktivnost polifenolnih spojin zaradi prisotnosti hidrofilnih skupin, kot sta hidroksilna ali karboksilna, ki lahko pozitivno vplivajo na kompetitivno zaviranje encimov [43].

2.3.2. Določanje aktivnosti proti hialuronidazi in antitirozinazi

Hialuronska kislina je prevladujoči glikozaminoglikan v koži, ki ohranja njeno vsebnost vlage [44]. Hialuronidaza ga encimsko hidrolizira, kar povzroči razpad celovitosti kožne strukture in motnje prepustnosti tkiva [45]. Zatiranje hialuronidaze ohranja celovitost kože, upočasni napredovanje staranja kože in ohranja hidracijo kože [13]. Prejšnje študije so pokazale, da bi lahko naravni zaviralci hialuronidaze dobro služili kot sredstva proti staranju pri razvoju izdelkov, povezanih z zdravjem kože [46]. Kot je prikazano na sliki 4A, lahko izolirana spojina izjemno oslabi aktivnost hialuronidaze z vrednostjo ICso 1,65 ug/mL v primerjavi s 6-O-palmitoil L-askorbinsko kislino kot pozitivno kontrolo （2,55 ug/mL）.

Med kliničnimi manifestacijami staranja kože lahko hiperpigmentacijo kože pospeši encim tirozinaza v prisotnosti reaktivnih kisikovih spojin (ROS) [46]. Tirozinaza, glikoprotein, ki vsebuje baker, igra ključno vlogo pri sintezi melanina s hidroksilacijo L-tirozina v 3,4-dihidroksifenilalanin (DOPA), čemur sledi oksidacija DOPA v DOPAkinon [47]. Zato zatiranje aktivnosti tirozinaze potencialno zmanjša hiperpigmentacijo kože [48]. S tega vidika je spojina potencialno zavirala tirozinazo z vrednostjo ICso 0.48 ug/mL v primerjavi s kojično kislino kot pozitivno kontrolo (0.82 ug/mL), kot je prikazano v Slika 4B. Prejšnja študija o ekstraktu semen Mangifera indica je pokazala izjemne rezultate proti tirozinazi in antihialuronidazi v korelaciji z vsebnostjo polifenolov [47]. Na molekularni ravni tako tirozin kot DOPA vsebujeta hidroksilne skupine, ki se izražajo kot bistveni donorji protonov za aktivacijo tirozinaze [49]. Podobno ima spojina v svojem skeletu štiri hidroksilne dele, ki se lahko obnašajo kot konkurenčni inhibitorji, tako da reagirajo kot substrati na tirozinazo.

3.Material in metode

3.1. Rastlinski material

Sveži listi Mangifera indica L.leaves so bili pridobljeni v fazi plodovanja iz zasebnega vrta na območju Abo-Zabal (N 30 stopinja 1743.5336"E 3128.254), vlada Qualiobya, Egipt, 20. julija 2021. Pristnost jih je prijazno potrdil Gospa Treize Labib, specialistka za taksonomijo v botaničnem vrtu El-Orman, Giza, Egipt Vzorci vavčerjev s kodo PHG-P-MI-362 so bili postavljeni v galerijo oddelka za farmakognozijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza Ain Shams.

3.2. Ekstrakcija in kromatografska izolacija

Na zraku posušene liste Mangifera indica L. (1,56 kg) smo 5 dni perkolirali v 70 odstotnem metanolu (27L) in nato filtrirali. Filtrat smo popolnoma uparili v vakuumu pri 47 stopinjah do suhega, da smo proizvedli posušen ostanek (90,36 g; 5,79 % m/m); izkoristek ekstrakcije je bil izračunan po naslednji enačbi: [skupna teža posušenega ekstrakta/skupna teža sveže rastline] × 100. Nato smo dobljeni ekstrakt nanesli na frakcioniranje Diaion HP-20. Uporabili smo gradientno elucijo (voda/metanol). Dobili smo pet glavnih frakcij: 100 odstotkov vode, 25 odstotkov metanola, 50 odstotkov metanola, 75 odstotkov metanola in 100 odstotkov metanola. 50-odstotno v metanolu topno frakcijo (26,38 g) smo izpostavili poliamidu in sprva eluirali s 100-odstotno vodo, nato pa gradientno eluirali z vodo/metanolom (od 100:0 do 0:100, w/o), da smo dobili šest podfrakcij: 100 odstotkov vode, 20 odstotkov, 40 odstotkov, 60 odstotkov, 80 odstotkov in 100 odstotkov metanola. Podfrakcijo, topno v 40 odstotkih metanola (2,36 g), smo nanesli na Sephadex LH-20 z uporabo MeOH (izokratsko eluiranje). Podobne frakcije smo združili in uparili, da smo dobili štiri glavne podfrakcije (A1-A4), podfrakcijo A3(0.86 g) smo nanesli na plošče za preparativno tankoplastno kromatografijo (TLC) z uporabo butanolocetne kisline:vode (BAW;4:1:5) kot razvijalca mobilne faze, da smo izolirali spojino kot svetlobo. rumeni amorfni prah.

