Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol rešuje primanjkljaje AD z modulacijo aktivacije mikroglije, vendar ne oksidativnega stresa

Povzetek: Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) je bil izoliran iz za Tajvan značilne medicinske glive Antrodia camphorate, ki je znana po svoji krepitvi zdravja in proti učinki staranja v ljudski medicini. Alzheimerjeva bolezen (AD) je glavna bolezen, povezana s staranjem. Raziskali smo učinkovitost in potencialni mehanizem ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol za simptome AD. Drosophila s pan-nevronsko prekomerno ekspresijo človeškega amiloida- (A ) je bila uporabljena kot AD model. Primerjali smo življenjsko dobo, motorično funkcijo, učenje, spomin, oksidativni stres in biomarkerje aktivacije mikroglije in vnetja ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol- zdravljeni skupini tistim iz nezdravljene kontrole. Ergosta-7,9(11) je zdravljenje s 22-trien-3 -olom učinkovito izboljšalo življenjsko dobo, motorično funkcijo, učenje in spomin modela AD v primerjavi z neobdelano kontrolo. Biomarkerji aktivacije mikroglije in vnetja so se zmanjšali, medtem ko so vseprisotna lipidna peroksidacija, aktivnost katalaze in aktivnost superoksid dismutaze ostale nespremenjene. Skratka, ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol rešuje primanjkljaje AD z modulacijo aktivacije mikroglije, ne pa tudi oksidativnega stresa.

Glikozid cistanche lahko tudi poveča aktivnost SOD v srčnem in jetrnem tkivu ter znatno zmanjša vsebnost lipofuscina in MDA v vsakem tkivu, učinkovito lovi različne reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂ itd.) in ščiti pred povzročeno poškodbo DNK z OH-radikali. Cistanche feniletanoidni glikozidi imajo močno sposobnost lovljenja prostih radikalov, večjo redukcijsko sposobnost kot vitamin C, izboljšajo aktivnost SOD v suspenziji semenčic, zmanjšajo vsebnost MDA in imajo določen zaščitni učinek na delovanje membrane semenčic. Cistanche polisaharidi lahko povečajo aktivnost SOD in GSH-Px v eritrocitih in pljučnem tkivu eksperimentalno starajočih se miši, ki jih povzroča D-galaktoza, pa tudi zmanjšajo vsebnost MDA in kolagena v pljučih in plazmi ter povečajo vsebnost elastina. dober čistilni učinek na DPPH, podaljša čas hipoksije pri starajočih miših, izboljša aktivnost SOD v serumu in upočasni fiziološko degeneracijo pljuč pri eksperimentalno starajočih se miših. Pri celični morfološki degeneraciji so poskusi pokazali, da ima Cistanche dobro antioksidativno sposobnost in ima potencial, da postane zdravilo za preprečevanje in zdravljenje bolezni staranja kože. Hkrati ima ehinakozid v Cistanche pomembno sposobnost čiščenja prostih radikalov DPPH in ima sposobnost čiščenja reaktivnih kisikovih vrst ter preprečuje razgradnjo kolagena, ki jo povzročijo prosti radikali, ima pa tudi dober učinek popravljanja na poškodbe anionov prostih radikalov timina.

Kliknite na Prednosti tablet Cistanche

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ključne besede: Alzheimerjeva bolezen; Drosophila; EK100; ergosta-7,9(11),22-preizkušen-3 -ol

1. Uvod

Antrodia camphorata je medicinska gliva, edinstvena za Tajvan, in je bila pomemben gospodarski pridelek za tajvansko zunanjo trgovino v 19. stoletju [1]. Prva tajvanska zgodovinska knjiga, Tâi-uân Thong-sú (dobesedno Splošna zgodovina Tajvana), je zapisala avtohtone medicinske uporabe antrodia kamforata, vključno z odstranjevanjem patogenov, "izboljšanjem zdravja", "poživljanjem krvi", "razstrupljanjem alkohola", " zaščita jeter" in "proti staranju" [2–4]. Ker se zaradi staranja soočamo z zdravstvenim izzivom svetovnega prebivalstva [5], je znanstvena študija domače medicine za izkoriščanje znanja o boju proti staranju ključnega pomena.

Med glavnimi boleznimi, povezanimi s staranjem, kot so degeneracija makule, ateroskleroza, rak in možganska kap, je Alzheimerjeva bolezen (AD) trd oreh zaradi svojega izmuzljivega patološkega mehanizma. Učinkovito zdravljenje AD, ki bi spreminjalo bolezen, še vedno ni na voljo [6]. Trenutne patološke hipoteze AD vključujejo, vendar niso omejene na, zmanjšanje holin acetiltransferaze, ekscitotoksičnost glutamata, agregacijo amiloida beta (A), fosforilacijo tau, možgansko insulinsko rezistenco [7] in spremembe črevesnega mikrobioma [8]. Kljub temu sta ne glede na vrsto vpletenih vzrokov, ki sprožijo AD, oksidativni stres in vnetna aktivacija mikroglije pogosta znaka, ki spremljata nevrodegeneracijo AD [9,10]. Zanimivo je, da sta nevrovnetje in oksidativni stres medsebojno povezana dogodka, ki ju opazimo pri AD in domnevamo pri patologiji AD. Po eni strani senilni plaki odlaganja A sprožijo vnetne reakcije, aktivacijo mikroglije, sproščanje citokinov in astrocitozo, kar vodi do neželenih posledic, kot je progresivna nevronska poškodba in končno kognitivne disfunkcije. Aktivacija imunskih odzivov se lahko na začetku bori proti invazivnim patogenom z A ali odpravi prekomerne usedline A; vendar proces neizogibno proizvaja reaktivne kisikove spojine (ROS), ki lahko povzročijo poškodbe nevronov v mikrookolju. Po drugi strani pa lahko A povzroči ROS na način, neodvisen od vnetja. Na primer, A je bil najden v mitohondrijskih membranah AD postmortem in bi lahko vstopil v mitohondrije, kar je povzročilo prekinitev transportne verige elektronov (ETC) in povzročilo nastanek ROS. Povišan ROS lahko nato sproži sproščanje citokinov in sproži vnetje [7,9,10]. Zato so lahko antioksidativne in protivnetne molekule potencialni terapevtiki za AD.

Antrodia kamforat, zlasti ena od njegovih potopljenih spojin, izoliranih iz cele juhe, ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (znan tudi kot EK100), je pokazal močno antioksidativno in proti -vnetne aktivnosti [11–13]. Poleg tega Chang et al. [14] so pokazali, da antrokinonol, druga spojina, izolirana iz fermentiranega micelija antrodia kamforata, izboljša učenje in spomin v modelu AD miši z zmanjšano astrogliozo in oksidativnim stresom. Vendar pa vzročne povezave med zmanjšano astrogliozo in oksidativnim stresom po zdravljenju z antrokinonolom ni bilo mogoče potrditi, znižanje oksidativnega stresa pa je bilo domnevno posredujoči dejavnik [14]. Varnost EK100 je bila predhodno testirana v skladu s smernico 407 Organizacije za gospodarsko sodelovanje in razvoj (OECD) na modelu miši z 10 in 20 mg/kg na dan [15]. Zato smo v tej študiji sprejeli približno enake koncentracije prostega hranjenja za vinske mušice.

Model vinske mušice (Drosophila melanogaster) prekomerne ekspresije A 42 je dobro uveljavljen živalski model AD [16] z značilnimi simptomi AD, vključno s skrajšano življenjsko dobo, učnimi in motoričnimi pomanjkljivostmi [17], oksidativnim stresom [18] in aktivacijo mikroglije. [19]. Izzivi modeliranja AD pri Drosophili melanogaster ne vključujejo aktivnosti BACE pri Drosophili in razlike med spoloma, ki kažejo resnejše simptome pri moških datotekah. Teh pri AD pri ljudeh ni opaziti [20]. Zato smo za model AD sprejeli človeški peptid A 42, ki izraža muhe, kjer proizvodnja A 42 ne zahteva aktivnosti BACE. V tej študiji smo preizkusili, ali EK100 izboljša simptome AD, in kar je še pomembneje, ali sta modulacija oksidativnega stresa in astroglioze bistvena za izboljšanje AD.

2. Rezultati

2.1. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol rešeno preživetje in plezanje AD Drosophila

Diagnoza AD je povezana s skrajšanjem povprečne življenjske dobe [21] in skoraj polovica bolnikov z AD trpi zaradi motenj aktivnosti [22]. Zato smo preizkusili, ali izvleček Antrodia camphorata ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) izboljša preživetje in sposobnost plezanja Model AD Drosophila. Ugotovili smo, da je zdravljenje s 125 ali 250 µg/mL ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol znatno izboljšalo preživetje AD Drosophila (p < 0,01) (slika 1A in dodatna tabela S1), vendar je le visok odmerek (250 µg/mL) izboljšal plezanje AD Drosophila (slika 1B). Ker sta pomanjkanje preživetja in mobilnosti klinična simptoma AD, je bila v naslednjih preiskavah uporabljena koncentracija 250 µg/mL, ki je izboljšala oba simptoma.

2.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Rešeno učenje in enourni spomin AD Drosophila

Nato smo preizkusili, ali zdravljenje z ergosta{{0}},9(11),22-trien-3 -ol izboljšuje motnje učenja in spomina, značilnega simptoma AD. AD muhe so bile 14 dni zdravljene z ergosta- 7,9(11),22-trien-3 -ol pri 250 ug/mL in podvržene testom učenja in spomina z T-labirint. Kot je prikazano na sliki 2A, se je v primerjavi s kontrolo divjega tipa (AD(-)/EK(-)) učna sposobnost kontrole AD (AD(plus )/EK(−)) znatno zmanjšala (p <0,01), medtem ko Zdravljenje z ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol je značilno izboljšalo sposobnost učenja AD (p < 0,05). Poleg tega je zdravljenje z ergosta-7,9(11) 22-trien-3 -ol izboljšalo tudi zmanjšan enourni spomin na AD (slika 2B).