3.3 Spektrometer za jedrsko magnetno resonanco (NMR).

Spektrometer Bruker Ascend 400/R (Burker Avance Ⅲ, Fallanden, Švica) je bil uporabljen v Centru za odkrivanje zdravil, raziskave in razvoj, Fakulteta za farmacijo, Univerza Ain Shams. 3.4.Masna spektrometrija

Za masno spektrometrično analizo je bil uporabljen masni spektrometer Finnigan LCQ-DECA (San Jose, CA, ZDA), povezan z detektorjem PDA. Vzorci so bili raztopljeni v HzO:MeOH kot zmes in vbrizgani neposredno v sistem HPLC/ESI-MS. Oba načina negativne in pozitivne ESI ionizacije sta bila uporabljena pod naslednjimi pogoji: plin za sušenje in razprševanje, N2; kapilarna temperatura, 250 stopinj; napetost pršenja, 4,48 kV; kapilarna napetost, 39,6 V; napetost cevne leče, 10.00 V; in način polnega skeniranja v masnem območju m/z 100-2000. Analiza ESI-MS za izolirano spojino je bila izvedena na masnem spektrometru Waters Xevo TQD z načinom UPLC Acquity (Milford, CT, ZDA) v Centru za odkrivanje zdravil, raziskave in razvoj, Fakulteta za farmacijo, Univerza Ain Shams.

3.5. Predvidevanje farmakokinetike v siliciju

Lipinskijevo pravilo petih fizikalno-kemijskih parametrov, kot so lipofilnost, topnost in farmakokinetične lastnosti, kot so absorpcija GIT, porazdelitev, metabolizem in prepustnost izolirane spojine v kožo, so bili izvedeni z uporabo spletnega strežnika SwissADME [36]. 3.6. Ocena lastnosti proti staranju kože

3.6.1. Določanje anti-kolagenazne aktivnosti

Inhibicijsko sposobnost izolirane spojine proti aktivnosti kolagenaze smo ocenili z uporabo fluorometričnega presejalnega kompleta za inhibitorje kolagenaze (BioVision, kataloška št. # K833-100) v skladu s prej opisano metodo [50]. Referenčna kontrola je bil (1,10)-fenantrolin. Za analizo smo testirano spojino in referenčno kontrolo pripravili v koncentracijah 1, 10, 100 in 1000 ug/mL. Testirano spojino smo pripravili v 96-plošči z vdolbinicami z ravnim dnom. Najprej je bil substrat kolagenaze raztopljen v pufru za testiranje kolagenaze (CAB). Vzorec za analizo smo pripravili z mešanjem spojine s kolagenazo in CAB. Priprava kontrolnih vzorcev inhibitorja je bila izvedena z mešanjem inhibitorja ((1,10)-fenantrolina (80 mM)) z razredčenim encimom kolagenazo in pufrom CAB. Encimsko kontrolo smo pripravili z mešanjem razredčene kolagenaze s CAB. CAB pufer smo uporabili kot kontrolo ozadja. Vse vzorce smo inkubirali pri sobni temperaturi 15 minut. Med tem časom smo pripravili reakcijsko zmes z mešanjem kolagenaze s CAB. V naslednjem koraku smo reakcijsko mešanico temeljito premešali s pripravljenimi vzorci. Fluorescenco smo takoj izmerili pri valovni dolžini vzbujanja 490 nm in valovni dolžini emisije 520 nm z uporabo bralnika mikroplošč (FilterMax F5, Thermo Fisher). Merjenje je potekalo v kinetičnem načinu pri 37 stopinjah 60 minut. Vzorci so bili pripravljeni v dvojniku in inhibitorni učinek testirane spojine na kolagenazo je bil izračunan z uporabo naslednje enačbe:

3.6.2. Določanje antielastazne aktivnosti

Protielastazno delovanje spojine je bilo raziskano z uporabo EnzChek§Elastase Assay Kit (E-12056) v skladu s predhodno opisano metodo [51]. Za analizo smo testirano spojino in referenčno kontrolo pripravili v koncentracijah 0.1, 10 in 100 ug/mL. Spojino smo pripravili v 96-ploščih z vdolbinicami s čistim dnom za fluorometrični test. Na kratko, raztopine encima elastaze, substrat elastaze in kontrola inhibitorja smo pripravili, kot je priporočeno. V jamice smo nato dodali razredčeno raztopino elastaze. Testirano spojino, kontrolo inhibitorja in encimsko kontrolo smo dodali v naslednje vdolbinice. Vzorci so bili mešani na stresalniku in nato inkubirani 5 minut pri 37 stopinjah. Testni pufer smo zmešali s substratom, da smo pripravili fluorometrično reakcijsko mešanico, ki smo jo nato dodali in temeljito premešali z vsakim vzorcem. Fluorescenca je bila takoj izmerjena pri valovni dolžini vzbujanja 400 nm in valovni dolžini emisije 505 nm z uporabo bralnika mikroplošč (FilterMax F5, Thermo Fisher, Waltham, MA, ZDA). Meritev je bila opravljena v kinetičnem načinu pri 37 stopinjah 30 minut, zaščitena pred svetlobo. Vsi testirani vzorci so bili pripravljeni in testirani v dvojniku in inhibitorni učinek testirane spojine na elastazo je bil izračunan z uporabo naslednje enačbe:

kje:

△RFU=sprememba relativnih enot fluorescence EC=encimska kontrola

3.6.3. Določanje aktivnosti proti tirozinazi

Inhibitorne aktivnosti olj so testirali proti kolagenazi s kompletom Abcam@Tyrosinase Inhibitor Screening Colorimetric Assay Kit (kataloška številka ab204715). Test je bil izveden v skladu s priloženim priročnikom. Standardni zaviralec tirozinaze je bila kojična kislina. Za analizo smo testirano spojino pripravili v koncentracijah od 0,1 do 10 ug/mL. Približno 2 uL priložene tirozinaze smo zmešali z 48 uL pufra za testiranje tirozinaze. Vzorce eteričnih olj ali stojalo (20 uL) smo zmešali z mešanico encimov (50 μL) in inkubirali pri 25 stopinjah 10 minut. Nato smo v vdolbinice eteričnih olj in standarda dodali 30 μL raztopine substrata tirozinaze. Nato smo ploščo merili spektrofotometrično pri valovni dolžini 510 nm 30-60 min pri 25 stopinjah.

3.6.4. Določanje antihialuronidazne aktivnosti

Aktivnost hialuronidaze je bila ovrednotena spektrofotometrično z merjenjem količine N-acetilglukozamina, ki nastane iz natrijevega hialuronata [52]. Za analizo smo testirano spojino in referenčno kontrolo pripravili v koncentracijah od 0.1 do 10 ug/mL. Petdeset mikrolitrov goveje hialuronidaze (7900 enot mL-1, (Sigma, St. Louis, MO, ZDA) raztopljene v 0,1 M acetatnem pufru （pH=3.5） smo zmešali s 100 μL določenega koncentracijo spojine, raztopljene v 5-odstotnem DMSO in nato 20 minut inkubirane v vodni kopeli pri 37 stopinjah. Kontrolno skupino smo namesto vzorca obdelali s 100 μL 5-odstotnega DMSO. Optično gostoto reakcijske zmesi smo izmerili pri 585 nm s spektrofotometrijo.

3.7. Statistična analiza

Vsi poskusi so bili izvedeni v treh izvodih. Podatki za ICso zaviralne aktivnosti encimov so bili statistično pregledani z uporabo enosmerne analize variance (ANOVA). Statistične analize so bile izvedene z uporabo GraphPad Prism 5.0. 4. Sklepi in prihodnje perspektive

Po naravnih izdelkih rastlinskega izvora je veliko povpraševanje na svetovnem trgu za razvoj novih sredstev za kozmecevtske modele [4]. V tej študiji je bila iz ekstrakta listov M. indica izolirana nova ksantonska spojina, 1.3.5,6-tetrahidroksiksanton-C-4- -D-glukopiranozid. Na podlagi testov zaviranja encimov bi ta spojina verjetno lahko pokazala dobre lastnosti proti kolagenazi, anti-elastazi, anti-hialuronidazi in anti-tirozinazi, s čimer bi zagotovila obsežen blažilni učinek proti encimom, povezanim s staranjem kože. Poleg tega fizikalno-kemijski parameter in silico in študija ADME podpirata njegovo vključitev v lokalne dozirne oblike, saj kaže obetavno topnost v vodi in razumno predvideno prodiranje skozi kožo. Zato bi to spojino lahko uporabili kot ugodno večnamensko bioaktivno sredstvo za prehranske in kozmecevtske formulacije. Kljub temu so toksikološke in klinične ocene potencialno obetavne.

Ta članek je izvleček iz Molecules 2022, 27, 2609. https://doi.org/10.3390/molecules27092609 https://www.mdpi.com/journal/molecules