2.3. Ergosta-7,9(11),22-preskusil-3 -ol modulirano mikroglialno aktivacijo pri AD Drosophila

Nato smo preizkusili, ali zdravljenje z ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol zmanjša mikroglialno aktivacijo pri AD. Pri AD aktivirano mikroglijo spremljata fagocitoza in nevrodegeneracija [23]. Pri Drosophili je marker zajetja celic mikroglije in s tem marker aktivacije mikroglije izraz draperja (Drpr) in CED navzdol [24]. Po zdravljenju z ergosta-7,9(11),22-trien-3 -olom so muhe AD izločili in iz glave muh ekstrahirali RNA za RT-qPCR. Kot je prikazano na sliki 3A, sta bila oba Drpr pri AD Drosophili, zdravljeni z ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol, znatno znižana v primerjavi z neobdelanim AD. To pomeni, da je ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol zmanjšal mikroglialno aktivacijo pri AD Drosophila. Poleg tega je zdravljenje z ergosta-7,9(11) 22-trien-3 -ol zmanjšalo tudi vnetje osrednjega živčevja, kot se je pokazalo v znižani regulaciji genov, povezanih z vnetjem (slika 3B). .

2.4. Ergosta-7,9(11),22-preizkušen-3 -ol ni spremenil vseprisotnega oksidativnega stresa pri AD Drosophila

Nato smo preizkusili, ali je modulacija vseprisotnega – tj. celotnega telesa – oksidativnega stresa potrebna za ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol za rešitev AD. Zdravljenje z Ergosta-7,9(11),22-preizku- 3 -ol ni spremenilo peroksidacije lipidov (slika 4A), aktivnosti katalaze (slika 4B), aktivnosti superoksid dismutaze (slika 4C) , ali izražanje genov, povezanih z oksidativnim stresom (slika

3. Razprava

Ta študija poroča o učinkovitosti in možnem osnovnem mehanizmu ergosta-7,9(11),22- tries-3 -ol, izvlečka iz antrodia kamforata, za spremembo simptomov AD z uporabo Drosophila model s prekomerno ekspresijo humanega A. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol je učinkovito izboljšal učenje in spomin ter podaljšal življenjsko dobo bolnikov z AD. Poleg tega so bili zmanjšani biomarkerji aktivacije mikroglije in vnetja, medtem ko je vseprisotni oksidativni stres ostal nespremenjen.

Obstaja veliko virov oksidativnega stresa pri AD, vključno z, vendar ne omejeno na, aktivacijo prirojene imunosti - viri so na primer tudi kopičenje A, motnje mitohondrijev zaradi A, hiperfosforilirani tau in moten metabolizem kovin [25]. Čeprav se lahko vnetje in oksidativni stres vzajemno inducirata, lahko domnevamo, da se njune sinhrone spremembe pojavijo le v okoliščinah, v katerih drugi viri oksidativnega stresa ostanejo nespremenjeni. Vendar v tej študiji ni tako. Zmanjšanje prirojene imunosti, zlasti aktivacije mikroglije, hkrati oslabi njen prispevek k očistku A, kar lahko povzroči kopičenje A. Zanimivo je, da kopičenje samo sproži nastanek oksidativnega stresa na več načinov. Tako lahko EK1000, ki zmanjšuje mikroglialno aktivacijo in vnetne odzive, delno zaščiti nevrone pred neciljnimi imunskimi napadi, vendar bo plačal ceno oslabitve očistka A. Tako lahko rezultat te študije odraža omejitev strategije ciljanja na mikroglijo, vsaj v modelu AD Drosophila.

Prirojeni imunski sistem, posredovan z mikroglijo, je opisan kot dvorezen meč pri nevrodegenerativnih boleznih, zlasti AD [26, 27]. Aktivirana mikroglija poskuša odstraniti strupene patogene, kot je A, vendar neizogibno povzroči poškodbe nevronov v mikrookolju. Superiornost 250 µg/mL EK100 v 35 dneh lahko pomeni, da je strategija znižanja aktivacije mikroglije omejena na patološko stopnjo, vsaj v primeru modela AD vinske mušice. Poleg tega se znatno znižanje biomarkerjev za aktivacijo mikroglije in vnetni odziv ni uspelo prevesti v podobno pomembno izboljšanje preživetja, delovanje centralnega živčnega sistema pa bi lahko delno razložili s funkcijo dvoreznega meča mikroglije. To pomeni, da aktivacija mikroglije ni niti edini niti prevladujoči dejavnik napredka AD. Zmanjšana mikroglialna aktivacija pomeni tudi, da je bila razgradnja čezmerno izraženega A delno izključena v modelu vinske mušice, kar lahko pojasni tudi višjo smrtnost zaradi višje koncentracije EK100 med starostjo 35 in 52 dni.

Poročali so o učinkovitosti antrokinonola, še enega izvlečka iz antrodia kamforata, pri zdravljenju AD miši, za katerega je bilo znižanje oksidativnega stresa domnevno posredujoči dejavnik [14]. Zato lahko to pomeni, da antrokinonol in ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol izboljšata simptome AD po neodvisnih poteh, pri čemer posredujeta oksidativni stres ali ne. Zato bi bilo zanimivo preizkusiti, ali bi imelo sočasno zdravljenje z antrokinonolom in ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol sinergijski učinek na izboljšanje AD.

Za zgodnjo fazo AD je glavni poudarek načrtovanja zdravil odpravljanje odlaganja A (kot na primer pri nedavno odobrenem monoklonskem protitelesu adukanumabu [28], kljub njegovi kontroverznosti glede minimalnih kliničnih koristi in neučinkovitosti v enem od dveh kliničnih preskušanj III. faze). [29]), ali poskuša povečati mikroglialni privzem A [30–32]. Vendar pa pri zmernih ali napredovalih stopnjah AD čezmerna aktivacija mikroglije poslabša nevrodegeneracijo [33], zato so potrebne alternativne terapevtske strategije.

4. Materiali in metode

4.1. Vzdrževanje muh in merjenje življenjske dobe

Transgeni sev Drosophila H29.3/CyO je bil pridobljen iz [16] in je bil križan z w(CS10) šest generacij. Linija pannevralnega gonilnika elav-GAL4c155 je bila križana z w(CS10) šest generacij. Linija w1118 belih oči (Bloomington Drosophila Stock Center #3605), ki je bila 10-krat prekrižana s črto Canton S (Bloomington Drosophila Stock Center # 64349) (w (CS10)), je bila uporabljena kot standardna zaloga. Linija pannevralnega gonilnika elav-GAL4c155 je bila pridobljena iz Bloomington Drosophila Stock Center (#458). Genotip poskusnih muh – tj. modela AD – je bil [elav; H29.3/ plus ], ki je bil izbran iz F1 potomcev brez markerja CyO. Muhe so vzdrževali v standardnem mediju koruzne moke pri 25 ◦C v 12-urnem ciklu svetlo-tema. Za T-labirint, pojavni [elav; H29.3/ plus ] muhe so bile zbrane (oba spola mešane in ne device) in gojene z ali brez zdravljenja z EK100 do d14 po vzniku. Za preživetje, plezanje in RT-qPCR so bili uporabljeni samo samci muh. Vzorci RNA so bili zbrani pri d30 po vzniku, ko sta tako življenjska doba kot krivulje vzpenjanja pokazali znatno ločitev v primerjavi z neobdelanim modelom AD.

V analizi življenjske dobe je bilo dvajset do trideset muh vzgojenih v viali s hrano z ali brez CS; za vsako zdravljenje so bile pripravljene vsaj štiri viale. Viale s hrano smo zamenjali vsake 2 do 3 dni in takrat smo šteli mrtve muhe. Izvedene so bile vsaj tri ponovitve na poskus. Odstotek preživetja je opredeljen kot število živih muh deljeno s skupnim številom muh na začetku testa.

4.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (Ek100)

Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol je bil ekstrahiran iz prijaznega darila Antrodia camphorata, kot je opisano prej [34]. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol pri sobni temperaturi tvori prah svetlo rumene barve. Osnovna raztopina je bila pripravljena pri koncentraciji 6,25 mg/mL v EtOH tik pred uporabo. Za teste življenjske dobe in anti-geotaksije sta bili končni koncentraciji 125 in 250 µg/mL. Za teste učenja spomina in izražanja genov je bila končna koncentracija 250 µg/mL. Molekulska masa EK100 je 396,65. Torej so ustrezne molske koncentracije 315 oziroma 630 µM. Muhe smo zdravili z dvema odmerkoma EK100 s končnima koncentracijama 125 in 250 µg/mL, pomešanimi v hrano s hranjenjem Ad libitum. Kontrolna hrana je vsebovala enako količino topila EtOH kot poskusne skupine s končno koncentracijo EtOH 3 odstotke v/v. Zdravljenje se je začelo od pojava do časovne točke zbiranja podatkov vsakega testa. Za test preživetja in plezanja je bilo zdravljenje opravljeno skozi celotno življenjsko dobo. Število muh za vsako ponovitev je bilo opisano v razdelku metode vsakega testa. Preizkusili smo tudi teste življenjske dobe z zdravljenimi/nezdravljenimi divjimi muhami, da bi zagotovili varnost ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol v modelih muh (dodatna slika S1 ).

4.3. Testi antigeotaksije

Ta protokol temelji na predhodno objavljeni metodi [35] z nekaj spremembami. Na kratko, prozorna cilindrična plastična viala s premerom 2,5 cm in višino 9,5 cm (daljša bo v redu, vendar bo z njo težje rokovati) je bila uporabljena kot aparat za geotaksijo. Dno viale je bilo prevlečeno z eno plastjo hrane za muhe kot blazino. Na zunanjo površino viale je bila pritrjena oznaka 5 cm nad blazino. Drugi konec viale je bil odprt in od tam so bile naložene muhe. Ker je bil test opravljen sočasno s testom preživetja, je bilo število natovorjenih muh enako preživelim v tistem trenutku. Muhe so bile naložene v vialo; vrh je bil zaprt s pokrovčkom, dno viale pa je bilo večkrat (dve sekundi) udarjeno ob trdo površino, na kateri je stala (v tem primeru laboratorijska miza). Trkanje je bilo dovolj močno, da je muhe prestrašilo in splezalo po stenah viale, vendar ne tako močno, da bi jih fizično poškodovalo. Celoten proces je bil posnet na video 18 sekund, pri čemer je bilo zabeleženo število muh, ki so se povzpele nad oznako 5 cm in izraženo kot odstotek za vsako skupino. Štelo se je število muh, ki so splezale čez mejo 5 cm. Za vsako skupino so bile izvedene štiri ponovitve. Odstotek sposobnosti plezanja je opredeljen kot število muh, ki plezajo, deljeno s skupnim številom muh na začetku testa. Sposobnost plezanja je bila testirana tudi na zdravljenih/nezdravljenih divjih muhah, da bi zagotovili varnost ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol v modelih muh (dodatna slika S2) .

4.4. Platforma za učenje in spomin Drosophila (T-Maze)

Da bi opazovali učenje in spomin Drosophile, je bilo približno 100 muh najprej postavljenih v zgornjo komoro bakra, ki se lahko napaja z električno napetostjo in povzroči električni šok muham. Muhe so bile najprej dostavljene v vonju 1 (MCH) skupaj z električnimi udarnimi valovi. Nato so muhe dostavili vonj 2 (OCT) brez električnih udarnih valov. Po treningu so muhe premaknili v spodnji prostor, v katerem sta bili dve odprti strani oskrbljeni z vonjem 1 oziroma vonjem 2. Z opazovanjem smeri gibanja muh je mogoče oceniti pristranskost vonja 2 nad vonjem 1 z indeksom uspešnosti (PI), definiranim kot razlika v številu muh med dvema vonjema, deljeno s skupnim številom muh. Performance Index predstavlja sposobnost učenja in spomina Drosophila [36]. Druga skupina muh je bila kondicionirana z obrnjenimi pari vonjav, tako da je vsak vonj enkrat služil kot električni šok plus in enkrat kot električni šok −. PI teh dveh testov so bili povprečeni kot končni PI ene ponovitve. "1-urni spomin" je bil preizkušen po 1-urnem razmiku do treninga, medtem ko je bil "učenje" v nasprotju s tem testiran po 1,5-minutnem razmiku do treninga. Preizkusili smo tudi izogibanje MCH in OCT muh AD z ali brez zdravljenja z EK100, da bi zagotovili, da zdravljenje povzroči pristranskost proti odvratnim vonjavam (dodatna slika S3).

4.5. Kvantitativni PCR

Glave in telesa so bila ločena pred ekstrakcijo RNK. Za eno ponovitev so bile muhe anestezirane s CO2; zbrani po 100 naenkrat v Eppendorfovih epruvetah; nato pa jih za 1 minuto potopimo v tekoči dušik, da postanejo telesa krhka. Nastala zamrznjena trupla so bila nato naložena na sklade stresalnih sital (Bunsekifurui, št. 40 in št. 25) in premešana. Trupla so razpadla in bila razvrščena glede na velikost očes sita v dve ločeni frakciji: "glave" in "telesa". Celotna RNA je bila ekstrahirana s kompletom RNeasy Mini (Qiagen, Düsseldorf, Nemčija) in nato uporabljena za sintezo cDNA z VersoTM cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA). Stopnje ekspresije RNA preiskovanih genov so bile kvantificirane s PCR v realnem času (Applied Biosystems 7700, Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA) z Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA). Rezultati so bili normalizirani na relativno količino Gapdh ali Rpl32. Uporabljeni primerji so navedeni spodaj. Gapdh: 50 -GAAAAAGCGGCAGTCGTAAT-30 in 50 -AATTCCGATCTTCGACATGG-30 ; Drpr: 50 -TGTGATCATGGTTACGGAGGAC-30 in 50 -CAGCCGGGTGGGCAA-30 ; CED: 50 - CGTTTACAAGGAGCGACT-30 in 50 -TTCCCAGATTGAAGAGCAGG-30 ; Mačka: 50 -TGACT ACAAAAACTCCCAAACG-30 in 50 -TTGATTCCAATGGGTGCTC-30 ; PHGPx: 50 -TGACA TCGGCGAGGTGT-30 in 50 -CGGTCTGCTTGGCCTTTA-30 ; Cnc: 50 -GCCAACTATGGTGG TGGAGT-30 in 50 -ACGCTGCGATTCAGACG-30 ; SOD1: 50 -GTCGACGAGAATCGTCAC CT-30 in 50 -GGAGTCGGTGATGTTGACCT-30 ; SOD2: 50 -AAATTTCGCAAACTGCAAGG- 3 0 in 50 -GGTCGCCATTTGTTGCTATT-30 ; SOD3: 50 -TCAGCATGGGTGCTCACTAT-30 in 50 -TAATGCCCGTGGAGTTGG-30 ; mkk3: 50 -CCGCTACCCATACGACAAT-30 in 5 0 -GAATTCCGGCGAAAATGT-30 ; mekk1: 50 -TTTAACGGCAGTGGAACTGT-30 in 50 - TGCATCTGCAACTGCTCAC-30 ; imd: 50 -AGATCGACCAGGCCATAATC-30 in 50 -AATCC ACTGGAGCAACAGC-30 ; rac1: 50 -CCGTGTTCGACAACTACTCG-30 in 50 -AGTCGGTCG TAGTCCTCCTG-30 ; okus: 50 -GCCATACTCCCTTGGAATTG-30 in 50 -TCTCCCTCTCCG GATACAC-30 ; Rpl32: 50 -CGGATCGATATGCTAAGCTGT-30 in 50 -CGACGCACTCTGTTG TCG-3.

4.6. Testi oksidativnega stresa

Tri ponovitve lipidne peroksidacije, aktivnosti katalaze in aktivnosti superoksid dismutaze so bile izmerjene z BIOXYTECH LPO-586 (OxisResearch, OXIS International, Beverly Hills, CA, ZDA), kompletom za analizo katalaze (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). , ZDA) in komplet za testiranje superoksidne dismutaze (Cayman) po navodilih proizvajalca. Na kratko, aktivnost SOD je bila ocenjena z merjenjem dismutacije superoksidnih radikalov, ki jih je ustvarila ksantin oksidaza, dobavljena s kompletom, in je bila odkrita s pretvorbo tetrazolijeve soli v barvilo formazan, nato pa kvantificirana z absorbanco pri 440–460 nm. Aktivnost CAT je bila ocenjena z merjenjem tvorbe formaldehida iz metanola v prisotnosti H2O2, kataliziranega s CAT, zaznanega s kompletom dobavljenega kromogenega 4-amino-3- hidrazino-5-merkapto-1 ,2,4-triazol, nato kvantificirano z absorbanco pri 540 nm. Aktivnost lipidne peroksidacije je bila ocenjena z merjenjem razgradnje večkrat nenasičenih peroksidov maščobnih kislin v malonaldehid (MDA) in 4-hidroksialkenale, ki jih je zaznal komplet, dobavljen s kromogenim N-metil-2-fenilindolom, nato pa kvantificirano z absorbanco pri 586 nm. Za teste SOD, Cat in LPO je bilo število celih homogeniziranih muh vsake ponovitve 50, 50 oziroma 100.

4.7. Statistična analiza

Pomembnost razlike med krivuljami preživetja in krivuljami plezanja skupin, zdravljenih z ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol, in kontrolnih skupin je bila ocenjena z logaritmom ranga (Mantel– Cox) in Gehan–Breslow–Wilcoxonov test. Pomembnost razlike med indeksom uspešnosti učnega spomina pri skupinah, zdravljenih z ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol, in kontrolnih skupinah je bila ocenjena s Studentovim t-testom.

5. Sklepi

Preverili smo, da ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) iz kamfora Antrodia izboljša preživetje, učenje in spomin v modelu AD Drosophila z zmanjšanimi biomarkerji aktivacije mikroglije in vnetja. Poleg tega do spremembe simptomov ni prišlo zaradi vseprisotnega zmanjšanja oksidativnega stresa, kar pomeni, da ergosta-7,9(11) in 22-trien-3 -ol izboljšata simptome AD prek različnih poti do drugega Izvleček antrodia kamfora, antrokinonol. EK100 je učinkovito zmanjšal mikroglialno aktivacijo in vnetje, kar lahko pomaga odpraviti tipične kognitivne pomanjkljivosti, povezane z AD, kot so motnje učenja in spomina.

Dodatni materiali:Naslednje so na voljo na spletu. Slika S1: Preživetje divjih tipov muh, zdravljenih z EK100; Slika S2: Plezanje divjih tipov muh, zdravljenih z EK100; Slika S3: Izogibanje averzivnemu vonju muh AD, zdravljenih z EK100; Tabela S1: Statistika krivulj preživetja.

Avtorski prispevki:H.-PL, Y.-HK in W.-YL so načrtovali poskuse. Y.-HK je sodeloval pri pripravi EK100. JC, L.-ZC, M.-SC, L.-WS in T.-NC so izvedli poskuse. Pri pripravi rokopisa so sodelovali vsi avtorji. Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.

financiranje: To delo je bilo podprto s štipendijami Ministrstva za znanost in tehnologijo v Tajvanu (MOST 108-2320-B-039-031-MY3, MOST 109-2314-B-039-030, MOST 110-2314- B-039-009), Kitajska medicinska univerza in bolnišnica (CMU109-MF-85, CMU108-MF-68, CMU108-MF{{12 }}, CMU109- AWARD-02 in DMR-109-150) in iz programa Featured Areas Research Center v okviru projekta Higher Education Sprout Ministrstva za izobraževanje (MOE) v Tajvanu (CMRC-CHM-2-1).

Izjava institucionalnega revizijskega odbora:Se ne uporablja.

Izjava o informirani privolitvi:Se ne uporablja.

Izjava o razpoložljivosti podatkov:Podatki, uporabljeni v podporo ugotovitvam te študije, so vključeni v članek.

Nasprotja interesov:Y.-HK je eden od izumiteljev, ne pa tudi prejemnik patenta US-9757393-B2 z naslovom "Derivati ​​ergostatrien-3- -ola iz aniridia kamforata in njihova antiglikemična, antihiperlipidemična in zmanjšana uporaba maščobe v jetrih". Drugi avtorji izjavljajo, da nimajo konkurenčnih interesov. Financerji niso imeli nobene vloge pri načrtovanju študije; pri zbiranju, analizah ali interpretaciji podatkov; pri pisanju rokopisa ali pri odločitvi o objavi rezultatov.

Razpoložljivost vzorcev:Vzorci spojin so na voljo pri avtorjih.

Reference

1. Davidson, JW Otok Formosa, preteklost in sedanjost: zgodovina, ljudje, viri in komercialni obeti. Čaj, kafra, sladkor, zlato, premog, žveplo, varčne rastline in druge proizvodnje; Macmillan & Company: New York, NY, ZDA, 1903.

2. Caj, Z.; Liaw, S. Uporaba in učinek Ganoderme; Sheng-Yun Publishers, Inc.: Taichung, Tajvan, 1985; strani 116–117.

3. Chen, C.-J. Študija trdne kultivacije in bioaktivnosti Antrodia camphorata. Fung. Sci. 2001, 16, 65–72.

4. Geethangili, M.; Tzeng, Y.-M. Pregled farmakoloških učinkov Antrodia kamforata in njegovih bioaktivnih spojin. Dopolnilo na podlagi dokazov. Altern. med. 2011, 2011, 212641. [CrossRef] [PubMed]

5. Ogura, S.; Jakovljevic, MM Globalno staranje prebivalstva-zdravstvena oskrba, socialne in ekonomske posledice. Spredaj. Javno zdravje 2018, 6, 335. [CrossRef] [PubMed]

6. Cummings, J.; Lee, G.; Ritter, A.; Zhong, K. Razvoj zdravil za Alzheimerjevo bolezen: 2018. Alzheimerjeva dementnost. prevod Res. Clin. Interv. 2018, 4, 195–214. [CrossRef] [PubMed]

7. Šarma, P.; Srivastava, P.; Seth, A.; Tripathi, PN; Banerjee, AG; Shrivastava, SK Celovit pregled mehanizmov patogeneze, vključenih v Alzheimerjevo bolezen, in možnih terapevtskih strategij. Prog. Neurobiol. 2019, 174, 53–89. [CrossRef] [PubMed]

8. Sočocka, M.; Donskow-Łysoniewska, K.; Diniz, BS; Kurpaš, D.; Brzozowska, E.; Leszek, J. Spremembe črevesnega mikrobioma in patogeneza Alzheimerjeve bolezni, ki jo povzroča vnetje - kritični pregled. Mol. Neurobiol. 2019, 56, 1841–1851. [CrossRef]

9. Agostinho, P.; A Cunha, R.; Oliveira, C. Nevroinflamacija, oksidativni stres in patogeneza Alzheimerjeve bolezni. Curr. Pharm. des. 2010, 16, 2766–2778. [CrossRef]

10. Galaško, D.; Montine, TJ Biomarkerji oksidativne poškodbe in vnetja pri Alzheimerjevi bolezni. Biomark. med. 2010, 4, 27–36. [CrossRef]

11. Kuo, Y.-H.; Lin, T.-Y.; Ti, Y.-J.; Wen, K.-C.; Sung, P.-J.; Chiang, H.-M. Protivnetni in protifotoškodljivi učinki ergostatrien-3 -ola, izoliranega iz Antrodia camphorata, na koži miši brez dlak. Molecules 2016, 21, 1213. [CrossRef]

12. Chao, T.-Y.; Hsieh, C.-C.; Hsu, S.-M.; Wan, C.-H.; Lian, G.-T.; Tseng, Y.-H.; Kuo, Y.-H.; Hsieh, S.-C. Ergostatrien-3 -ol (EK100) iz Antrodia camphorata zmanjšuje oksidativni stres, vnetje in poškodbe jeter in vitro in in vivo. Prejšnji Nutr. Food Sci. 2021, 26, 58. [CrossRef]

13. Tsai, T.-C.; Tung, Y.-T.; Kuo, Y.-H.; Liao, J.-W.; Tsai, H.-C.; Chong, K.-Y.; Chen, H.-L.; Chen, C.-M. Protivnetni učinki Antrodia camphorata in njene aktivne spojine, Ergostatrien-3 -ol, v modelu ishemije mišje kože. FASEB J. 2015, 29, LB444.

14. Chang, W.-H.; Chen, MC; Cheng, IH Antroquinonol znižuje raven amiloida v možganih in izboljšuje prostorsko učenje in spomin v transgenskem mišjem modelu Alzheimerjeve bolezni. Sci. Rep. 2015, 5, 1–12. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, Y.-M.; Sung, H.-C.; Kuo, Y.-H.; Hsu, Y.-J.; Huang, C.-C.; Liang, H.-L. Učinki Ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol iz antrodia kamforata na biokemični profil in uspešnost vadbe miši. Molecules 2019, 24, 1225. [CrossRef]

16. Finelli, A.; Kelkar, A.; Song, H.-J.; Yang, H.; Konsolaki, M. Model za preučevanje Alzheimerjeve A 42-inducirane toksičnosti pri Drosophila melanogaster. Mol. Celica. Neurosci. 2004, 26, 365–375. [CrossRef] [PubMed]

17. Ping, Y.; Hahm, E.-T.; Waro, G.; Pesem, Q.; Vo-Ba, D.-A.; Licursi, A.; Bao, H.; Ganoe, L.; Finch, K.; Tsunoda, S. Povezovanje 42-povzročene hiperrazdražljivosti z nevrodegeneracijo, učnimi in motoričnimi pomanjkljivostmi ter krajšo življenjsko dobo v Alzheimerjevem modelu. PLoS Genet. 2015, 11, e1005025. [CrossRef] [PubMed]

18. Rival, T.; Page, RM; Čandraratna, DS; Sendall, TJ; Ryder, E.; Liu, B.; Lewis, H.; Rosahl, T.; Hider, R.; Camargo, L. Fentona, kemija in oksidativni stres posredujeta pri toksičnosti -amiloidnega peptida v modelu Alzheimerjeve bolezni Drosophila. EUR. J. Neurosci. 2009, 29, 1335–1347. [CrossRef]

19. Ray, A.; Speese, SD; Logan, MA Glial draper rešuje toksičnost A v modelu Alzheimerjeve bolezni Drosophila. J. Neurosci. 2017, 37, 11881–11893. [CrossRef]

20. Jeibmann, A.; Paulus, W. Drosophila melanogaster kot modelni organizem možganskih bolezni. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 407–440. [CrossRef] [PubMed]

21. Brookmeyer, R.; Corrada, MM; Curriero, FC; Kawas, C. Preživetje po diagnozi Alzheimerjeve bolezni. Arh. Nevrol. 2002, 59, 1764–1767. [CrossRef]

22. Lam, LC; Tang, W.; Leung, V.; Chiu, HF Vedenjski profil Alzheimerjeve bolezni pri starejših na Kitajskem – validacijska študija kitajske različice ocenjevalne lestvice vedenjske patologije Alzheimerjeve bolezni. Int. J. Geriatr. Psih. 2001, 16, 368–373. [CrossRef] [PubMed]

23. Schwab, C.; McGeer, PL Vnetni vidiki Alzheimerjeve bolezni in drugih nevrodegenerativnih motenj. J. Alzheimerjeva bolezen Dis. 2008, 13, 359–369. [CrossRef] [PubMed]

24. MacDonald, JM; Plaža, MG; Porpiglia, E.; Sheehan, AE; Watts, RJ; Freeman, MR. Receptor za zajetje trupla celice Drosophila Draper posreduje glialni očistek odrezanih aksonov. Neuron 2006, 50, 869–881. [CrossRef]

25. Chen, Z.; Zhong, C. Oksidativni stres pri Alzheimerjevi bolezni. Neurosci. Bik. 2014, 30, 271–281. [CrossRef]

26. Stankovič, ND; Teodorczyk, M.; Ploen, R.; Zipp, F.; Schmidt, MH Interakcije mikroglije in krvnih žil: dvorezen meč pri možganskih patologijah. Acta Neuropathol. 2016, 131, 347–363. [CrossRef]

27. Konishi, H.; Kiyama, H. Microglial TREM2/DAP12 signalizacija: dvorezen meč pri nevronskih boleznih. Spredaj. Celica. Neurosci. 2018, 12, 206. [CrossRef] [PubMed]

28. Sevigny, J.; Chiao, P.; Bussière, T.; Weinreb, PH; Williams, L.; Maier, M.; Dunstan, R.; Salloway, S.; Chen, T.; Ling, Y. Protitelo adukanumab zmanjša A plake pri Alzheimerjevi bolezni. Narava 2016, 537, 50–56. [CrossRef]

29. Lalli, G.; Schott, JM; Hardy, J.; De Strooper, B. Aducanumab: Nova faza v terapevtskem razvoju za Alzheimerjevo bolezen? EMBO Mol. med. 2021, 13, e14781.

30. Takata, K.; Kitamura, Y.; Saeki, M.; Terada, M.; Kagitani, S.; Kitamura, R.; Fujikawa, Y.; Maelicke, A.; Tomimoto, H.; Taniguchi, T. Amiloidni očistek, povzročen z galantaminom, posredovan s stimulacijo mikroglialnih nikotinskih acetilholinskih receptorjev. J. Biol. Chem. 2010, 285, 40180–40191. [CrossRef] [PubMed]

31. Mandrekar-Colucci, S.; Karlo, JC; Landreth, GE. Mehanizmi, ki so podlaga za očistek amiloida, ki ga- -posreduje hiter peroksisomski proliferator, in odpravo kognitivnih pomanjkljivosti v mišjem modelu Alzheimerjeve bolezni. J. Neurosci. 2012, 32, 10117–10128. [CrossRef]

32. McGeer, PL; McGeer, EG Usmerjanje mikroglije za zdravljenje Alzheimerjeve bolezni. Strokovno mnenje. Ther. Cilji 2015, 19, 497–506. [CrossRef] [PubMed]

33. Pesem, WM; Colonna, M. Identiteta in funkcija mikroglije pri nevrodegeneraciji. Nat. Immunol. 2018, 19, 1048–1058. [CrossRef] [PubMed]

34. Kuo, Y.-H.; Lin, C.-H.; Shih, C.-C. Ergostatrien-3 -ol iz Antrodia camphorata zavira sladkorno bolezen in hiperlipidemijo pri miših, zdravljenih z visoko vsebnostjo maščob, prek regulacije genov, povezanih z jetri, transporterja glukoze 4 in fosforilacije protein kinaze, ki jo aktivira AMP. J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 2479–2489. [CrossRef] [PubMed]

35. Le Bourg, E.; Lints, FA Hipergravitacija in staranje pri Drosophila melanogaster. 4. Plezalna dejavnost. Gerontologija 1992, 38, 59–64. [CrossRef]

36. Waddell, S.; Quinn, WG Muhe, geni in učenje. Ann. Rev. Neurosci. 2001, 24, 1283–1309. [CrossRef] [PubMed]

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】